第七章 附则
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《中国药事管理》
第二十六条 本办法中体外诊断试剂指免疫学、微生物学、分子生物学等体外诊断试剂。
第二十七条 抗生素、动物脏器制品按《新药审批办法》管理。
第二十八条 生物制品工艺重大改革的审查认定由中国药品生物制品检定所负责。
第二十九条 治疗用生物制品临床研究的要求、新生物制品的技术转让、新生物制品研制过程中违规处罚等与《新药审批办法》规定类同的事项均参照《新药审批办法》执行。
第三十条 本办法由国家药品监督管理局负责解释。
第三十一条 本办法自1999年5月1日起施行。
附件：
一、新生物制品临床研究申请表
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二、新生物制品申报资料项目
(一)治疗用新生物制品申报资料项目
(二)预防用新生物制品申报资料项目
(三)体外诊断用品申报资料项目
三、人用重组DNA制品质量控制要点
四、人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点
五、传代细胞系生产生物制品规程
六、预防用新生物制品临床研究的技术要求
七、预防用新生物制品临床研究程序
八、人的体细胞治疗申报临床试验指导原则
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九、人基因治疗申报临床试验指导原则
十、放射免疫分析药盒申报资料项目及要求
十一、用于检测病原体的体外核酸扩增(PCR)诊断试剂盒的申报、审评暂行办法
十二、体外生物诊断试剂报批批量最低要求
十三、新生物制品证书生产申请表
十四、新生物制品转正式生产申请表
十五、新生物制品试行规程转正申请表
十六、新生物制品试行规程转正的具体要求
附件一：
新生物制品临床研究申请表
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名 称：
类 别：
研究单位：
国 家 药 品 监 督 管 理 局 制
研制单位填报项目
品 名中文名
英文名
汉语拼音
剂 型规 格
组成成份 及含量
制备 工艺
适应症与 用法
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活性测定方法和结论
效力实验或药理学 研究项目和结论
实验室 安全性及 毒性研究项目及结论
申请单位
地 址邮政编码
电 话
研制负责人 (签字)日 期年 月 日
附件二：
新生物制品申报资料项目
(一)治疗用新生物制品申报资料项目
1.新生物制品临床研究申请表，附中检所复检报告
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2.研究工作总结
3.新制品名称、选题目的和依据、国内外有关方面研究现状(包括专利)、生产和使用情况综述及主要参考文献
4.生产用菌毒种来源、历史、全面检定及鉴别资料和传代限度试验资料；或工程菌(细胞)构建的详细资料，包括目的基因的获得、表达载体详细结构、宿主菌(细胞)基因型、表型特征等；或杂交瘤株建株详细资料
5.生产用原材料质控要求的有关资料
6.生产工艺研究及确定的有关资料
7.中试产品质量研究总结资料,包括生物活性测定方法试验研究资料
8.工作参考品或对照品的制备及检定资料
9.培养及生产过程中使用对人有潜在毒性物质的检查资料
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10.生产用动物合格证明,研制和中试车间面积、净化、工艺走向图纸，制备和检定用主要仪器、设备等情况，省级药品监督管理部门核实盖章
11.与国内外同类产品质量比较资料
12.内包装材料及选择的依据
13.供临床研究用连续三批中试产品的制造和检定原始记录
14.中试产品制造和检定规程草案及起草说明
15.至少三批中试产品初步稳定性试验资料
16.制剂的处方、工艺及处方依据，辅料的来源及质量标准，有关文献资料等
17.目的基因核苷酸序列、表达质粒酶切图谱以及特异性鉴别资料
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18.目的基因表达产物结构确证资料，包括氨基酸组成分析、N末端15个氨基酸及C末端1～2个氨基酸序列分析、肽图分析、圆二色光谱分析等，或单抗特异性、亲和力、活性等试验资料
19.原始种子库和生产种子库建库资料以及贮存复苏过程中宿主载体表达系统遗传、表达稳定性试验资料，或杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性试验资料
20.生产用种子库外源因子检查(细菌、真菌、支原体和病毒)、细胞基质外源因子检查、核型分析及致瘤性试验资料
21.与治疗作用有关的动物主要药效学研究资料及文献资料
22.动物一般药理学研究资料及文献资料
23.动物药代动力学研究资料及文献资料
24.动物急性(单剂量)毒性研究资料及文献资料
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25.动物长期(重复给药)毒性研究资料及文献资料
26.动物局部用药毒性研究资料及文献资料
27.复方制剂中多种组分对动物药效或毒性影响的研究资料及文献资料
28.遗传毒性研究资料及文献资料
29.生殖毒性研究资料及文献资料
30.致癌研究资料及文献资料
31.药物依赖性研究资料及文献资料
32.免疫毒性和/或免疫原性研究资料及文献资料
33.供临床医师参阅的临床前药理毒理研究结论综述及拟进行的临床研究方案及有关文献资料
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34.新生物制品证书、生产申请表，附临床研究批件
35.临床药代动力学的研究资料及文献资料
36.临床研究负责单位总结的临床研究资料，并附各临床研究单位的分报告等资料
37.制定保存条件及效期的稳定性试验资料
38.连续三批试产品原始制检记录及中检所复核报告
39.制造和检定试行规程及起草说明
40.内包装材料及选择的依据
41.使用说明书及包装、标签样稿
42.临床研究批件要求完成工作的完成情况及试验资料
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43.生产用原材料、试剂、化学药品的规格及标准
44.生产车间的GMP认证证书
45.临床前研究工作简要总结
46.新生物制品转正式生产申请表，附试生产批件、制造和检定试行规程、使用说明书
47. Ⅳ期临床研究总结资料，并附各临床研究单位的分报告等资料
48.试生产批件上要求完成工作的完成情况及试验资料
49.试生产工作总结，包括试生产概况、产量及全面质量检定结果等
50.连续3～5批试制品的原始制检记录及中检所复检报告
51.修改后的制造及检定试行规程和使用说明书，以及修改说明并提供有关试验资料
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52.连续3～5批试制品的稳定性考核资料及所有试制品留样考核结果总结关于申报资料项目的几点说明：
1.不包括基因治疗和体细胞治疗制剂。
2.每份研究资料后面都应注明试验设计者、试验参加者、试验单位、试验日期、原始资料保存处和联系人等。
3.药学：
1)常规方法生产制品申报临床资料需报资料1～16项，采用DNA重组技术或杂交瘤技术制备制品尚需申报17～20项(I、II类制品)；申报新药证书、试生产需报资料34～45项；转正式生产需报资料46～52项。13项中应说明试制和检定用主要仪器、设备、环境条件等。
2)血液制品尚需增加病毒灭活工艺验证，请参照"血液制品去除或灭活病毒方法及其验证和论证程序"。
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3)特殊申请申报资料根据不同品种而定。
4)单抗及修饰单抗详细要求参照"人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点"。
5)Ⅲ、Ⅳ类制品根据重大生产工艺改革情况或剂型、途径改变情况而减少申报项目。
6)V类制品主要申报1～3和41项。
4.药理毒理研究：
1)许多新生物制品具有较强的种属特异性、免疫原性等生物学特性，因此，申报资料的21～33项，对某些新生物制品可能涉及到选择相关动物种属(指受试物在此类动物体内能通过表达的受体或抗原决定簇产生药理活性)进行体内外试验。有时只能确定一种相关动物用于试验。如确无可供选择的相关动物种属，应考虑使用表达人源受体的相关转基因动物或使用同系蛋白。
, 百拇医药 2)未经修饰的人源性血液制品和特异性免疫球蛋白，可免报安全性研究资料(不包括复方制品)；微生态制品只需做一般安全试验，其他安全性研究资料可免报。
3)人体内用单克隆抗体的有关申报资料的毒理研究要求，可参考"人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点"(附件四)中有关临床前研究部分。
4)对第28项的说明：常规使用的遗传毒性研究方法不适用于生物技术药物，因此可免做。但如果对产品有某些担心(例如结合蛋白产品中存在有机联接物)，应考虑用相关的或新建立的方法进行研究。
5)对第29项的说明：可根据产品的情况、临床适应症和预期使用的病人群体决定是否进行该项研究。
6)对第30项的说明：常规使用的致癌研究方法一般不适用于生物技术药物，然而有些如生长因子、免疫抑制剂等产品，应根据临床用药时间、病人群体和生物活性对其进行潜在致癌性的评价。如具有加强或诱导转化细胞增生和克隆扩增潜力的产品可能具有致瘤性，可用相关的恶性或正常细胞和动物模型进行研究。
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7)对第32项的说明：免疫毒性研究主要考察拟用于刺激或抑制免疫系统的某些生物技术药物，因其可能影响细胞介导的免疫或改变靶细胞表面抗原的表达(可能导致自身免疫)。
免疫毒理学评价的一个方面还应包括评价潜在的免疫原性，许多生物技术药物对动物有免疫原性，其评价可在重复给药毒性试验中检测抗体以助说明。
一般对蛋白质产品呈阳性的豚鼠过敏试验结果不能预测人体反应，因此，对这类产品进行该试验无必要。
8)对申报资料21～33项的有关具体技术要求可进一步参考"药理毒理申报资料技术要求"指导原则的有关章节。
9)第五类制品主要申报21、22、24、25、26、33项(延长用药周期和/或增加剂量者)。
(二)预防用新生物制品申报资料项目
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1.新生物制品临床研究申请表，附中检所复检报告
2.研究工作总结
3.新制品名称、选题目的和依据、国内外有关方面研究现状(包括专利)、生产和使用情况综述及主要参考文献
4.生产用菌、毒种来源、历史、全面检定及鉴别资料和传代限度试验资料
5.生产用菌、毒种毒力(或毒性)及毒力稳定性、传代限度试验研究资料
6.生产用菌、毒种原始种子库和生产种子库建库及保存条件、贮存资料
7.生产用菌、毒种原始种子库和生产种子库外源因子检查资料(细菌、真菌、支原体和病毒)
8.细胞基质外源因子检查、核型分析及致瘤性试验资料以及传代使用代次限度试验资料
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9.抗原性试验研究资料
10.免疫原性或效力试验研究资料
11.过敏原性研究资料
12.生产工艺确定及质量检定方法研究资料
13.中试产品质量及产量全面总结资料
14.参考品或对照品制备及检定资料
15.至少三批中试产品初步稳定性试验资料
16.培养及生产、纯化过程中加入对人有潜在毒性物质检查资料
17.供临床研究用连续三批中试产品的制造和检定原始记录
18.中试产品制造和检定规程草案及起草说明
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19.拟进行的临床研究方案及有关文献资料
20.生产用动物合格证明,研制和中试车间面积、净化、工艺走向图纸，制备和检定用主要仪器、设备等情况，省级药品监督管理部门核实盖章
21.与原制品比较资料
22.内包装材料及选择的依据
23.工程菌(细胞)构建的详细资料，包括目的基因的获得、表达载体详细结构、宿主菌(细胞)基因型、表型特征等
24.原始种子库和生产种子库建库资料以及贮存复苏过程中宿主载体表达系统稳定性试验资料
25.目的基因核苷酸序列及酶切图谱以及特异性鉴别资料
26.目的基因表达产物结构确证资料，包括氨基酸组成分析、N末端15个氨基酸及C末端1～2个氨基酸序列分析、肽图分析等
, 百拇医药
27.残余人DNA含量、宿主蛋白残余量测定
28.新生物制品证书、生产申请表，附临床研究批件
