siRNA治疗研究异彩纷呈(中)
有效运送是开发核糖核酸干扰(RNAi)作为广泛的治疗平台最具挑战性的障碍。动物实验采用的是无添加的剂型(裸siRNA)或作为共轭、脂质体/阳离子脂质体复合物或与肽、聚合物或抗体复合物的修饰小分子干扰核糖核酸(siRNA)。局部、直接运送siRNA在一些组织部位已经得到阐明，但siRNA经全身运送到机体深部的靶标组织仍然面临着挑战。
■裸siRNA
机体内成功应用RNAi的许多研究包括直接运送裸siRNA到眼、肺和中枢神经系统(CNS)。目前还不清楚，为什么某些细胞能直接将siRNA摄取到细胞质(RNAi发挥作用的部位)中，而有些细胞则不能。
眼睛运送siRNA对眼睛有效首次在眼新生血管和采用盐水和脂质调配的创疤动物模型中得到证实。脂质调配血管内皮生长因子(VEGF)siRNA能减少老年性黄斑变性(AMD)小白鼠模型中激光引起的脉络膜新生血管。在两种不同的小白鼠模型中，靶向VEGF受体1的盐水调配的siRNA玻璃体腔注射对减少眼新生血管的面积也有效。这些令人鼓舞的研究为靶向AMD的VEGF途径的siRNA临床试验奠定了基础。
呼吸道运送调配的siRNA经气管给药在肺中产生了有效的基因沉默，并且在许多肺疾病模型中取得疗效。在一项研究中，针对病毒基因的siRNA(未调配或与转染剂Transit-TKO联合)滴鼻减少了呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒的病毒载量(三个数量级以上)。在给予siRNA之后，RSV感染的其他病理特征例如白三烯水平升高、肺部炎症和呼吸窘迫的临床体征也减轻。这些研究证实了RNAi疗法用于治疗呼吸道病毒感染的潜力。
在设计确定与各种急性肺创伤(ALI)模型中肺损伤有关的关键分子研究方面，通过siRNA在肺的局部运送的基因沉默也得到了证实。靶向血红蛋白氧合酶1(HO1)siRNA鼻内给药使得缺血-再灌注(I-R)小白鼠模型的细胞凋亡增加，从而证实这种基因的引入具有保护性。当I-R诱导HO1在许多器官中的表达时，鼻内给予siRNA仅仅使肺内基因表达沉默。这些研究表明，裸siRNA直接滴鼻来沉默肺内的基因，具有治疗肺部疾病的潜力。
CNS注射siRNA盐水直接灌输也已用于CNS以证实体内的疾病靶标。用盐水调配的siRNA经脑室、蛛网膜下腔直接注射或脑实质内注入，能导致外周和中枢神经系统多个部位中特异的神经细胞mRNA靶标沉默。
■偶联
siRNA与靶标分子的共价偶联已经用于运送siRNA到细胞内，可以用于细胞型特异的靶标。偶联对于siR鄄NA类药物尤其引人注目，因为双倍体的链只有一条是活性的，偶联可以粘接到正义链或客链，而不会破坏激活的反义链的活性。到目前为止，已经采用亲脂性分子、蛋白质、肽和核酸适体生产出siRNA偶联物。
对与胆固醇的偶联，原用于运送反义寡核苷酸到肝脏，现在已经适合于经siRNA达到体内的有效部位。胆固醇偶联对于改善药物动力学和体内细胞的摄取是至关重要的。已有报告，通过将胆固醇siRNA偶联整合到循环脂蛋白颗粒中，能延长血液中的半衰期，这些颗粒对肾脏滤过有抵抗，可能也为血浆核酸酶提供保护。
其他的天然配体如穿膜肽已经直接偶联到siRNA双倍体上，显示出能促进运送的作用。从在理论上说，siRNA偶联到细胞数量有限的表面受体的小分子上，能提供药物的特异性，降低所需药物的浓度，但迄今为止，还未发表小分子siRNA偶联体内应用的证据。
siRNA也可偶联到RNA的核酸适体，以供运送到特殊的细胞类型之中。最近，体外和体内实验证明，核酸与前列腺特异性膜抗原(PSMA)组成PSMA核酸适体，可直接与siRNA偶联，在体外促进特异的细胞摄取和RNAi介导的靶标mRNA的沉默。在合成的技术与商业可行性范围之内，有可能设计出具有更长链(45~55个碱基)的siRNA的核酸适体，但是更长的分子在规模生产上可能更难以合成。
■脂质体与阳离子脂质体复合物
