siRNA治疗研究异彩纷呈(上)
在20世纪90年代，RNA干扰导致的基因沉默现象使科学家们感到困惑不解，但并未意识到它将对疾病治疗产生重大影响。在2001年证实了哺乳动物细胞也可产生RNA干扰之后，人们很快认识到，顺序特异的基因沉默的这种高度特异的机制可以用来开发一类新药，用来干扰致病基因或者疾病促发基因。短短几年工夫，有关的研究成果层出不穷，异彩纷呈，从体外筛选到给药途径，一系列研究成果纷纷浮出水面，令人应接不暇。美国Al鄄nylam生物制药公司资深研究主任AntonindeFougerolles博士在6月份的《自然综述药物发现》在线杂志发表文章，就开发RNA干扰相关治疗的进展进行综述。本版特选编部分译文，以飨读者。
——编者按
从2003年首次获得RNA干扰(RNAi)在动物疾病模型治疗有效的体内证据以来，药物开发的步伐已经加速。用于治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)和呼吸道合胞病毒(RSV)的RNAi药物三项I期试验已经完成。尽管这些药物研究进展给人们带来了希望，但是要把RNAi的潜在治疗效用转换成临床实际应用，则还需要克服现实中的种种困难。
, http://www.100md.com
■siRNAs治疗被看好
RNAi途径是通过小RNAs，包括小的干扰性RNA(siRNAs)和微小干扰RNA(miRNAs)引导的。基因沉默可以由siRNA通过信使RNA(mRNA)顺序特异性分裂诱导，而miRNAs对于有缺陷的补充靶标则介导翻译抑制和转录降解。在内生途径，含有茎环和短发夹结构的RNAs，在基因内区域或基因内区编码，在核子中进行处理，并作为前miRNA输出到细胞质。在细胞质，前miRNA经一种称为Dicer的RNAseIII酶进一步缩短和处理，以产生不完全匹配的双链miR鄄NA。Dicer能同样将长的完全匹配的dsRNA处理成siRNA。一种多酶复合物，包括Argonaute2和RNA诱导的沉默复合物(RISC)，偶联到miRNAduplex或siRNAduplex，并放弃一根链(一般认为在siRNA情况下正义链被分裂，而在miRNA情况下被释放)，以构成含有引导或反义链的激活的复合物。这种激活的AGO2-RISC复合物然后寻找并结合到具有补充顺序的mRNA链，并激活其表达。如果补充不太完全(例如与miRNA)，AGO2-RISC复合物会阻滞翻译。如果补充完全或接近完全(例如与siRNA)，那么这种复合物会在核苷之间分裂开mRNA链，补充到与5''-end有关的引导链的10-11核苷。除了翻译抑制以外，miRNA还可能介导称之为处理小体(P-bodies)的细胞质成分中mRNA的降解。由mRNA分裂引起的基因沉默通常认为是特别有力的，尤其是因为mRNA分裂导致RNA片段的迅速溶核降解，并释放激活的RISC复合物，以接触反应方式寻找和破坏另一个靶标mRNA。
, 百拇医药
RNAi治疗的目的是激活选择性的mRNA分裂，以产生基因沉默。合成的siRNA利用自然发生的RNAi途径，其作用方式一致并具可预测性，因此其作为治疗方法尤其引人注目。此外，因为它们较迟进入RNAi途径，所以siRNAs不太可能通过内生的miRNA干扰基因调节。因此，siRNAs是目前最被看好的一类RNAi治疗方法。
■体外筛选需考虑四因素
鉴定潜在引导siRNA备选物的最初步骤起于生物信息学设计和涉及体外研究，以确定基因沉默的效果，如果需要的话，还要检验不存在不利的脱靶效应，引入化学修改，以改善稳定性和特异性。在设计和筛选siRNA时，要考虑有效价，特异性好核酸酶稳定性和治疗考量这四个最重要的特征。