29.临床研究负责单位总结的临床研究资料，并附各临床研究单位的分报告等资料
30.制定保存条件及效期的稳定性试验资料
31.连续三批试产品原始制检记录及中检所复核报告
32.制造和检定试行规程及起草说明
33.内包装材料及选择的依据
34.使用说明书及包装、标签样稿及有关说明
35.临床研究批件要求完成工作的试验资料
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36.生产用原材料、试剂、化学药品的规格及标准
37.试生产车间的GMP认证证书
38.临床前研究工作简要总结
39.新生物制品转正式生产申请表，附试生产批件、制造和检定试行规程、使用说明书
40.Ⅳ期临床研究总结资料，并附各临床研究单位的分报告等资料
41.试生产批件上要求完成工作的试验资料
42.试生产工作总结，包括试生产概况、产量及全面质量检定结果等
43.连续3～5批试制品的原始制检记录及中检所复检报告
44.修改后的制造及检定试行规程和使用说明书，以及修改说明并提供有关试验资料
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45.连续3～5批试制品的稳定性考核资料及所有试制品留样考核结果总结
说明：
1.不包括DNA疫苗。
2.每份研究资料后面都应注明试验设计者、试验参加者、试验单位、试验日期、原始资料保存处和联系人等。
3.临床研究申请：用常规方法制备菌苗、疫苗、类毒素申报资料1～22项，用DNA重组技术产品尚需增加申报23～27项。
4.新生物制品证书、试生产申请需报28～38项；转正式生产申请需报39～45项。
(三)体外诊断用品申报资料项目
1.新生物制品证书/生产申请表。
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2.研究工作总结。
3.新体外诊断用品的名称，选题目的和依据，国内外有关的研究现状及生产使用情况综述及主要参考文献资料，专利检索资料。
4.产品的研制报告：包括原材料的选择、制造，生产工艺过程的确定，成品质控标准的建立，成品性能评价(灵敏度,特异性精密度等)，与国内外同类产品进行比较等试验资料。
5.连续生产三批产品的原始制造检定记录复印件，及中国药品生物制品检定所对这三批产品进行检定的报告书。
6.稳定性试验资料：至少三批产品在储存温度条件下保存至效期后两个月的试验资料，及37℃保存的试验资料。检测项目应按成品检定标准进行。
7.临床使用考核资料：选择三家以上省级医疗卫生单位用统一的方案进行考核，提供一份总的临床考核总结报告及各单位的分报告，附临床考核原始数据。病例数一般不少于1000例，非常见病可酌减，但要有统计学意义。
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8.制造检定规程草案：参照《中国生物制品规程》的格式书写。
9.使用说明书：包括中英文名称，规格，前言(原理、用途、特点)，试剂盒组份、操作步骤，结果判定，注意事项，保存条件及有效期，生产单位名称、地址、电话、邮编等。
10.包装材料及各组份标签实物或样稿。
11.《药品生产企业许可证》复印件。生产车间验收文件复印件。
12.转正式生产申请报告。
13.原批准的试生产批件及试行制检规程、使用说明书。
14.试生产期间完善生产工艺、生产、销售情况总结及临床使用情况分析总结。
15.对试生产批件中要求进行的研究工作完成情况的总结。
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16.提供重新修改的产品制检规程和使用说明书。
17.中国药品生物制品检定所对连续试生产的三批样品的检定报告书及原始生产制造检定记录复印件。
关于申报资料项目的几点说明：
1.自制原材料为单克隆抗体或基因工程产品，申报资料要求参照附件三、四。
2.放射免疫分析药盒申报资料项目及要求见附件十。
3.用于检测病原体的体外核酸扩增(PCR)诊断试剂盒申报资料项目及要求见附件十一。
4.体外诊断用品证书/生产申请需报1～11项，试生产转正式生产申请需报12～17项。
5.试剂盒检定所用的参比品由中国药品生物制品检定所提供和/或认可。
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6.CUT OFF值的确定：正常人标本测定人数应在400人份以上，所得数据经统计学处理。
7.评价体外诊断试剂盒试验标准应包括两方面：真实性和可靠性。
①真实性(Validity)：真实性指测量值与实际值符合的程度。(诊断试验应能提供哪些人确实有病(真阳性)和哪些人确实无病(真阴性)的指标，这是试验的真实性)。评价真实性的两个指标：灵敏度(Sensitivity)及特异度(Specificity)。
灵敏度是试验检出有病(即阳性)的人占病人总数的比例，即真阳性率。特异度指试验检出无病(即阴性)的人占无病者总数的比例，即真阴性率。
表 评价一个试验真实性的资料归纳表
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试 验 有病(真阳性) 无病(真阴性) 合 计
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阳 性 A B A+B
────────────────────────────────
阴 性 C D C+D
────────────────────────────────
总 数 A+C B+D A+B+C+D
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用下列公式表示：
灵敏度(真阳性率)=A/(A+C)×100%
特异度(真阴性率)=D/(B+D)×100%
假阳性率=B/(B+D)×100%
假阴性率=C/(A+C)×100%
除上述指标外，还可计算下列几种指标：
1)粗一致性(Crude agreement)=(A+D)/(A+B+C+D)×100%
2)调整一致性(adjusted agreement)=1/4{A/(A+B)+A/(A+C)+D/(C+D)+D/(B+D)×100%}以上两个指标均说明诊断试验阳性与阴性结果均正确的百分比，亦反映试验的真实性。
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3)约登指数(youden's index)=A/(A+C)+D/(B+D)-1约登指数是将灵敏度与特异度之和减1，指数可从0～1。约登指数愈大，其真实性亦愈大。
②可靠性(reliability)：可靠性是指试验在相同条件下重复试验获得相同结果的稳定程度。如试验结果为均数，可用变异系数(coefficient of Variation)表示。公式为
CV=S/X×100%
S为标准差，X为平均值
③预示值(Predictive value)：预示值是说明试验的诊断价值。试验阳性的预示值是指试验阳性者中患病者(真阳性)的可能性；试验阴性的预示值是指试验阴性者中为非病人(真阴性)的可能性。可用下列公式表示：
阳性试验的预示值=A/(A+B)×100%
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阴性试验的预示值=D/(C+D)×100%
附件三：
人用重组DNA制品质量控制要点
1.引言
由于分子遗传学、核酸化学及重组DNA(rDNA)技术的迅速发展，现已能够确定和获得许多天然活性蛋白的编码基因，将其插入表达载体或引入某种宿主细胞后，能有效地表达该基因产物，再经分离、纯化和检定，可得到用于预防和治疗某些人类疾病的制品，诸如现有的乙型肝炎疫苗、胰岛素、生长激素、干扰素等。
用不同于常规方法的rDNA技术生产的制品，是近年来出现的新产品，评价其安全性和有效性亦不同于常规方法。目前在这方面的生产和质量控制经验不多，而且这一领域中的知识和技术还在不断发展，但是，为了有利于这类制品在我国的研究和发展，并为这类制品的审评提供依据，有必要制定一个原则性指导文件，以保证在人群中试验或应用时安全有效。
, 百拇医药
本"质量控制要点"(以下简称《要点》)不可能面面俱到，可能有许多专门技术问题会出现，对于这类问题或某一特定制品，则应视具体问题具体研究决定。本《要点》亦将随科学技术发展和经验积累而逐步完善。
2.总则
2.1本《要点》适用于rDNA技术生产并在人体内应用的制品。
2.2凡属与一般生物制品有关的质量控制，均按现行《中国生物制品规程》执行。
有关生产设施的要求应参照国家药品监督管理局《药品生产质量管理规范》1999年版执行。
3.质量控制要求
3.1原材料的控制
3.1.1表达载体和宿主细胞
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应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定，表达载体的构建、结构和遗传特性。应说明载体组成各部分的来源和功能，如复制子和启动子来源，或抗生素抗性标志物。提供至少包括构建中所用位点的酶切图谱。应提供宿主细胞的资料，包括细胞株(系)名称、来源、传代历史、检定结果及基本生物学特性等。
应详细说明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，是否整合到染色体内，拷贝数。应提供宿主和载体结合后的遗传稳定性资料。
3.1.2克隆基因的序列
应提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细叙述。
3.1.3表达应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。
3.2生产的控制
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3.2.1主细胞库(MASTER CELL BANK)
rDNA制品的生产应采用种子批(SEED LOT)系统。从已建立的主细胞库中，再进一步建立生产细胞库(WCB)。
含表达载体的宿主细胞应经过克隆而建立主细胞库。在此过程中，在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不同细胞(菌种)；一个工作人员亦不得同时操作两种不同细胞或菌种。
应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命。应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据。采用新的种子批时，应重新作全面检定。
高等真核细胞用于生产时，细胞的鉴别标志，如特异性同功酶或免疫学或遗传学特征，对鉴别所建立的种子是有用的。有关所用传代细胞的致肿瘤性应有详细报告(参照：WHO生物制品规程No.37)。如采用微生物培养物为种子，则应叙述其特异表型特征。
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一般情况下，在原始种子阶段应确证克隆基因的DNA序列。但在某些情况下，例如传代细胞基因组中插入多拷贝基因。在此阶段不适合对克隆基因作DNA序列分析。在此情况下，可采用总细胞DNA的杂交印染分析，或作mRNA的序列分析。对最终产品的特征鉴定应特别注意。
种子批不应含有可能致癌因子(在使用情况下)，不应含有感染性外源因子，如细菌、支原体、真菌及病毒。
但是有些细胞株含有某些内源病毒，例如逆转录病毒，且不易除去。但当已确知在原始细胞库或载体部分中污染此类特定内源因子时，则应能证明在生产的纯化过程可使之灭活或清除。
3.2.2有限代次生产
用于培养和诱导基因产物的材料和方法应有详细资料。对培养过程及收获时，应有灵敏的检测措施控制微生物污染。
应提供培养生长浓度和产量恒定性方面的数据，并应确立废弃一批培养物的指标。根据宿主细胞/载体系统的稳定性资料，确定在生产过程中允许的最高细胞倍增数或传代代次，并应提供最适培养条件的详细资料。
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在生产周期结束时，应监测宿主细胞/载体系统的特性，例如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度、含插入基因的载体的酶切图谱。一般情况下，用来自一个原始细胞库的全量培养物，必要时应做一次基因表达产物的核苷酸序列分析。
3.2.3连续培养生产
基本要求同3.2.2。
应提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。每批培养的产量变化应在规定范围内。对可以进行后处理及应废弃的培养物，应确定指标。从培养开始至收获，应有灵敏的检查微生物污染的措施。
根据宿主/载体稳定性及表达产物的恒定性资料，应规定连续培养的时间。如属长时间连续培养，应根据宿主/载体稳定性及产物特性的资料，在不同间隔时间作全面检定。
