三种技术助提青蒿素产量
青蒿素为世界卫生组织(WHO)推荐的治疗恶性疟疾的特效药。它虽然能够通过人工合成，但是由于相关方法成本高，难度和毒性大，所以未能投入工业化生产，目前主要还是从天然黄花蒿中提取。由于自然资源有限，人们试图通过各种栽培方法来提高青蒿素在黄花蒿中的积淀。最近，在以往的改善黄花蒿的生长环境，如光照条件、温热条件和施用微量元素及采用生长素、密植、引种等方式以外，研究的热点转向特殊的栽培、组织培养、转基因方式等生物技术。本文对这些方法进行了比较详尽的介绍，希望能使读者有所收获。
——编者按
■方法1：育苗栽培多次收割法
研究表明，叶是光合作用的器官，也是青蒿素主要的积累器官，其中含青蒿素的量较高，而茎中的量仅为叶的10%。在黄花蒿叶内，青蒿素约从3、4月份渐渐开始合成和积累，在5、6月开始升高，在8、9月达到顶峰。正在开花的植株中，叶中的青蒿素的含量约占总量的30%，冠状花序中约含40%的青蒿素，根中所含的青蒿素的量在整个生长过程中都较低。不过，冠状花序中由于瘦果油的出现导致青蒿素提取较困难。
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因此，在植株的生活力较强时，90%的青蒿素聚集在叶和优质茎中，是化学提取的最佳时期，必须恰当把握栽培及收割方式才能很好地提高青蒿素的产量。目前通常的做法是在得到较早的幼苗后进行大田移栽。除此之外，Kumars等提出多次收获法可以提高黄花蒿中青蒿素的产量，即3月上旬移栽，于6月中旬、8月上旬、9月中旬及11月中旬收割，共收割4次。据他们统计比较，采用这种方法所得的青蒿素产量达到了62千克/公顷，远远高于普遍的栽培收割法的25千克/公顷。
Kumars等指出，目前进行的大田实验中，所测得的各个性状的比例及相关分析说明了一个普遍存在的现象：收割多次的叶的总产量比1次或2次的高。这是因为间歇性的收割会促使植株的再生，产生新叶。这样，富含青蒿素的叶被及时收获，避免了青蒿素的流失及叶的脱落。这是因为，尽管黄花蒿是一年生植物，但其生长期长，具有健壮的根系、极其丰富的茎叶，枝叶排列有序，不相互遮光，具有较高的光合利用率，植株再生能力、抗病虫能力、根系吸收营养的能力强，从而可进行多次根上收获。
, 百拇医药
另外，Irfan等通过实验发现，盐类或重金属类可以改变植物体内的渗透压，以至改变黄花蒿体内活性氧的量，加速了黄花蒿酸向青蒿素的转化。所以在最后一次收获之前，如果不是黄花蒿的留种田，可以在收割前10～15天喷洒少量的氯化钠盐溶液或醋酸铅溶液。虽然这样会导致黄花蒿枯萎，不能继续生长或生长缓慢，但是由于青蒿素沉积量变化较大，依旧提高了青蒿素的产量。而且这还可以减少青蒿素提取过程中的工作量和资源消耗量。
■方法2：组织培养法
利用植物组织培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的另一热点，此种方法具有不破坏自然资源、不受自然条件限制的优点，还有可能通过各种细胞及基因工程的手段获得高产青蒿素的新品系，具有其他方法无法替代的优越性，有可能成为大规模生产青蒿素的重要手段。自20世纪80年代以来，各国科研人员进行了大量的植物组织培养生产青蒿素的研究工作。
许多研究认为黄花蒿愈伤组织中不含青蒿素，但我国学者贺锡纯却在愈伤组织伴随芽分化形成时，检测到约为干质量0.008%的青蒿素。而Brown等和Tawfit等在分化苗长成的植株中，也发现青蒿素的量达到干质量的0.92%，高于野生植株；同时在其分化的芽和黄花蒿悬浮细胞培养液中发现青蒿素。
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由此可见，在未分化的黄花蒿植物组织中不含或含有极低水平的青蒿素，而一定的组织分化则可促进青蒿素的合成。所以在黄花蒿的组织培养过程中，应该使用大量的物质刺激愈伤组织分化成苗，从而获得高产量的青蒿素。