效价RNAi可以在哺乳动物细胞中通过引入模拟Dicer分裂的内生miR鄄NA的siRNAs被激活。siRNAs可以对沉默的任何基因进行鉴定，往往在纳摩尔或更低浓度具有体外活性。根据实验式试验确定的siRNAs的共同特性，预期有效的siRNAs的算法在互联网页上可以得到。虽然算法可以增加确定有活性siRNA的机会，但是不尽如人意，有时可能遗漏最重要的siRNAs，这可能只能通过实验性试验来确定。与采用算法作为确定备选siRNAs起点的另一种可供选择的方法是检验来自实验的mRNA编码区的所有平铺的21个核苷顺序，并且筛选一组在最低浓度诱导有效沉默的备选物。一项研究表明，作用时间稍微长久的siRNAs(在其组成RISC之前需要通过Dicer处理)可以用作Dicer底物，保持沉默活性，虽然这些更长久的siRNAs对于合成来说，更为复杂，对激活不利的免疫应答有增加的倾向。对于正义和反义siRNA链的RISC的装入不是对称的。在其5''-end最低紧密偶联的这种链优先偶联到RISC的深穴中，变成活性链。事实上，链筛选可以通过在二联链的末端进行单一核苷的置换以改变末端的相对偶联来进行。通过设计在优先偶联到RISC的预期激活链的5''-end不匹配的一个siRNA，可以提高鉴定有效价二联链的可能性。
, 百拇医药
特异性RNAi介导的基因表达的沉默可能具有高度特异性，正如筛选含有单一核苷多态性等位基因的沉默所证实的。不过，siRNAs也能识别和干扰与靶标mRNA共享部分同源性的mRNAs表达。在体外，除了预期靶向的基因以外，转录谱显示siRNAs可以改变脱靶基因的mRNA水平，但通常这种改变低于三倍。脱靶沉默的精确评价可能需要详细的蛋白质组学分析，以确定这些基因。目前用于蛋白质表达的无偏分析工具的研发较少，还无法应用于检测脱靶的沉默。一点也不奇怪，许多脱靶基因降低了含有对siRNA二联体二个链之一补充区域的mRNA水平。引导链的5''-end与mRNA之间的补充对于处于2-8位(从引导链的5''-end)或者所谓的内生靶标mRNAs的miRNA识别的‘种子区’具有至关重要核苷的脱靶沉默是关键性的。因此，将脱靶效应降到最低的一个途径是siRNA的仔细设计，将精确的种子配对最小化，虽然7个核苷的种子区域很短。另外，引导链中核糖的化学修饰可以抑制大多数的脱靶效应，同时保持靶标mRNA的沉默。尤其是在核苷2上单一的2''-O-甲基修饰，能抑制脱靶沉默，而不会明显妨碍靶向基因的沉默。因此，生物信息学的设计和与顺序无关的化学修饰，可以用于减少顺序相关的脱靶效应，同时保持有效的靶向mRNA沉默。
, 百拇医药
稳定性未经修饰的siRNAs在人血浆中会发生降解，半衰期为数分钟。为了将siRNAs转换成理想的药物，人们对能延长siRNAs的半衰期而不影响生物学活性的化学修饰进行了详尽的研究。这些努力的起点是已经应用于反义寡核苷酸和核酸适配体治疗的化学。例如，在3''-末端引入硫代磷酸酯(P=S)骨架联接能防止核酸外切酶降解，2''-糖的修饰(例如2''-O-甲基或2''-氟)能提供核酸内切酶抵抗。在维持RNAi沉默活性方面，核酸外切酶稳定性修饰的耐受性良好。为保护核酸内切酶而引入的内糖修饰通常也能耐受，但可能取决于双链体内修饰的部位;正义链比反义链对修饰的依从性更好。不过，采用简单的描述详细的修饰(例如P=S，2''-O-甲基和2''-氟)是可能的，在大多数情形下，在维持沉默活性的同时能稳定siRNA双链体。通过研究其在血浆中降解的片断，可以确定为稳定特殊siRNA双链体所需要的最小修饰，因此避免与某些寡核苷酸化学相关的毒性，使可能降低活性的变化最小化。
治疗指标在设计用于治疗目的的siRNAs时，除了发现有活性的靶标顺序以外，还要有其他方面的治疗指标。如果可能的话，能确定在安全和功效研究中应用的所有种类中交叉保存的靶标顺序，这样能够从实验研究到临床试验开发单一的药物备选物。研究人员在了解确定与体外活性和稳定的siRNA原因方面已经取得了很大的进展，但是在如何将这些促成因素转化成体内活性方面则所知甚少。我们有关siRNA特异性方面的知识都是根据体外数据获得的。此外，根据将siRNAs引入细胞和靶标细胞的mRNA表达类型所应用的转染方法，在组织培养中确定的脱靶基因范围可能明显不同。同样，通过某些siR鄄NAs对先天免疫应用的诱导是细胞型特异的。因为体内特性的不确定性，实用和谨慎的途径是确定适合今后经实验的siRNA双链库筛选的体内研究的一些引导备选的siRNAs，那些siRNA双链对于内源性核酸酶是最有效价，特异性和稳定性的，但是缺乏免疫刺激活性。