3.2.4纯化
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对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除。
如采用亲和层析技术，例如用单克隆抗体，应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。
对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。
关于纯度的要求可视制品的用途和用法而确定，例如，仅使用一次或需反复多次使用；用于健康人群或用于重症患者；对纯度可有不同程度要求。
3.3最终产品的控制
应建立有关产品的鉴别、纯度、稳定性和活性等方面的试验方法。检测的必要性和纯度要求取决于多种因素：产品性质和用途、生产和纯化工艺及生产工艺的经验。一般说来下列试验对控制产品质量是可以采用的。
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3.3.1物理化学鉴定
3.3.1.1氨基酸成份分析
完整的氨基酸成份分析结果，应包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。氨基酸成份分结果应为三次分别水解样品测定后的平均值。
3.3.1.2部分氨基酸序列分析
部分氨基末端序列分析(N端15个氨基酸)可作为rDNA蛋白质和肽的重要鉴别指标。
3.3.1.3肽图分析
肽图分析可作为与天然产品或参考品作精密比较的手段。与氨基酸成分和序列分析结果合并，可作为蛋白质的精确鉴别。对含二硫键的制品，肽图可确证制品中二硫键的排列。
3.3.1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及等电聚焦
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PAGE及等电聚焦有助于证实蛋白质和肽类的纯度和分子量，亦可作为鉴别试验。
PAGE应包括在还原和非还原条件下试验，且应有适宜的分子量标记物作参比。凝胶带
应用灵敏的方法染色，例如银染法，可测定微量蛋白质，亦有助于检出非蛋白质物质，例如核酸、糖及脂类。对分子量小于8000的肽类，PAGE测得的分子量可能不准确。
3.3.1.5高效液相色谱(HPLC)
测定蛋白质和肽类的纯度，HPLC是一种有用的方法，在某些情况下，还可用来评定其分子构型和用作鉴别试验。
3.3.1.6残余细胞DNA测定
必须用敏感的方法测定来源于宿主细胞的残余DNA含量，这对于用哺乳动物传代细胞(转化的细胞系)生产的制品尤为重要。一般认为残余DNA含量小于100pg/剂是安全的，但应视制品的用途、用法和使用对象而决定可接受的限度。
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3.3.1.7其它外源性物质
例如，用单克隆抗体(鼠源)亲和层析纯化的制品，应测定可能存在的鼠IgG，细胞培养生产的制品，应测定残余小牛血清含量(以p.p.m表示)；在培养及纯化过程中所添加的可能有害物质，亦应有相应的测定数据。
3.3.2生物学测定
3.3.2.1鉴别试验
在可能情况下，应用参考品将rDNA制品与天然产品通过生物学比较试验，确定其与天然产品是一致的。
3.3.2.2效价测定
采用国际或国家参考品，或经过国家检定机构认可的参考品，以体内或体外法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位。
3.3.2.3特异比活性测定
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在测定生物学活性的基础上，对有些制品还应测定其特异比活性，以活性单位/重量表示之。
3.3.2.4热原质试验
应采用注射家兔法或鲎试验法(LAL)作热原质检测(《中国生物制品规程》)，控制标准可参照天然制品的要求。
3.3.2.5病毒污染检查
应采用适当的培养基质和培养条件，检查可能污染的病毒，应证实最终制品不含外源病毒。
3.3.2.6无菌试验
参照现行《中国生物制品规程》进行无菌试验，应证实最终制品无细菌污染。
3.3.2.7抗原性物质检查
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在有必要时，如制品属大剂量反复使用者，应测定最终制品中可能存在的抗原性物质，如宿主细胞、亚细胞组分及培养基成份等。患者反复接受大剂量的这类制品时，应密切监测由这些抗原可能产生的抗体或变态反应。
3.3.2.8毒性试验
可参照现行《中国生物制品规程》执行。
4.临床前安全性评价
临床前安全性试验的目的主要是确定新制品是否会在人体引起未能预料的不良反应。但是，用于一般化学药物的传统安全性或毒性试验对rDNA产品不一定适用，用传统毒性试验来评价rDNA产品往往有困难，并受多种因素的影响。例如，某些蛋白质，如干扰素，具有高度种属特异性，这种人的蛋白质对人的药理学活性远超于对动物的活性，而且人的蛋白质氨基酸序列，常常与来自其它种系的蛋白质不同，例如糖基就不一样。因而由基因工程技术所制备的蛋白质或肽类往往会在人体以外的其它宿主中产生免疫应答，其生物学效应有所改变，并可能因形成免疫复合物而导致有毒性反应，而这样产生的毒性反应与人体安全性显然无关。
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综上述理由，对rDNA产品的临床前安全性试验要求，难以一概而论，应采取较为灵活的处置方法。除了一般生物制品的毒性试验要求之外，其它如长期毒性试验、药代动力学试验、药理学试验、毒理学试验，以及致畸和致突变等试验，应根据制品性质，与国家检定机构及药品审评中心商定所需进行的试验项目和方法，以及判定标准。
5.临床试验
用rDNA技术所生产的制品必需经过临床试验，以评价其安全性和有效性。
附件四：
人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点
本品系用杂交瘤技术将抗原免疫动物后，取脾或外周血淋巴细胞或经体外免疫获得的免疫淋巴细胞与相应的骨髓瘤细胞融合建立稳定分泌特异抗体的杂交瘤细胞株，通过体内法或体外培养法制备单克隆抗体，经提取纯化获得的特异性单克隆抗体制剂。用于有关疾病的诊断或治疗。
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1杂交瘤细胞
1.1亲本细胞
1.1.1骨髓瘤细胞
SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体条数，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。
1.1.2免疫亲代细胞
经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。
应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。
适宜的免疫方法及免疫淋巴细胞制备的方法。
1.2细胞融合
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末次免疫后第3天取脾制成细胞悬液，与骨髓瘤细胞按一定的比例混合并在融合剂作用下或在电融合仪中按常规法或其他适宜的方法进行细胞融合。
1.3克隆化
用ELISA或其他适宜方法筛选出分泌目的抗体的杂交瘤经有限稀释法或其他适宜方法对其进行克隆化，直至获得具有稳定分泌单克隆抗体能力的杂交瘤细胞系。
1.4杂交瘤细胞检定
1.4.1抗体分泌稳定性
经克隆化及连续传代后检查。连续克隆化后至检测单克隆抗体阳性率达100%，并在体外传代3个月以上细胞株能保持稳定的分泌抗体。
1.4.2细胞核学特征
检查细胞分裂中期染色体。应符合杂交瘤细胞的核型。
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1.4.3鼠源病毒检查
按附录1要求检测鼠源病毒。
1.4.3.1细胞接种法
细胞及培养上清分别接种人2BS细胞、Vero细胞，接种量为107。样品接种细胞后，传两代，制片，用IFA法检测病毒抗原。
1.4.3.2动物接种法
样品接种出生24小时以内乳小鼠两窝(至少10只)，15～20g成年小鼠10只，300～350g的豚鼠5只。每只动物腹腔接种107活细胞。观察4周，存活率应在80%以上；另外接种对淋巴脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)敏感的成年小鼠10只，脑内接种106活细胞，观察4周，存活率应在80%以上。用ELISA或其他适宜的方法检测血清中病毒抗体。
1.4.3.3鸡胚接种法
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样品接种SPF鸡胚尿囊腔和卵黄囊。每种途径至少10只，每只接种106活细胞，孵育5天，用豚鼠和鸡红血球做HA法检测病毒血凝素，同组鸡胚中至少80%保持健康并存活，试验有效。单抗制品不应有鼠源病毒污染。
对产生单克隆抗体的鼠类细胞系，一般认为具有产生传染性鼠类反转录病毒的能力，可以不做反转录病毒检测，但应有资料证明制造工艺中能去除或灭活反转录病毒。
1.4.4支原体检查
1.4.4.1培养法
细胞及培养上清分别接种支原体培养基，按《生物制品检定标准操作细则》进行。应设阴、阳性对照。
1.4.4.2 DNA荧光染色法
细胞及培养上清分别与指示细胞共同培养，按《生物制品检定标准操作细则》进行。
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1.4.5无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2单克隆抗体的检定
2.1免疫球蛋白类及亚类
用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。
2.2亲和力
用适宜的方法测定单抗的亲和常数或相对亲和力。
2.3特异性
测定单抗对靶抗原的特异性；分析单抗识别的抗原决定簇。
2.4交叉反应
按附录2要求。
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免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的成年人及胎儿各脏器组织测定。来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验。
2.5效价测定
用ELISA法或其他特异性方法测定。
3其他原材料
3.1细胞培养用小牛血清
支原体检测应为阴性。经小量试验适于杂交瘤细胞生长。
3.2培养液
应有培养液来源，质量指标。
3.3化学试剂
规格应达到分析纯以上。
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4细胞库的建立和单克隆抗体的生产
为了保证长期、稳定的生产出符合要求的高质量单抗，首先要建立高标准的细胞库。同时单抗生产场所必须符合GMP要求，洁净无污染，生产人员无传染病，不得从事其他可导致传染原污染单抗制剂的工作；无关人员不得进入生产区内。在同一车间内，不得同时生产其他无关单抗。
4.1细胞库
建立原始细胞库和生产细胞库，几种细胞株用于同一目的生产时，应分别建立细胞库及种子批。
4.1.1原始细胞库
为杂交瘤细胞建立时较原始的细胞管，即融合细胞管、一次克隆及多次克隆的细胞管。
4.1.2种子细胞库
由原始细胞库中建株细胞扩大培养冻存的细胞种子。每一批细胞管数不应少于20支，
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贴上标签放入液氮中保存。种子批应进行外源因子检查，包括细菌、真菌、支原体及病毒污染的检查。
4.1.3生产细胞库
经检定合格后的杂交瘤细胞按生产条件大量培养、冻存的细胞管为生产细胞库。每一生产细胞批细胞管数不少于10支，每次生产腹水时取生产细胞管一支复苏、扩增及生产，不再回冻。细胞库应详细纪录存放细胞管位置、代数、管数、冻存、复苏的情况，并有专人负责。同时要进行各种外源因子检测，保证没有污染。
4.2单克隆抗体制备
4.2.1小鼠腹水法
4.2.1.1小鼠
制备腹水必需使用SPF级小鼠，生产用鼠必需经过检查，应无鼠源病毒污染，并有合格证明。在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者均应废弃。
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4.2.1.2动物实验设施