愈伤组织形成是整个组织培养的基础，不应忽视，常用的诱导方法是：在无菌条件下将已消毒的黄花蒿花序、花枝及叶片剪碎，分别接种于含有6-苄基嘌呤(6-BA)l摩尔/升+2，4-D0.5摩尔/升及6-BAl摩尔/升+激动素(Kt)0.5摩尔/升的MS培养基上，在24～28℃条件下避光培养9天，诱导愈伤组织，5～10天后伤口处即生长出白色或淡黄色的愈伤组织。将诱导15～20天的愈伤组织转接于新的培养基，并于恒温光照下培养。愈伤组织约15天转接一次。将所得愈伤组织分别转入含有吲哚乙酸(IAA)0.l摩尔/升+6-BA1摩尔/升及IAA0.1摩尔/升+Ktl摩尔/升的芽分化培养基上，每日光照8小时，分化出芽。
在芽的分化过程中，影响青蒿素合成的因素很多，如黄花蒿的基因型、激素和基本培养基都对芽的发生有显著影响。例如，Woerdenbag等研究发现，赤霉素和水解酯蛋白等对黄花蒿芽中的青蒿素合成具有较强的刺激作用，Panieg等的试验也表明，在诱导青蒿素芽的培养基中添加适量的赤霉素，会使得芽中的青蒿素量提高3～4倍。
, 百拇医药
目前，黄花蒿组织培养的研究工作主要集中在利用生物技术的手段来进行组织培养物的改进，如通过改进培养器皿，从而得到高产青蒿素。Fulzeledpl等利用1升生物反应器进行黄花蒿芽的悬浮培养，经过30天的分批培养可获得再生的植株，生物量提高了4～5倍。Park等利用2升的长方形雾化培养器培养黄花蒿芽，经过4周的培养，培养物增殖8倍，获得的黄花蒿芽可长出不定根。
中国科学院植物研究所的一些专家通过摇瓶、气升式内环流生物反应器及雾化生物反应器获得高产黄花蒿及青蒿素。在气升式内环流生物反应器中，毛状根培养物均匀分布在生物反应器的筛网间，或以不锈钢网为附着点向周围生长，在25℃和12小时的光周期下，经20天获得培养物的生物量的干质量为22.57克/升，青蒿素产量达到374.4毫克/升。此项工作为进一步利用生物反应器进行黄花蒿组织大规模培养生产青蒿素的研究奠定基础。
■方法3：转基因克隆法
通过转基因方法来提高青蒿素的产量，是一种目前认为最有发展潜力的提高青蒿素产量的方法。相关的研究虽然很多，但是由于种种因素的限制，以及人们对转基因物质始终存在的排斥心理，所以这一方面的文献报道相对较少。一般认为青蒿素的生物合成经由三大步骤:醋酸形成法尼基焦磷酸(FPP)，由FPP合成倍半萜，倍半萜内酯化形成青蒿素，而目前也认为这3个步骤分别与法尼基焦磷酸合成酶、倍半萜环化酶，以及酶形成过程中的加氧酶或氧化酶有关。
, 百拇医药
在黄花蒿转基因过程中，多数是用农杆菌携带外源基因感染健壮黄花蒿植株，把外源基因插入到目标DNA的特定部位，最后对获得外源基因的植株进行继代培养，以得到性状稳定的高产黄花蒿品系。一些与青蒿素合成有关的基因被克隆，并且一部分被转移到大肠杆菌或黄花蒿中进行表达，如法尼基焦磷酸合成酶基因、倍半菇环化酶基因、萜类合成酶基因、杜松烯合成酶基因。
同时，由于青蒿素及其衍生物的生物合成受多个限速酶所调控，且一些编码限速酶基因的表达可能具有高度的组织和时空特异性，因此通过导入过量表达的相关限速酶基因或抑制其他分支途径的反义基因，可望提高转基因器官或植株中青蒿素及其衍生物的量。将改良的绿色荧光蛋白(GFP)基因，插入到植物表达载体中，构建双花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动下的植物表达载体pBIGFp。Southernblotting分析表明，外源GEP基因已整合到转基因黄花蒿芽GZI系的基因组中。在荧光显微镜下，观察到转基因黄花蒿芽中有较强的绿色荧光，表明绿色荧光蛋白基因在转基因黄花蒿芽中已表达。
由于现代科学的发展速度并不能完全消灭疟疾，目前还没有发现比青蒿素更有效的治疗疟疾的药物，且青蒿素具有高效、速效、低毒，不会产生抗药性的特点。所以在相当长的一段时间内，青蒿素依旧是最佳的治疗疟疾的药物。所以通过提高黄花蒿产量方法来提高青蒿素的产量是研究人员不懈追求的目标。
在今后的几年里，青蒿素高产的研究应在下几个方向进行深入研究：不同品种的黄花蒿高产栽培及收割模式的研究；黄花蒿组织培养生物反应器系统及培养物质的研究，努力实现青蒿素大规模组织培养化生产；青蒿素合成关键酶基因的研究，以及在合适的黄花蒿体系中的高效表达。