为siRNA的给药途径而开发的脂质体属于多种成分的纳米颗粒，通常由多种脂质组成，包括阳离子脂质体和/或膜融合脂质体、固醇和聚乙烯糖化脂。这些成分在脂质体的膜融合性和药物动力学特性方面都具有重要作用。
脂质体与阳离子脂质体复合物都已经广泛用于体外和体内运送siRNA。在体外，采用脂质性运送剂的siR鄄NA转染是常规的实验室方法；采用脂质体与阳离子脂质体复合物的siRNA局部和全身给药，也已被证实成功。静脉内注射封装在核酸-脂质颗粒(SNALP)的siRNA能明显沉默小白鼠和非人类灵长类动物的ApoB。重要的是，在猕猴中，单次静脉内每千克2.5毫克剂量的SNALP调配siRNA降低了肝脏中的Apo BmRNA达90%以上。因此，血清胆固醇和低密度脂蛋白分别降低65%和85%以上。含有肿瘤坏死因子(TNF)siRNA阳离子脂质体的静脉内注射能特异性抑制膝关节中TNF的产生，减轻小白鼠类风湿性关节炎模型的病情。采用脂质调配用于siRNA的全身运送，尤其是运送到肝脏，代表RNAi治疗研发最有希望的手段之一。而且，局部注射脂质体与阳离子脂质体复合物也能将siRNA有效地运送到眼和神经系统以及肿瘤的靶细胞。
此外，一个越来越重要的应用是阳离子脂质体复合的siRNA直接应用于阴道和肠道等黏膜。在致命性疱疹病毒感染之前和/之后给予时，针对单纯疱疹2型病毒的脂质复合的siRNA阴道内应用能保护小白鼠。阴道内应用脂质转染剂(Lipofectamine2000)复合siRNA，也能特异性沉默生殖道内生的基因。因为较易进入黏膜部位，而大量的病毒感染是通过黏膜途径进入机体的，脂质调配siRNA的黏膜给药将是未来RNAi治疗的一个富有成效的领域。
■肽与聚合物
通过与其负电荷磷酸架构的离子相互作用，以形成稳定的纳米颗粒，siRNA也可以与阳离子肽和聚合物复合。但需要一些策略以可重复的方式来防止聚合和控制颗粒大小，如通过整合聚乙二醇(PEG)来稳定颗粒，防止聚合。
用于核酸运送研究最广泛的聚合物之一是聚乙烯亚胺(PEI)。已有报告，在许多疾病模型中，PEI-siR鄄NA复合物在体内显示出治疗效果。PEI与流感siRNA复合在感染的小白鼠中也被证实有抗病毒作用。靶向多效生长因子、VEGF和人表皮生长因子受体2(HER2)的PEI-siRNA复合物已经显示出抗肿瘤活性。局部注射靶向N-甲基PEI-D-天冬氨酸盐(NMDA)受体亚单位NR2B的siRNA阳离子脂质体复合物，可明显减轻福尔马林引起的老鼠的下调疼痛。但采用PEI作为治疗运送载体的一个重要问题是较高剂量时所见的毒性很大。为此，一些小组正在对PEI的物理结构进行最优化，以改进体内siRNA的运送。
壳聚糖、环糊精和端胶原(经蛋白酶处理过的胶原质)纳米粒子以及基于聚酰胺(PAMAM)树枝状聚合物和乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒子，也正在作为siRNA运送的载体而被研究。
■抗体
抗体也可以用于siRNA的特殊定向运送。一种精蛋白抗体融合蛋白能将非共价结合siRNA运送到体外HIV封装表达B16黑色素瘤细胞或HIV感染的初期CD4T细胞，具有很高的效率。在这一途径，结合到寡核苷酸和HIV封装抗体Fab片断的精蛋白片断，能介导受体特异结合到表达HIV封装蛋白的细胞。这些siR鄄NA抗体精蛋白复合物，经肿瘤内或静脉内注射给药，能将siRNA特异性地运送到体内的皮下肿瘤，阻滞肿瘤生长。一种融合到精蛋白针对乳腺癌受体HER2的单链抗体也能有选择地把siRNA运送至携带这种受体的乳腺癌细胞。最近，采用黏合素LFA-1的构象敏感单链抗体，靶向所有人类白细胞或者仅是激活白细胞的融合蛋白，已经显示出这种定向策略在体外和体内具有卓越的选择性。
(余志平 编译)
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