动物实验设施应有相关部门颁发的二级以上的合格证。
4.2.1.3细胞扩大培养
取生产批细胞管一支复苏，加营养液进行扩大培养，一支生产细胞只用一次，不再冻存。
4.2.1.4细胞接种
制备腹水均须在无菌条件下完成。注射杂交瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射液体石蜡或降植烷0.5ml。一般在1周后每只小鼠注射杂交瘤细胞1～3×106。
4.2.1.5腹水的采集
注射细胞后一般7～10天，或在小鼠濒死前一次性采集腹水，亦可多次收集。离心分离出上清即为粗提抗体，注明批号、采集日期，置-20℃保存。
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4.2.2细胞培养法
可以采用发酵罐培养，亦可用细胞培养瓶培养收采上清液制备单克隆抗体。
4.2.2.1种子细胞
来源于生产细胞库。
4.2.2.2培养基
用无牛血清或低牛血清培养基，不能用β-内酰胺类抗生素。
4.2.2.3抗体收集
可一次性收集，也可采用连续收集法。每一支安瓿种子细胞扩大培养后收集的上清为一个批号
4.3粗制抗体检测
无论是小鼠腹水法还是细胞培养法制备的单克隆抗体，都需要进行如下检定。
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4.3.1无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
4.3.2支原体检查
按1.4.4项进行。
4.3.3鼠源病毒检查
按1.4.3项进行。
4.3.4效价测定
用ELISA法或其他特异性检测方法测定。合格的用于抗体纯化。
4.4抗体纯化
可采用盐析法、分子筛层析、离子交换等适宜的方法。
4.4.1尽可能选用一些不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件。
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4.4.2应验证所用的纯化方法能去除可能存在的非目标产物污染，如不需要的免疫球蛋
白分子、宿主DNA、病毒及用于生产腹水抗体的刺激物(如降植烷、液体石蜡)。
4.4.3连续生产(至少3批)的各批产品必须符合质检要求，批间具有良好的重复性。
4.5纯化后处理
4.5.1灭活
必要时56℃水浴灭活30分钟，离心收集上清。
4.5.2合并
不同亚批的合格制品合并后应在2～8℃放置一个月以上，去除部分不稳定蛋白。
4.5.3除菌分装
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将经灭活的单抗用0.22μm滤膜过滤，过滤后进行分装。
5检定
5.1半成品
5.1.1活性检测
用ELISA法或其他特异性检测方法测定。抗体活性应≥参比品。
5.1.2纯度测定
5.1.2.1电泳法
还原和非还原条件SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定抗体纯度。扫描后计算出免疫球蛋白含量，含量应达到95%以上，二聚体≤10%。
5.1.2.2 HPLC法
纯度应≥95%。
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5.1.3多聚体测定
用FPLC或HPLC法，用适宜的分子筛层析，多聚体应≤10%。
5.1.4蛋白质含量测定
用Lowry法或其他适宜的方法测定。
5.1.5DNA含量测定
用DNA分子杂交法。提取待检制品中的DNA，用骨髓瘤细胞制备的DNA探针与待检样品进行杂交。以不同含量的骨髓瘤细胞DNA作为工作标准，每一剂量残余DNA含量不应超过100pg。
5.1.6交叉反应性测定
用免疫组织化学及细胞化学方法检查。应提供3批单抗与人体组织器官的交叉反应性材料。结果不应与人体组织器官发生交叉反应。如肿瘤相关抗原单抗，应进行各种肿瘤组织的交叉反应测定。
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5.2成品检定
5.2.1物理检查
液体制剂应为接近无色微带乳光的澄清液体，不应含有异物、混浊或摇不散的沉淀。
5.2.2化学检查
5.2.2.1 pH值
电位法测定，pH值应为7.0±0.5。
5.2.2.2蛋白质含量
用Lowry法测定，含量应在标示值的90%～110%之内。
5.2.3活性测定
按5.1.1项进行。
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5.2.4无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
5.2.5安全试验
5.2.5.1豚鼠试验
用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品5ml，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
5.2.5.2小白鼠试验
用体重18～20g小白鼠10只，每只腹腔注射检品0.5ml，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
5.2.6热原质试验
, 百拇医药 按照《生物制品热原质试验规程》进行。家兔注射剂量＝(人用剂量÷50)×20×家兔体重(kg)。不应有致热作用。也可用鲎试剂法，1mg/ml蛋白浓度不应检测出有凝集活性。
5.2.7异常毒性试验
每批成品应进行异常毒性试验。腹腔注射5只体重17～22g小鼠和2只体重250～350g的豚鼠，每只小鼠注射1个人用剂量，但不超过1ml；每只豚鼠注射剂量不超过5ml。动物至少存活7天以上，应无任何异常中毒反应。
5.2.8水分测定
产品如为冻干制品，应进行残余水分测定，其含量应≤3%。
6经修饰的单克隆抗体
为了提高单克隆抗体在治疗和体内诊断中的作用，常用单抗与毒素、药物、放射性核素或其他物质偶联形成免疫结合物，或在同一段多肽链中包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重组蛋白来获得。研究者除对前面提到的有关未偶联单克隆抗体(未修饰单克隆体)的要求外，还应提供下列内容：
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6.1免疫结合物的构建
应提供构建免疫结合物所用试剂和过程的详细资料，包括：
6.1.1描述与单克隆抗体连接的成分如：毒素、药物、酶及细胞因子，包括：所有成分的来源、结构、制法、纯度及特征。
6.1.2制备免疫结合物所用化学试剂的描述，如连接剂和螯合剂。这些资料应该包括试剂来源、制备方法，以及合成或纯化时残留杂质的测定等内容。还应提供合成反应途径的图解，以及与免疫结合物制备中所用化学试剂毒性相关资料。
6.1.3在确定成品的标准时应首先确定该原料与抗体的平均结合率及每个抗体被结合部分的数量，并揭示免疫球蛋白置换数量、效力和稳定性间的关系。
6.1.4用重组DNA技术制备的制品(如来源于转染细胞系或微生物培养基，嵌合的、易形的，互补决定区[CDR]接合的及单链Fv抗体，以及重组免疫结合物)应提供构建和制备过程的全部资料。重组免疫结合物的稳定性应认真研究。因聚合物形成构形改变或变性而减弱了特异免疫反应性(如通过重组Fvs形成"双抗")可能导致药代动力学的改变和/或与非靶组织结合。
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6.2免疫结合物的纯度
6.2.1应采取特殊措施保证抗体尽可能无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因这些污染物质在构建免疫结合物过程中，能与核素、毒素或药物发生反应。
6.2.2应规定最终产品中游离抗体或游离组分的限量。活性中间体应被灭活或去除。
6.3免疫结合物的免疫反应性，效力及稳定性
毒素或药物偶联至抗体上会改变其中任一成分的活性。
6.3.1应采用适当的方法评估偶联前后的免疫反应性。
6.3.2免疫结合物非免疫球蛋白成分的活性应在适当的时候用效力试验来进行评估(例如，毒素、细胞因子或酶等)，用于造影的放射性免疫结合物除外。
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6.3.3免疫结合物构建后，应确定免疫反应性变化的百分率限值，并作为产品规格的组成部分。
6.3.4应通过在合并的人血清中37℃无菌条件下孵育，来检测免疫结合物在体外的稳定性。假如所用抗凝剂不会影响免疫结合物的稳定性，血浆可以用来替代血清。经过规定间隔时间分析样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度。应详细说明评估产品稳定性的条件及所用阴、阳对照。
6.4与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题
放免结合物应用标准化的、严格控制并经过验证的方法制备。应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标记的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的方法。
6.4.1放射性标记单克隆抗体的初始研究用新药申报包含连续3次放射标记试生产的分析结果，应证明所制备的产品未改变免疫特异性、无菌、无热原质。放射性标记试生产应由在研究中对单克隆抗体进行放射性标记及使用试剂的同一组人员进行。
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6.4.2制备免疫结合物时应使用放射性药品及同位素并应提供其无菌及无热原质的分析证书及横向参比的信函。
6.4.3在标记试生产过程中，应测定最终产品中共价结合的和游离的同位素的浓度，以及标记试剂及其分解产物的残留水平。
6.4.4应描述给每一个病人应用前后进行的质控试验。
6.4.5适当的时候，应检测免疫结合物形成胶体的情况，并对其进行限定。
7产品稳定性及效期
产品稳定性应满足临床方案制定的要求。加速稳定性试验资料可作为产品审批及标定用，但不能代替实际的稳定性资料。
7.1应制定稳定性检定规划，包括在规定效期全过程中，每间隔一定时间进行制品的物理化学完整性试验(如断裂或聚合)，效力试验，无菌试验，以及水份、pH和防腐剂的稳定性的测定。
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7.2确保制品生物活性的稳定性试验(例如定量体外效力试验)应包括厂内参比品。如可能，在试验的全过程中只使用一批试验抗原(如：纯化的抗原、细胞或组织)。应用定量效力试验使对生物活性进行有意义的比较成为可能。
7.3加速稳定性试验，即将制品贮存在温度高于常规贮存温度后的稳定性试验，可能有助于鉴定及建立稳定性指示试验。表示稳定性的特定参数应通过对每一批制品用趋向分析方法进行监测。
7.4由稳定性试验的条件和结果确定产品的贮存条件及效期。
8临床前研究
由于生产条件或配方的改变可引起制品生物活性的明显变化。因此，建议在临床前研究中使用的单抗应与临床试验中拟使用的单抗的生产工艺一致。
8.1 MAB的交叉反应性试验
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当相同或相关抗原决定簇在人的非预定的细胞或靶组织表达时，可观察到抗体与它们结合。非靶组织结合可能具有严重后果，特别是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时。因此，一般在Ⅰ期临床试验前应经过用人组织或细胞进行交叉反应性或非靶组织结合的实验室检测。对于双特异性抗体，除检测双特异性产品外，还应对每株亲本抗体进行逐个评估。
8.1.1检测交叉反应性的体外试验
目前，用人细胞或组织进行免疫细胞化学及免疫组织化学技术检测，应使用有效的并被确认的新技术(参照5.1.6)。
8.1.2测定交叉反应性的体内试验
当有适当模型时，单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性应在动物中进行一次综合的体内试验。试验结果，特别是对具有溶细胞性的免疫结合物或具有ADCC活性的抗体，通常要求进行更广泛的临床前试验，包括用一种以上动物超剂量及重复剂量进行动物试验。设计临床试验时应考虑对非靶组织的定位。
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8.2临床前药理学和毒性试验
8.2.1设计单克隆抗体临床前安全试验是为了预测在人体中可能的毒性