(余志平 编译), http://www.100md.com
——编者按
从2003年首次获得RNA干扰(RNAi)在动物疾病模型治疗有效的体内证据以来，药物开发的步伐已经加速。用于治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)和呼吸道合胞病毒(RSV)的RNAi药物三项I期试验已经完成。尽管这些药物研究进展给人们带来了希望，但是要把RNAi的潜在治疗效用转换成临床实际应用，则还需要克服现实中的种种困难。
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■siRNAs治疗被看好
RNAi途径是通过小RNAs，包括小的干扰性RNA(siRNAs)和微小干扰RNA(miRNAs)引导的。基因沉默可以由siRNA通过信使RNA(mRNA)顺序特异性分裂诱导，而miRNAs对于有缺陷的补充靶标则介导翻译抑制和转录降解。在内生途径，含有茎环和短发夹结构的RNAs，在基因内区域或基因内区编码，在核子中进行处理，并作为前miRNA输出到细胞质。在细胞质，前miRNA经一种称为Dicer的RNAseIII酶进一步缩短和处理，以产生不完全匹配的双链miR鄄NA。Dicer能同样将长的完全匹配的dsRNA处理成siRNA。一种多酶复合物，包括Argonaute2和RNA诱导的沉默复合物(RISC)，偶联到miRNAduplex或siRNAduplex，并放弃一根链(一般认为在siRNA情况下正义链被分裂，而在miRNA情况下被释放)，以构成含有引导或反义链的激活的复合物。这种激活的AGO2-RISC复合物然后寻找并结合到具有补充顺序的mRNA链，并激活其表达。如果补充不太完全(例如与miRNA)，AGO2-RISC复合物会阻滞翻译。如果补充完全或接近完全(例如与siRNA)，那么这种复合物会在核苷之间分裂开mRNA链，补充到与5''-end有关的引导链的10-11核苷。除了翻译抑制以外，miRNA还可能介导称之为处理小体(P-bodies)的细胞质成分中mRNA的降解。由mRNA分裂引起的基因沉默通常认为是特别有力的，尤其是因为mRNA分裂导致RNA片段的迅速溶核降解，并释放激活的RISC复合物，以接触反应方式寻找和破坏另一个靶标mRNA。
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RNAi治疗的目的是激活选择性的mRNA分裂，以产生基因沉默。合成的siRNA利用自然发生的RNAi途径，其作用方式一致并具可预测性，因此其作为治疗方法尤其引人注目。此外，因为它们较迟进入RNAi途径，所以siRNAs不太可能通过内生的miRNA干扰基因调节。因此，siRNAs是目前最被看好的一类RNAi治疗方法。
■体外筛选需考虑四因素
鉴定潜在引导siRNA备选物的最初步骤起于生物信息学设计和涉及体外研究，以确定基因沉默的效果，如果需要的话，还要检验不存在不利的脱靶效应，引入化学修改，以改善稳定性和特异性。在设计和筛选siRNA时，要考虑有效价，特异性好核酸酶稳定性和治疗考量这四个最重要的特征。
效价RNAi可以在哺乳动物细胞中通过引入模拟Dicer分裂的内生miR鄄NA的siRNAs被激活。siRNAs可以对沉默的任何基因进行鉴定，往往在纳摩尔或更低浓度具有体外活性。根据实验式试验确定的siRNAs的共同特性，预期有效的siRNAs的算法在互联网页上可以得到。虽然算法可以增加确定有活性siRNA的机会，但是不尽如人意，有时可能遗漏最重要的siRNAs，这可能只能通过实验性试验来确定。与采用算法作为确定备选siRNAs起点的另一种可供选择的方法是检验来自实验的mRNA编码区的所有平铺的21个核苷顺序，并且筛选一组在最低浓度诱导有效沉默的备选物。一项研究表明，作用时间稍微长久的siRNAs(在其组成RISC之前需要通过Dicer处理)可以用作Dicer底物，保持沉默活性，虽然这些更长久的siRNAs对于合成来说，更为复杂，对激活不利的免疫应答有增加的倾向。对于正义和反义siRNA链的RISC的装入不是对称的。在其5''-end最低紧密偶联的这种链优先偶联到RISC的深穴中，变成活性链。事实上，链筛选可以通过在二联链的末端进行单一核苷的置换以改变末端的相对偶联来进行。通过设计在优先偶联到RISC的预期激活链的5''-end不匹配的一个siRNA，可以提高鉴定有效价二联链的可能性。