(吴静 丁伟 张永强), 百拇医药(吴静；丁伟；张永强)
——编者按
■方法1：育苗栽培多次收割法
研究表明，叶是光合作用的器官，也是青蒿素主要的积累器官，其中含青蒿素的量较高，而茎中的量仅为叶的10%。在黄花蒿叶内，青蒿素约从3、4月份渐渐开始合成和积累，在5、6月开始升高，在8、9月达到顶峰。正在开花的植株中，叶中的青蒿素的含量约占总量的30%，冠状花序中约含40%的青蒿素，根中所含的青蒿素的量在整个生长过程中都较低。不过，冠状花序中由于瘦果油的出现导致青蒿素提取较困难。
, http://www.100md.com
因此，在植株的生活力较强时，90%的青蒿素聚集在叶和优质茎中，是化学提取的最佳时期，必须恰当把握栽培及收割方式才能很好地提高青蒿素的产量。目前通常的做法是在得到较早的幼苗后进行大田移栽。除此之外，Kumars等提出多次收获法可以提高黄花蒿中青蒿素的产量，即3月上旬移栽，于6月中旬、8月上旬、9月中旬及11月中旬收割，共收割4次。据他们统计比较，采用这种方法所得的青蒿素产量达到了62千克/公顷，远远高于普遍的栽培收割法的25千克/公顷。
Kumars等指出，目前进行的大田实验中，所测得的各个性状的比例及相关分析说明了一个普遍存在的现象：收割多次的叶的总产量比1次或2次的高。这是因为间歇性的收割会促使植株的再生，产生新叶。这样，富含青蒿素的叶被及时收获，避免了青蒿素的流失及叶的脱落。这是因为，尽管黄花蒿是一年生植物，但其生长期长，具有健壮的根系、极其丰富的茎叶，枝叶排列有序，不相互遮光，具有较高的光合利用率，植株再生能力、抗病虫能力、根系吸收营养的能力强，从而可进行多次根上收获。
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另外，Irfan等通过实验发现，盐类或重金属类可以改变植物体内的渗透压，以至改变黄花蒿体内活性氧的量，加速了黄花蒿酸向青蒿素的转化。所以在最后一次收获之前，如果不是黄花蒿的留种田，可以在收割前10～15天喷洒少量的氯化钠盐溶液或醋酸铅溶液。虽然这样会导致黄花蒿枯萎，不能继续生长或生长缓慢，但是由于青蒿素沉积量变化较大，依旧提高了青蒿素的产量。而且这还可以减少青蒿素提取过程中的工作量和资源消耗量。
■方法2：组织培养法
利用植物组织培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的另一热点，此种方法具有不破坏自然资源、不受自然条件限制的优点，还有可能通过各种细胞及基因工程的手段获得高产青蒿素的新品系，具有其他方法无法替代的优越性，有可能成为大规模生产青蒿素的重要手段。自20世纪80年代以来，各国科研人员进行了大量的植物组织培养生产青蒿素的研究工作。
许多研究认为黄花蒿愈伤组织中不含青蒿素，但我国学者贺锡纯却在愈伤组织伴随芽分化形成时，检测到约为干质量0.008%的青蒿素。而Brown等和Tawfit等在分化苗长成的植株中，也发现青蒿素的量达到干质量的0.92%，高于野生植株；同时在其分化的芽和黄花蒿悬浮细胞培养液中发现青蒿素。
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由此可见，在未分化的黄花蒿植物组织中不含或含有极低水平的青蒿素，而一定的组织分化则可促进青蒿素的合成。所以在黄花蒿的组织培养过程中，应该使用大量的物质刺激愈伤组织分化成苗，从而获得高产量的青蒿素。
愈伤组织形成是整个组织培养的基础，不应忽视，常用的诱导方法是：在无菌条件下将已消毒的黄花蒿花序、花枝及叶片剪碎，分别接种于含有6-苄基嘌呤(6-BA)l摩尔/升+2，4-D0.5摩尔/升及6-BAl摩尔/升+激动素(Kt)0.5摩尔/升的MS培养基上，在24～28℃条件下避光培养9天，诱导愈伤组织，5～10天后伤口处即生长出白色或淡黄色的愈伤组织。将诱导15～20天的愈伤组织转接于新的培养基，并于恒温光照下培养。愈伤组织约15天转接一次。将所得愈伤组织分别转入含有吲哚乙酸(IAA)0.l摩尔/升+6-BA1摩尔/升及IAA0.1摩尔/升+Ktl摩尔/升的芽分化培养基上，每日光照8小时，分化出芽。