评估在人体中潜在不良反应副作用的可能性和严重程度，并可能确定安全初始剂量和逐步提高剂量。有关单克隆抗体的临床前试验，包括免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和效应功能。
8.2.2动物毒理学研究
当设计单克隆抗体的毒理学试验时，应考虑如下：
8.2.2.1若被试样品为未偶联抗体，且无合适的动物模型或无携带相关抗原的动物，且与人组织交叉反应性试验明显阴性，则毒理学试验不是必须的。
8.2.2.2动物体内相关抗原的性质与人体内相关抗原的生物学分布、功能及结构应具有可比性。但是，对于所用的动物模型，不必要求对单克隆抗体的抗原密度或亲和力绝对相等。例如，结合力差异可通过增加剂量或服药频率来弥补。应鉴定动物和人之间存在的抗原数，单克隆抗体的抗原亲和力或对单克隆抗体结合的细胞应答反应等方面存在的差异。这可以更精确的推断人用的安全初始剂量，并评估安全范围。
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8.2.2.3对单克隆抗体通常不要求进行常规诱变性的评估。
8.2.2.4拟给育龄妇女反复或长期使用的产品，应该用适当的动物模型进行反复的深入的研究包括致畸试验。
8.2.3药效学和动物药代动力学
8.2.3.1当有动物模型时，则应尽可能证明药理学效应与剂量的依赖性，以及有效剂量的范围，可以更好地预测治疗指数。
药代动力学模型有助于阐明临床前活性及毒性，有助于推荐适当的剂量范围，进而可以改进临床试验的设计方案。这种研究有助于最终确定药代动力学及药效学。
8.2.3.2下列方面可以指导药代动力学及药效学试验动物种类的选择：
8.2.3.2.1最好选择与人有交叉反应或相同靶抗原的动物模型来进行试验。对于抗人而未在动物模型中表达的人抗原或外源抗原(细菌、病毒等)的未偶联单克隆抗体，若不是为了论述生产问题，可以不必用缺乏靶抗原的动物做试验。
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8.2.3.2.2当有抗原结合资料表明灵长类为最相关种属时，则对未偶联的单克隆抗体的试验采用非人灵长类动物是适宜的。
8.2.3.2.3应对使用正常啮齿类动物和鼠异源移植模型精确预测单克隆抗体在人体的药代动力学行为的可能性进行严格评估。异源移植模型对评估单克隆抗体与人体内肿瘤结合的能力更有意义。
8.2.3.3药代动力学参数应用一种或多种试验方法确定(如放射性标记的单克隆抗体应用ELISA和测定放射性的方法来试验)。对于任何类型的免疫结合物，完整的结合物应与游离单克隆抗体和游离配基相区别(如毒素、药物或放射性核素)。
8.2.3.4鼠源抗体对于小鼠为非免疫原性物质，但在人体内具免疫原性，这就使得在鼠, http://www.100md.com
第二十七条 抗生素、动物脏器制品按《新药审批办法》管理。
第二十八条 生物制品工艺重大改革的审查认定由中国药品生物制品检定所负责。
第二十九条 治疗用生物制品临床研究的要求、新生物制品的技术转让、新生物制品研制过程中违规处罚等与《新药审批办法》规定类同的事项均参照《新药审批办法》执行。
第三十条 本办法由国家药品监督管理局负责解释。
第三十一条 本办法自1999年5月1日起施行。
附件：
一、新生物制品临床研究申请表
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二、新生物制品申报资料项目
(一)治疗用新生物制品申报资料项目
(二)预防用新生物制品申报资料项目
(三)体外诊断用品申报资料项目
三、人用重组DNA制品质量控制要点
四、人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点
五、传代细胞系生产生物制品规程
六、预防用新生物制品临床研究的技术要求
七、预防用新生物制品临床研究程序
八、人的体细胞治疗申报临床试验指导原则
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九、人基因治疗申报临床试验指导原则
十、放射免疫分析药盒申报资料项目及要求
十一、用于检测病原体的体外核酸扩增(PCR)诊断试剂盒的申报、审评暂行办法
十二、体外生物诊断试剂报批批量最低要求
十三、新生物制品证书生产申请表
十四、新生物制品转正式生产申请表
十五、新生物制品试行规程转正申请表
十六、新生物制品试行规程转正的具体要求
附件一：
新生物制品临床研究申请表
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名 称：
类 别：
研究单位：
国 家 药 品 监 督 管 理 局 制
研制单位填报项目
品 名中文名
英文名
汉语拼音
剂 型规 格
组成成份 及含量
制备 工艺
适应症与 用法
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活性测定方法和结论
效力实验或药理学 研究项目和结论
实验室 安全性及 毒性研究项目及结论
申请单位
地 址邮政编码
电 话
研制负责人 (签字)日 期年 月 日
附件二：
新生物制品申报资料项目
(一)治疗用新生物制品申报资料项目
1.新生物制品临床研究申请表，附中检所复检报告
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2.研究工作总结
3.新制品名称、选题目的和依据、国内外有关方面研究现状(包括专利)、生产和使用情况综述及主要参考文献
4.生产用菌毒种来源、历史、全面检定及鉴别资料和传代限度试验资料；或工程菌(细胞)构建的详细资料，包括目的基因的获得、表达载体详细结构、宿主菌(细胞)基因型、表型特征等；或杂交瘤株建株详细资料
5.生产用原材料质控要求的有关资料
6.生产工艺研究及确定的有关资料
7.中试产品质量研究总结资料,包括生物活性测定方法试验研究资料
8.工作参考品或对照品的制备及检定资料
9.培养及生产过程中使用对人有潜在毒性物质的检查资料
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10.生产用动物合格证明,研制和中试车间面积、净化、工艺走向图纸，制备和检定用主要仪器、设备等情况，省级药品监督管理部门核实盖章
11.与国内外同类产品质量比较资料
12.内包装材料及选择的依据
13.供临床研究用连续三批中试产品的制造和检定原始记录
14.中试产品制造和检定规程草案及起草说明
15.至少三批中试产品初步稳定性试验资料
16.制剂的处方、工艺及处方依据，辅料的来源及质量标准，有关文献资料等
17.目的基因核苷酸序列、表达质粒酶切图谱以及特异性鉴别资料
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18.目的基因表达产物结构确证资料，包括氨基酸组成分析、N末端15个氨基酸及C末端1～2个氨基酸序列分析、肽图分析、圆二色光谱分析等，或单抗特异性、亲和力、活性等试验资料
19.原始种子库和生产种子库建库资料以及贮存复苏过程中宿主载体表达系统遗传、表达稳定性试验资料，或杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性试验资料
20.生产用种子库外源因子检查(细菌、真菌、支原体和病毒)、细胞基质外源因子检查、核型分析及致瘤性试验资料
21.与治疗作用有关的动物主要药效学研究资料及文献资料
22.动物一般药理学研究资料及文献资料
23.动物药代动力学研究资料及文献资料
24.动物急性(单剂量)毒性研究资料及文献资料
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25.动物长期(重复给药)毒性研究资料及文献资料
26.动物局部用药毒性研究资料及文献资料
27.复方制剂中多种组分对动物药效或毒性影响的研究资料及文献资料
28.遗传毒性研究资料及文献资料
29.生殖毒性研究资料及文献资料
30.致癌研究资料及文献资料
31.药物依赖性研究资料及文献资料
32.免疫毒性和/或免疫原性研究资料及文献资料
33.供临床医师参阅的临床前药理毒理研究结论综述及拟进行的临床研究方案及有关文献资料
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34.新生物制品证书、生产申请表，附临床研究批件
35.临床药代动力学的研究资料及文献资料
36.临床研究负责单位总结的临床研究资料，并附各临床研究单位的分报告等资料
37.制定保存条件及效期的稳定性试验资料
38.连续三批试产品原始制检记录及中检所复核报告
39.制造和检定试行规程及起草说明
40.内包装材料及选择的依据
41.使用说明书及包装、标签样稿
42.临床研究批件要求完成工作的完成情况及试验资料
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43.生产用原材料、试剂、化学药品的规格及标准
44.生产车间的GMP认证证书
45.临床前研究工作简要总结
46.新生物制品转正式生产申请表，附试生产批件、制造和检定试行规程、使用说明书
47. Ⅳ期临床研究总结资料，并附各临床研究单位的分报告等资料
48.试生产批件上要求完成工作的完成情况及试验资料
49.试生产工作总结，包括试生产概况、产量及全面质量检定结果等
50.连续3～5批试制品的原始制检记录及中检所复检报告
51.修改后的制造及检定试行规程和使用说明书，以及修改说明并提供有关试验资料
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52.连续3～5批试制品的稳定性考核资料及所有试制品留样考核结果总结关于申报资料项目的几点说明：
1.不包括基因治疗和体细胞治疗制剂。
2.每份研究资料后面都应注明试验设计者、试验参加者、试验单位、试验日期、原始资料保存处和联系人等。
3.药学：
1)常规方法生产制品申报临床资料需报资料1～16项，采用DNA重组技术或杂交瘤技术制备制品尚需申报17～20项(I、II类制品)；申报新药证书、试生产需报资料34～45项；转正式生产需报资料46～52项。13项中应说明试制和检定用主要仪器、设备、环境条件等。
2)血液制品尚需增加病毒灭活工艺验证，请参照"血液制品去除或灭活病毒方法及其验证和论证程序"。
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3)特殊申请申报资料根据不同品种而定。
4)单抗及修饰单抗详细要求参照"人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点"。
5)Ⅲ、Ⅳ类制品根据重大生产工艺改革情况或剂型、途径改变情况而减少申报项目。
6)V类制品主要申报1～3和41项。
4.药理毒理研究：
1)许多新生物制品具有较强的种属特异性、免疫原性等生物学特性，因此，申报资料的21～33项，对某些新生物制品可能涉及到选择相关动物种属(指受试物在此类动物体内能通过表达的受体或抗原决定簇产生药理活性)进行体内外试验。有时只能确定一种相关动物用于试验。如确无可供选择的相关动物种属，应考虑使用表达人源受体的相关转基因动物或使用同系蛋白。
, 百拇医药 2)未经修饰的人源性血液制品和特异性免疫球蛋白，可免报安全性研究资料(不包括复方制品)；微生态制品只需做一般安全试验，其他安全性研究资料可免报。
3)人体内用单克隆抗体的有关申报资料的毒理研究要求，可参考"人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点"(附件四)中有关临床前研究部分。
4)对第28项的说明：常规使用的遗传毒性研究方法不适用于生物技术药物，因此可免做。但如果对产品有某些担心(例如结合蛋白产品中存在有机联接物)，应考虑用相关的或新建立的方法进行研究。
5)对第29项的说明：可根据产品的情况、临床适应症和预期使用的病人群体决定是否进行该项研究。
6)对第30项的说明：常规使用的致癌研究方法一般不适用于生物技术药物，然而有些如生长因子、免疫抑制剂等产品，应根据临床用药时间、病人群体和生物活性对其进行潜在致癌性的评价。如具有加强或诱导转化细胞增生和克隆扩增潜力的产品可能具有致瘤性，可用相关的恶性或正常细胞和动物模型进行研究。
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7)对第32项的说明：免疫毒性研究主要考察拟用于刺激或抑制免疫系统的某些生物技术药物，因其可能影响细胞介导的免疫或改变靶细胞表面抗原的表达(可能导致自身免疫)。
免疫毒理学评价的一个方面还应包括评价潜在的免疫原性，许多生物技术药物对动物有免疫原性，其评价可在重复给药毒性试验中检测抗体以助说明。
一般对蛋白质产品呈阳性的豚鼠过敏试验结果不能预测人体反应，因此，对这类产品进行该试验无必要。
8)对申报资料21～33项的有关具体技术要求可进一步参考"药理毒理申报资料技术要求"指导原则的有关章节。