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特异性RNAi介导的基因表达的沉默可能具有高度特异性，正如筛选含有单一核苷多态性等位基因的沉默所证实的。不过，siRNAs也能识别和干扰与靶标mRNA共享部分同源性的mRNAs表达。在体外，除了预期靶向的基因以外，转录谱显示siRNAs可以改变脱靶基因的mRNA水平，但通常这种改变低于三倍。脱靶沉默的精确评价可能需要详细的蛋白质组学分析，以确定这些基因。目前用于蛋白质表达的无偏分析工具的研发较少，还无法应用于检测脱靶的沉默。一点也不奇怪，许多脱靶基因降低了含有对siRNA二联体二个链之一补充区域的mRNA水平。引导链的5''-end与mRNA之间的补充对于处于2-8位(从引导链的5''-end)或者所谓的内生靶标mRNAs的miRNA识别的‘种子区’具有至关重要核苷的脱靶沉默是关键性的。因此，将脱靶效应降到最低的一个途径是siRNA的仔细设计，将精确的种子配对最小化，虽然7个核苷的种子区域很短。另外，引导链中核糖的化学修饰可以抑制大多数的脱靶效应，同时保持靶标mRNA的沉默。尤其是在核苷2上单一的2''-O-甲基修饰，能抑制脱靶沉默，而不会明显妨碍靶向基因的沉默。因此，生物信息学的设计和与顺序无关的化学修饰，可以用于减少顺序相关的脱靶效应，同时保持有效的靶向mRNA沉默。
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稳定性未经修饰的siRNAs在人血浆中会发生降解，半衰期为数分钟。为了将siRNAs转换成理想的药物，人们对能延长siRNAs的半衰期而不影响生物学活性的化学修饰进行了详尽的研究。这些努力的起点是已经应用于反义寡核苷酸和核酸适配体治疗的化学。例如，在3''-末端引入硫代磷酸酯(P=S)骨架联接能防止核酸外切酶降解，2''-糖的修饰(例如2''-O-甲基或2''-氟)能提供核酸内切酶抵抗。在维持RNAi沉默活性方面，核酸外切酶稳定性修饰的耐受性良好。为保护核酸内切酶而引入的内糖修饰通常也能耐受，但可能取决于双链体内修饰的部位;正义链比反义链对修饰的依从性更好。不过，采用简单的描述详细的修饰(例如P=S，2''-O-甲基和2''-氟)是可能的，在大多数情形下，在维持沉默活性的同时能稳定siRNA双链体。通过研究其在血浆中降解的片断，可以确定为稳定特殊siRNA双链体所需要的最小修饰，因此避免与某些寡核苷酸化学相关的毒性，使可能降低活性的变化最小化。
治疗指标在设计用于治疗目的的siRNAs时，除了发现有活性的靶标顺序以外，还要有其他方面的治疗指标。如果可能的话，能确定在安全和功效研究中应用的所有种类中交叉保存的靶标顺序，这样能够从实验研究到临床试验开发单一的药物备选物。研究人员在了解确定与体外活性和稳定的siRNA原因方面已经取得了很大的进展，但是在如何将这些促成因素转化成体内活性方面则所知甚少。我们有关siRNA特异性方面的知识都是根据体外数据获得的。此外，根据将siRNAs引入细胞和靶标细胞的mRNA表达类型所应用的转染方法，在组织培养中确定的脱靶基因范围可能明显不同。同样，通过某些siR鄄NAs对先天免疫应用的诱导是细胞型特异的。因为体内特性的不确定性，实用和谨慎的途径是确定适合今后经实验的siRNA双链库筛选的体内研究的一些引导备选的siRNAs，那些siRNA双链对于内源性核酸酶是最有效价，特异性和稳定性的，但是缺乏免疫刺激活性。
(余志平 编译), http://www.100md.com