在芽的分化过程中，影响青蒿素合成的因素很多，如黄花蒿的基因型、激素和基本培养基都对芽的发生有显著影响。例如，Woerdenbag等研究发现，赤霉素和水解酯蛋白等对黄花蒿芽中的青蒿素合成具有较强的刺激作用，Panieg等的试验也表明，在诱导青蒿素芽的培养基中添加适量的赤霉素，会使得芽中的青蒿素量提高3～4倍。
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目前，黄花蒿组织培养的研究工作主要集中在利用生物技术的手段来进行组织培养物的改进，如通过改进培养器皿，从而得到高产青蒿素。Fulzeledpl等利用1升生物反应器进行黄花蒿芽的悬浮培养，经过30天的分批培养可获得再生的植株，生物量提高了4～5倍。Park等利用2升的长方形雾化培养器培养黄花蒿芽，经过4周的培养，培养物增殖8倍，获得的黄花蒿芽可长出不定根。
中国科学院植物研究所的一些专家通过摇瓶、气升式内环流生物反应器及雾化生物反应器获得高产黄花蒿及青蒿素。在气升式内环流生物反应器中，毛状根培养物均匀分布在生物反应器的筛网间，或以不锈钢网为附着点向周围生长，在25℃和12小时的光周期下，经20天获得培养物的生物量的干质量为22.57克/升，青蒿素产量达到374.4毫克/升。此项工作为进一步利用生物反应器进行黄花蒿组织大规模培养生产青蒿素的研究奠定基础。
■方法3：转基因克隆法
通过转基因方法来提高青蒿素的产量，是一种目前认为最有发展潜力的提高青蒿素产量的方法。相关的研究虽然很多，但是由于种种因素的限制，以及人们对转基因物质始终存在的排斥心理，所以这一方面的文献报道相对较少。一般认为青蒿素的生物合成经由三大步骤:醋酸形成法尼基焦磷酸(FPP)，由FPP合成倍半萜，倍半萜内酯化形成青蒿素，而目前也认为这3个步骤分别与法尼基焦磷酸合成酶、倍半萜环化酶，以及酶形成过程中的加氧酶或氧化酶有关。
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在黄花蒿转基因过程中，多数是用农杆菌携带外源基因感染健壮黄花蒿植株，把外源基因插入到目标DNA的特定部位，最后对获得外源基因的植株进行继代培养，以得到性状稳定的高产黄花蒿品系。一些与青蒿素合成有关的基因被克隆，并且一部分被转移到大肠杆菌或黄花蒿中进行表达，如法尼基焦磷酸合成酶基因、倍半菇环化酶基因、萜类合成酶基因、杜松烯合成酶基因。
同时，由于青蒿素及其衍生物的生物合成受多个限速酶所调控，且一些编码限速酶基因的表达可能具有高度的组织和时空特异性，因此通过导入过量表达的相关限速酶基因或抑制其他分支途径的反义基因，可望提高转基因器官或植株中青蒿素及其衍生物的量。将改良的绿色荧光蛋白(GFP)基因，插入到植物表达载体中，构建双花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动下的植物表达载体pBIGFp。Southernblotting分析表明，外源GEP基因已整合到转基因黄花蒿芽GZI系的基因组中。在荧光显微镜下，观察到转基因黄花蒿芽中有较强的绿色荧光，表明绿色荧光蛋白基因在转基因黄花蒿芽中已表达。
由于现代科学的发展速度并不能完全消灭疟疾，目前还没有发现比青蒿素更有效的治疗疟疾的药物，且青蒿素具有高效、速效、低毒，不会产生抗药性的特点。所以在相当长的一段时间内，青蒿素依旧是最佳的治疗疟疾的药物。所以通过提高黄花蒿产量方法来提高青蒿素的产量是研究人员不懈追求的目标。
在今后的几年里，青蒿素高产的研究应在下几个方向进行深入研究：不同品种的黄花蒿高产栽培及收割模式的研究；黄花蒿组织培养生物反应器系统及培养物质的研究，努力实现青蒿素大规模组织培养化生产；青蒿素合成关键酶基因的研究，以及在合适的黄花蒿体系中的高效表达。
(吴静 丁伟 张永强), 百拇医药(吴静；丁伟；张永强)