9)第五类制品主要申报21、22、24、25、26、33项(延长用药周期和/或增加剂量者)。
(二)预防用新生物制品申报资料项目
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1.新生物制品临床研究申请表，附中检所复检报告
2.研究工作总结
3.新制品名称、选题目的和依据、国内外有关方面研究现状(包括专利)、生产和使用情况综述及主要参考文献
4.生产用菌、毒种来源、历史、全面检定及鉴别资料和传代限度试验资料
5.生产用菌、毒种毒力(或毒性)及毒力稳定性、传代限度试验研究资料
6.生产用菌、毒种原始种子库和生产种子库建库及保存条件、贮存资料
7.生产用菌、毒种原始种子库和生产种子库外源因子检查资料(细菌、真菌、支原体和病毒)
8.细胞基质外源因子检查、核型分析及致瘤性试验资料以及传代使用代次限度试验资料
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9.抗原性试验研究资料
10.免疫原性或效力试验研究资料
11.过敏原性研究资料
12.生产工艺确定及质量检定方法研究资料
13.中试产品质量及产量全面总结资料
14.参考品或对照品制备及检定资料
15.至少三批中试产品初步稳定性试验资料
16.培养及生产、纯化过程中加入对人有潜在毒性物质检查资料
17.供临床研究用连续三批中试产品的制造和检定原始记录
18.中试产品制造和检定规程草案及起草说明
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19.拟进行的临床研究方案及有关文献资料
20.生产用动物合格证明,研制和中试车间面积、净化、工艺走向图纸，制备和检定用主要仪器、设备等情况，省级药品监督管理部门核实盖章
21.与原制品比较资料
22.内包装材料及选择的依据
23.工程菌(细胞)构建的详细资料，包括目的基因的获得、表达载体详细结构、宿主菌(细胞)基因型、表型特征等
24.原始种子库和生产种子库建库资料以及贮存复苏过程中宿主载体表达系统稳定性试验资料
25.目的基因核苷酸序列及酶切图谱以及特异性鉴别资料
26.目的基因表达产物结构确证资料，包括氨基酸组成分析、N末端15个氨基酸及C末端1～2个氨基酸序列分析、肽图分析等
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27.残余人DNA含量、宿主蛋白残余量测定
28.新生物制品证书、生产申请表，附临床研究批件
29.临床研究负责单位总结的临床研究资料，并附各临床研究单位的分报告等资料
30.制定保存条件及效期的稳定性试验资料
31.连续三批试产品原始制检记录及中检所复核报告
32.制造和检定试行规程及起草说明
33.内包装材料及选择的依据
34.使用说明书及包装、标签样稿及有关说明
35.临床研究批件要求完成工作的试验资料
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36.生产用原材料、试剂、化学药品的规格及标准
37.试生产车间的GMP认证证书
38.临床前研究工作简要总结
39.新生物制品转正式生产申请表，附试生产批件、制造和检定试行规程、使用说明书
40.Ⅳ期临床研究总结资料，并附各临床研究单位的分报告等资料
41.试生产批件上要求完成工作的试验资料
42.试生产工作总结，包括试生产概况、产量及全面质量检定结果等
43.连续3～5批试制品的原始制检记录及中检所复检报告
44.修改后的制造及检定试行规程和使用说明书，以及修改说明并提供有关试验资料
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45.连续3～5批试制品的稳定性考核资料及所有试制品留样考核结果总结
说明：
1.不包括DNA疫苗。
2.每份研究资料后面都应注明试验设计者、试验参加者、试验单位、试验日期、原始资料保存处和联系人等。
3.临床研究申请：用常规方法制备菌苗、疫苗、类毒素申报资料1～22项，用DNA重组技术产品尚需增加申报23～27项。
4.新生物制品证书、试生产申请需报28～38项；转正式生产申请需报39～45项。
(三)体外诊断用品申报资料项目
1.新生物制品证书/生产申请表。
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2.研究工作总结。
3.新体外诊断用品的名称，选题目的和依据，国内外有关的研究现状及生产使用情况综述及主要参考文献资料，专利检索资料。
4.产品的研制报告：包括原材料的选择、制造，生产工艺过程的确定，成品质控标准的建立，成品性能评价(灵敏度,特异性精密度等)，与国内外同类产品进行比较等试验资料。
5.连续生产三批产品的原始制造检定记录复印件，及中国药品生物制品检定所对这三批产品进行检定的报告书。
6.稳定性试验资料：至少三批产品在储存温度条件下保存至效期后两个月的试验资料，及37℃保存的试验资料。检测项目应按成品检定标准进行。
7.临床使用考核资料：选择三家以上省级医疗卫生单位用统一的方案进行考核，提供一份总的临床考核总结报告及各单位的分报告，附临床考核原始数据。病例数一般不少于1000例，非常见病可酌减，但要有统计学意义。
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8.制造检定规程草案：参照《中国生物制品规程》的格式书写。
9.使用说明书：包括中英文名称，规格，前言(原理、用途、特点)，试剂盒组份、操作步骤，结果判定，注意事项，保存条件及有效期，生产单位名称、地址、电话、邮编等。
10.包装材料及各组份标签实物或样稿。
11.《药品生产企业许可证》复印件。生产车间验收文件复印件。
12.转正式生产申请报告。
13.原批准的试生产批件及试行制检规程、使用说明书。
14.试生产期间完善生产工艺、生产、销售情况总结及临床使用情况分析总结。
15.对试生产批件中要求进行的研究工作完成情况的总结。
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16.提供重新修改的产品制检规程和使用说明书。
17.中国药品生物制品检定所对连续试生产的三批样品的检定报告书及原始生产制造检定记录复印件。
关于申报资料项目的几点说明：
1.自制原材料为单克隆抗体或基因工程产品，申报资料要求参照附件三、四。
2.放射免疫分析药盒申报资料项目及要求见附件十。
3.用于检测病原体的体外核酸扩增(PCR)诊断试剂盒申报资料项目及要求见附件十一。
4.体外诊断用品证书/生产申请需报1～11项，试生产转正式生产申请需报12～17项。
5.试剂盒检定所用的参比品由中国药品生物制品检定所提供和/或认可。
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6.CUT OFF值的确定：正常人标本测定人数应在400人份以上，所得数据经统计学处理。
7.评价体外诊断试剂盒试验标准应包括两方面：真实性和可靠性。
①真实性(Validity)：真实性指测量值与实际值符合的程度。(诊断试验应能提供哪些人确实有病(真阳性)和哪些人确实无病(真阴性)的指标，这是试验的真实性)。评价真实性的两个指标：灵敏度(Sensitivity)及特异度(Specificity)。
灵敏度是试验检出有病(即阳性)的人占病人总数的比例，即真阳性率。特异度指试验检出无病(即阴性)的人占无病者总数的比例，即真阴性率。
表 评价一个试验真实性的资料归纳表
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试 验 有病(真阳性) 无病(真阴性) 合 计
────────────────────────────────
阳 性 A B A+B
────────────────────────────────
阴 性 C D C+D
────────────────────────────────
总 数 A+C B+D A+B+C+D
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用下列公式表示：
灵敏度(真阳性率)=A/(A+C)×100%
特异度(真阴性率)=D/(B+D)×100%
假阳性率=B/(B+D)×100%
假阴性率=C/(A+C)×100%
除上述指标外，还可计算下列几种指标：
1)粗一致性(Crude agreement)=(A+D)/(A+B+C+D)×100%
2)调整一致性(adjusted agreement)=1/4{A/(A+B)+A/(A+C)+D/(C+D)+D/(B+D)×100%}以上两个指标均说明诊断试验阳性与阴性结果均正确的百分比，亦反映试验的真实性。
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3)约登指数(youden's index)=A/(A+C)+D/(B+D)-1约登指数是将灵敏度与特异度之和减1，指数可从0～1。约登指数愈大，其真实性亦愈大。
②可靠性(reliability)：可靠性是指试验在相同条件下重复试验获得相同结果的稳定程度。如试验结果为均数，可用变异系数(coefficient of Variation)表示。公式为
CV=S/X×100%
S为标准差，X为平均值
③预示值(Predictive value)：预示值是说明试验的诊断价值。试验阳性的预示值是指试验阳性者中患病者(真阳性)的可能性；试验阴性的预示值是指试验阴性者中为非病人(真阴性)的可能性。可用下列公式表示：
阳性试验的预示值=A/(A+B)×100%
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阴性试验的预示值=D/(C+D)×100%
附件三：
人用重组DNA制品质量控制要点
1.引言
由于分子遗传学、核酸化学及重组DNA(rDNA)技术的迅速发展，现已能够确定和获得许多天然活性蛋白的编码基因，将其插入表达载体或引入某种宿主细胞后，能有效地表达该基因产物，再经分离、纯化和检定，可得到用于预防和治疗某些人类疾病的制品，诸如现有的乙型肝炎疫苗、胰岛素、生长激素、干扰素等。
用不同于常规方法的rDNA技术生产的制品，是近年来出现的新产品，评价其安全性和有效性亦不同于常规方法。目前在这方面的生产和质量控制经验不多，而且这一领域中的知识和技术还在不断发展，但是，为了有利于这类制品在我国的研究和发展，并为这类制品的审评提供依据，有必要制定一个原则性指导文件，以保证在人群中试验或应用时安全有效。
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本"质量控制要点"(以下简称《要点》)不可能面面俱到，可能有许多专门技术问题会出现，对于这类问题或某一特定制品，则应视具体问题具体研究决定。本《要点》亦将随科学技术发展和经验积累而逐步完善。
2.总则
2.1本《要点》适用于rDNA技术生产并在人体内应用的制品。
2.2凡属与一般生物制品有关的质量控制，均按现行《中国生物制品规程》执行。
有关生产设施的要求应参照国家药品监督管理局《药品生产质量管理规范》1999年版执行。
3.质量控制要求
3.1原材料的控制
3.1.1表达载体和宿主细胞
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应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定，表达载体的构建、结构和遗传特性。应说明载体组成各部分的来源和功能，如复制子和启动子来源，或抗生素抗性标志物。提供至少包括构建中所用位点的酶切图谱。应提供宿主细胞的资料，包括细胞株(系)名称、来源、传代历史、检定结果及基本生物学特性等。
应详细说明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，是否整合到染色体内，拷贝数。应提供宿主和载体结合后的遗传稳定性资料。
3.1.2克隆基因的序列
应提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细叙述。
3.1.3表达应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。
3.2生产的控制
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3.2.1主细胞库(MASTER CELL BANK)
rDNA制品的生产应采用种子批(SEED LOT)系统。从已建立的主细胞库中，再进一步建立生产细胞库(WCB)。
含表达载体的宿主细胞应经过克隆而建立主细胞库。在此过程中，在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不同细胞(菌种)；一个工作人员亦不得同时操作两种不同细胞或菌种。
应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命。应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据。采用新的种子批时，应重新作全面检定。
高等真核细胞用于生产时，细胞的鉴别标志，如特异性同功酶或免疫学或遗传学特征，对鉴别所建立的种子是有用的。有关所用传代细胞的致肿瘤性应有详细报告(参照：WHO生物制品规程No.37)。如采用微生物培养物为种子，则应叙述其特异表型特征。
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一般情况下，在原始种子阶段应确证克隆基因的DNA序列。但在某些情况下，例如传代细胞基因组中插入多拷贝基因。在此阶段不适合对克隆基因作DNA序列分析。在此情况下，可采用总细胞DNA的杂交印染分析，或作mRNA的序列分析。对最终产品的特征鉴定应特别注意。
种子批不应含有可能致癌因子(在使用情况下)，不应含有感染性外源因子，如细菌、支原体、真菌及病毒。
但是有些细胞株含有某些内源病毒，例如逆转录病毒，且不易除去。但当已确知在原始细胞库或载体部分中污染此类特定内源因子时，则应能证明在生产的纯化过程可使之灭活或清除。
3.2.2有限代次生产
用于培养和诱导基因产物的材料和方法应有详细资料。对培养过程及收获时，应有灵敏的检测措施控制微生物污染。
应提供培养生长浓度和产量恒定性方面的数据，并应确立废弃一批培养物的指标。根据宿主细胞/载体系统的稳定性资料，确定在生产过程中允许的最高细胞倍增数或传代代次，并应提供最适培养条件的详细资料。
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在生产周期结束时，应监测宿主细胞/载体系统的特性，例如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度、含插入基因的载体的酶切图谱。一般情况下，用来自一个原始细胞库的全量培养物，必要时应做一次基因表达产物的核苷酸序列分析。
3.2.3连续培养生产
基本要求同3.2.2。
应提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。每批培养的产量变化应在规定范围内。对可以进行后处理及应废弃的培养物，应确定指标。从培养开始至收获，应有灵敏的检查微生物污染的措施。
根据宿主/载体稳定性及表达产物的恒定性资料，应规定连续培养的时间。如属长时间连续培养，应根据宿主/载体稳定性及产物特性的资料，在不同间隔时间作全面检定。
3.2.4纯化
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对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除。
如采用亲和层析技术，例如用单克隆抗体，应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。
对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。
关于纯度的要求可视制品的用途和用法而确定，例如，仅使用一次或需反复多次使用；用于健康人群或用于重症患者；对纯度可有不同程度要求。
3.3最终产品的控制
应建立有关产品的鉴别、纯度、稳定性和活性等方面的试验方法。检测的必要性和纯度要求取决于多种因素：产品性质和用途、生产和纯化工艺及生产工艺的经验。一般说来下列试验对控制产品质量是可以采用的。
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3.3.1物理化学鉴定
3.3.1.1氨基酸成份分析
完整的氨基酸成份分析结果，应包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。氨基酸成份分结果应为三次分别水解样品测定后的平均值。
3.3.1.2部分氨基酸序列分析
部分氨基末端序列分析(N端15个氨基酸)可作为rDNA蛋白质和肽的重要鉴别指标。
3.3.1.3肽图分析
肽图分析可作为与天然产品或参考品作精密比较的手段。与氨基酸成分和序列分析结果合并，可作为蛋白质的精确鉴别。对含二硫键的制品，肽图可确证制品中二硫键的排列。
3.3.1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及等电聚焦
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PAGE及等电聚焦有助于证实蛋白质和肽类的纯度和分子量，亦可作为鉴别试验。
PAGE应包括在还原和非还原条件下试验，且应有适宜的分子量标记物作参比。凝胶带
应用灵敏的方法染色，例如银染法，可测定微量蛋白质，亦有助于检出非蛋白质物质，例如核酸、糖及脂类。对分子量小于8000的肽类，PAGE测得的分子量可能不准确。
3.3.1.5高效液相色谱(HPLC)
测定蛋白质和肽类的纯度，HPLC是一种有用的方法，在某些情况下，还可用来评定其分子构型和用作鉴别试验。
3.3.1.6残余细胞DNA测定
必须用敏感的方法测定来源于宿主细胞的残余DNA含量，这对于用哺乳动物传代细胞(转化的细胞系)生产的制品尤为重要。一般认为残余DNA含量小于100pg/剂是安全的，但应视制品的用途、用法和使用对象而决定可接受的限度。
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3.3.1.7其它外源性物质
例如，用单克隆抗体(鼠源)亲和层析纯化的制品，应测定可能存在的鼠IgG，细胞培养生产的制品，应测定残余小牛血清含量(以p.p.m表示)；在培养及纯化过程中所添加的可能有害物质，亦应有相应的测定数据。
3.3.2生物学测定
3.3.2.1鉴别试验
在可能情况下，应用参考品将rDNA制品与天然产品通过生物学比较试验，确定其与天然产品是一致的。
3.3.2.2效价测定
采用国际或国家参考品，或经过国家检定机构认可的参考品，以体内或体外法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位。
3.3.2.3特异比活性测定
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在测定生物学活性的基础上，对有些制品还应测定其特异比活性，以活性单位/重量表示之。
3.3.2.4热原质试验
应采用注射家兔法或鲎试验法(LAL)作热原质检测(《中国生物制品规程》)，控制标准可参照天然制品的要求。
3.3.2.5病毒污染检查
应采用适当的培养基质和培养条件，检查可能污染的病毒，应证实最终制品不含外源病毒。
3.3.2.6无菌试验
参照现行《中国生物制品规程》进行无菌试验，应证实最终制品无细菌污染。
3.3.2.7抗原性物质检查
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在有必要时，如制品属大剂量反复使用者，应测定最终制品中可能存在的抗原性物质，如宿主细胞、亚细胞组分及培养基成份等。患者反复接受大剂量的这类制品时，应密切监测由这些抗原可能产生的抗体或变态反应。
3.3.2.8毒性试验
可参照现行《中国生物制品规程》执行。
4.临床前安全性评价
临床前安全性试验的目的主要是确定新制品是否会在人体引起未能预料的不良反应。但是，用于一般化学药物的传统安全性或毒性试验对rDNA产品不一定适用，用传统毒性试验来评价rDNA产品往往有困难，并受多种因素的影响。例如，某些蛋白质，如干扰素，具有高度种属特异性，这种人的蛋白质对人的药理学活性远超于对动物的活性，而且人的蛋白质氨基酸序列，常常与来自其它种系的蛋白质不同，例如糖基就不一样。因而由基因工程技术所制备的蛋白质或肽类往往会在人体以外的其它宿主中产生免疫应答，其生物学效应有所改变，并可能因形成免疫复合物而导致有毒性反应，而这样产生的毒性反应与人体安全性显然无关。
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综上述理由，对rDNA产品的临床前安全性试验要求，难以一概而论，应采取较为灵活的处置方法。除了一般生物制品的毒性试验要求之外，其它如长期毒性试验、药代动力学试验、药理学试验、毒理学试验，以及致畸和致突变等试验，应根据制品性质，与国家检定机构及药品审评中心商定所需进行的试验项目和方法，以及判定标准。
5.临床试验
用rDNA技术所生产的制品必需经过临床试验，以评价其安全性和有效性。
附件四：
人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点
本品系用杂交瘤技术将抗原免疫动物后，取脾或外周血淋巴细胞或经体外免疫获得的免疫淋巴细胞与相应的骨髓瘤细胞融合建立稳定分泌特异抗体的杂交瘤细胞株，通过体内法或体外培养法制备单克隆抗体，经提取纯化获得的特异性单克隆抗体制剂。用于有关疾病的诊断或治疗。
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1杂交瘤细胞
1.1亲本细胞
1.1.1骨髓瘤细胞
SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体条数，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。
1.1.2免疫亲代细胞
经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。
应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。
适宜的免疫方法及免疫淋巴细胞制备的方法。
1.2细胞融合
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末次免疫后第3天取脾制成细胞悬液，与骨髓瘤细胞按一定的比例混合并在融合剂作用下或在电融合仪中按常规法或其他适宜的方法进行细胞融合。
1.3克隆化
用ELISA或其他适宜方法筛选出分泌目的抗体的杂交瘤经有限稀释法或其他适宜方法对其进行克隆化，直至获得具有稳定分泌单克隆抗体能力的杂交瘤细胞系。
1.4杂交瘤细胞检定
1.4.1抗体分泌稳定性
经克隆化及连续传代后检查。连续克隆化后至检测单克隆抗体阳性率达100%，并在体外传代3个月以上细胞株能保持稳定的分泌抗体。
1.4.2细胞核学特征
检查细胞分裂中期染色体。应符合杂交瘤细胞的核型。
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1.4.3鼠源病毒检查
按附录1要求检测鼠源病毒。
1.4.3.1细胞接种法
细胞及培养上清分别接种人2BS细胞、Vero细胞，接种量为107。样品接种细胞后，传两代，制片，用IFA法检测病毒抗原。
1.4.3.2动物接种法
样品接种出生24小时以内乳小鼠两窝(至少10只)，15～20g成年小鼠10只，300～350g的豚鼠5只。每只动物腹腔接种107活细胞。观察4周，存活率应在80%以上；另外接种对淋巴脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)敏感的成年小鼠10只，脑内接种106活细胞，观察4周，存活率应在80%以上。用ELISA或其他适宜的方法检测血清中病毒抗体。
1.4.3.3鸡胚接种法
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样品接种SPF鸡胚尿囊腔和卵黄囊。每种途径至少10只，每只接种106活细胞，孵育5天，用豚鼠和鸡红血球做HA法检测病毒血凝素，同组鸡胚中至少80%保持健康并存活，试验有效。单抗制品不应有鼠源病毒污染。
对产生单克隆抗体的鼠类细胞系，一般认为具有产生传染性鼠类反转录病毒的能力，可以不做反转录病毒检测，但应有资料证明制造工艺中能去除或灭活反转录病毒。
1.4.4支原体检查
1.4.4.1培养法
细胞及培养上清分别接种支原体培养基，按《生物制品检定标准操作细则》进行。应设阴、阳性对照。
1.4.4.2 DNA荧光染色法
细胞及培养上清分别与指示细胞共同培养，按《生物制品检定标准操作细则》进行。
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1.4.5无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2单克隆抗体的检定
2.1免疫球蛋白类及亚类
用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。
2.2亲和力
用适宜的方法测定单抗的亲和常数或相对亲和力。
2.3特异性
测定单抗对靶抗原的特异性；分析单抗识别的抗原决定簇。
2.4交叉反应
按附录2要求。
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免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的成年人及胎儿各脏器组织测定。来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验。
2.5效价测定
用ELISA法或其他特异性方法测定。
3其他原材料
3.1细胞培养用小牛血清
支原体检测应为阴性。经小量试验适于杂交瘤细胞生长。
3.2培养液
应有培养液来源，质量指标。
3.3化学试剂
规格应达到分析纯以上。
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4细胞库的建立和单克隆抗体的生产
为了保证长期、稳定的生产出符合要求的高质量单抗，首先要建立高标准的细胞库。同时单抗生产场所必须符合GMP要求，洁净无污染，生产人员无传染病，不得从事其他可导致传染原污染单抗制剂的工作；无关人员不得进入生产区内。在同一车间内，不得同时生产其他无关单抗。
4.1细胞库
建立原始细胞库和生产细胞库，几种细胞株用于同一目的生产时，应分别建立细胞库及种子批。
4.1.1原始细胞库
为杂交瘤细胞建立时较原始的细胞管，即融合细胞管、一次克隆及多次克隆的细胞管。
4.1.2种子细胞库
由原始细胞库中建株细胞扩大培养冻存的细胞种子。每一批细胞管数不应少于20支，
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贴上标签放入液氮中保存。种子批应进行外源因子检查，包括细菌、真菌、支原体及病毒污染的检查。
4.1.3生产细胞库
经检定合格后的杂交瘤细胞按生产条件大量培养、冻存的细胞管为生产细胞库。每一生产细胞批细胞管数不少于10支，每次生产腹水时取生产细胞管一支复苏、扩增及生产，不再回冻。细胞库应详细纪录存放细胞管位置、代数、管数、冻存、复苏的情况，并有专人负责。同时要进行各种外源因子检测，保证没有污染。
4.2单克隆抗体制备
4.2.1小鼠腹水法
4.2.1.1小鼠
制备腹水必需使用SPF级小鼠，生产用鼠必需经过检查，应无鼠源病毒污染，并有合格证明。在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者均应废弃。
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4.2.1.2动物实验设施
动物实验设施应有相关部门颁发的二级以上的合格证。
4.2.1.3细胞扩大培养
取生产批细胞管一支复苏，加营养液进行扩大培养，一支生产细胞只用一次，不再冻存。
4.2.1.4细胞接种
制备腹水均须在无菌条件下完成。注射杂交瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射液体石蜡或降植烷0.5ml。一般在1周后每只小鼠注射杂交瘤细胞1～3×106。
4.2.1.5腹水的采集
注射细胞后一般7～10天，或在小鼠濒死前一次性采集腹水，亦可多次收集。离心分离出上清即为粗提抗体，注明批号、采集日期，置-20℃保存。
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4.2.2细胞培养法
可以采用发酵罐培养，亦可用细胞培养瓶培养收采上清液制备单克隆抗体。
4.2.2.1种子细胞
来源于生产细胞库。
4.2.2.2培养基
用无牛血清或低牛血清培养基，不能用β-内酰胺类抗生素。
4.2.2.3抗体收集
可一次性收集，也可采用连续收集法。每一支安瓿种子细胞扩大培养后收集的上清为一个批号
4.3粗制抗体检测
无论是小鼠腹水法还是细胞培养法制备的单克隆抗体，都需要进行如下检定。
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4.3.1无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
4.3.2支原体检查
按1.4.4项进行。
4.3.3鼠源病毒检查
按1.4.3项进行。
4.3.4效价测定
用ELISA法或其他特异性检测方法测定。合格的用于抗体纯化。
4.4抗体纯化
可采用盐析法、分子筛层析、离子交换等适宜的方法。
4.4.1尽可能选用一些不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件。
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4.4.2应验证所用的纯化方法能去除可能存在的非目标产物污染，如不需要的免疫球蛋
白分子、宿主DNA、病毒及用于生产腹水抗体的刺激物(如降植烷、液体石蜡)。
4.4.3连续生产(至少3批)的各批产品必须符合质检要求，批间具有良好的重复性。
4.5纯化后处理
4.5.1灭活
必要时56℃水浴灭活30分钟，离心收集上清。
4.5.2合并
不同亚批的合格制品合并后应在2～8℃放置一个月以上，去除部分不稳定蛋白。
4.5.3除菌分装
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将经灭活的单抗用0.22μm滤膜过滤，过滤后进行分装。
5检定
5.1半成品
5.1.1活性检测
用ELISA法或其他特异性检测方法测定。抗体活性应≥参比品。
5.1.2纯度测定
5.1.2.1电泳法
还原和非还原条件SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定抗体纯度。扫描后计算出免疫球蛋白含量，含量应达到95%以上，二聚体≤10%。
5.1.2.2 HPLC法
纯度应≥95%。
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5.1.3多聚体测定
用FPLC或HPLC法，用适宜的分子筛层析，多聚体应≤10%。
5.1.4蛋白质含量测定
用Lowry法或其他适宜的方法测定。
5.1.5DNA含量测定
用DNA分子杂交法。提取待检制品中的DNA，用骨髓瘤细胞制备的DNA探针与待检样品进行杂交。以不同含量的骨髓瘤细胞DNA作为工作标准，每一剂量残余DNA含量不应超过100pg。
5.1.6交叉反应性测定
用免疫组织化学及细胞化学方法检查。应提供3批单抗与人体组织器官的交叉反应性材料。结果不应与人体组织器官发生交叉反应。如肿瘤相关抗原单抗，应进行各种肿瘤组织的交叉反应测定。
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5.2成品检定
5.2.1物理检查
液体制剂应为接近无色微带乳光的澄清液体，不应含有异物、混浊或摇不散的沉淀。
5.2.2化学检查
5.2.2.1 pH值
电位法测定，pH值应为7.0±0.5。
5.2.2.2蛋白质含量
用Lowry法测定，含量应在标示值的90%～110%之内。
5.2.3活性测定
按5.1.1项进行。
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5.2.4无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
5.2.5安全试验
5.2.5.1豚鼠试验
用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品5ml，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
5.2.5.2小白鼠试验
用体重18～20g小白鼠10只，每只腹腔注射检品0.5ml，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
5.2.6热原质试验
, 百拇医药 按照《生物制品热原质试验规程》进行。家兔注射剂量＝(人用剂量÷50)×20×家兔体重(kg)。不应有致热作用。也可用鲎试剂法，1mg/ml蛋白浓度不应检测出有凝集活性。
5.2.7异常毒性试验
每批成品应进行异常毒性试验。腹腔注射5只体重17～22g小鼠和2只体重250～350g的豚鼠，每只小鼠注射1个人用剂量，但不超过1ml；每只豚鼠注射剂量不超过5ml。动物至少存活7天以上，应无任何异常中毒反应。
5.2.8水分测定
产品如为冻干制品，应进行残余水分测定，其含量应≤3%。
6经修饰的单克隆抗体
为了提高单克隆抗体在治疗和体内诊断中的作用，常用单抗与毒素、药物、放射性核素或其他物质偶联形成免疫结合物，或在同一段多肽链中包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重组蛋白来获得。研究者除对前面提到的有关未偶联单克隆抗体(未修饰单克隆体)的要求外，还应提供下列内容：
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6.1免疫结合物的构建
应提供构建免疫结合物所用试剂和过程的详细资料，包括：
6.1.1描述与单克隆抗体连接的成分如：毒素、药物、酶及细胞因子，包括：所有成分的来源、结构、制法、纯度及特征。
6.1.2制备免疫结合物所用化学试剂的描述，如连接剂和螯合剂。这些资料应该包括试剂来源、制备方法，以及合成或纯化时残留杂质的测定等内容。还应提供合成反应途径的图解，以及与免疫结合物制备中所用化学试剂毒性相关资料。
6.1.3在确定成品的标准时应首先确定该原料与抗体的平均结合率及每个抗体被结合部分的数量，并揭示免疫球蛋白置换数量、效力和稳定性间的关系。
6.1.4用重组DNA技术制备的制品(如来源于转染细胞系或微生物培养基，嵌合的、易形的，互补决定区[CDR]接合的及单链Fv抗体，以及重组免疫结合物)应提供构建和制备过程的全部资料。重组免疫结合物的稳定性应认真研究。因聚合物形成构形改变或变性而减弱了特异免疫反应性(如通过重组Fvs形成"双抗")可能导致药代动力学的改变和/或与非靶组织结合。
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6.2免疫结合物的纯度
6.2.1应采取特殊措施保证抗体尽可能无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因这些污染物质在构建免疫结合物过程中，能与核素、毒素或药物发生反应。
6.2.2应规定最终产品中游离抗体或游离组分的限量。活性中间体应被灭活或去除。
6.3免疫结合物的免疫反应性，效力及稳定性
毒素或药物偶联至抗体上会改变其中任一成分的活性。
6.3.1应采用适当的方法评估偶联前后的免疫反应性。
6.3.2免疫结合物非免疫球蛋白成分的活性应在适当的时候用效力试验来进行评估(例如，毒素、细胞因子或酶等)，用于造影的放射性免疫结合物除外。
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6.3.3免疫结合物构建后，应确定免疫反应性变化的百分率限值，并作为产品规格的组成部分。
6.3.4应通过在合并的人血清中37℃无菌条件下孵育，来检测免疫结合物在体外的稳定性。假如所用抗凝剂不会影响免疫结合物的稳定性，血浆可以用来替代血清。经过规定间隔时间分析样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度。应详细说明评估产品稳定性的条件及所用阴、阳对照。
6.4与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题
放免结合物应用标准化的、严格控制并经过验证的方法制备。应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标记的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的方法。
6.4.1放射性标记单克隆抗体的初始研究用新药申报包含连续3次放射标记试生产的分析结果，应证明所制备的产品未改变免疫特异性、无菌、无热原质。放射性标记试生产应由在研究中对单克隆抗体进行放射性标记及使用试剂的同一组人员进行。
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6.4.2制备免疫结合物时应使用放射性药品及同位素并应提供其无菌及无热原质的分析证书及横向参比的信函。
6.4.3在标记试生产过程中，应测定最终产品中共价结合的和游离的同位素的浓度，以及标记试剂及其分解产物的残留水平。
6.4.4应描述给每一个病人应用前后进行的质控试验。
6.4.5适当的时候，应检测免疫结合物形成胶体的情况，并对其进行限定。
7产品稳定性及效期
产品稳定性应满足临床方案制定的要求。加速稳定性试验资料可作为产品审批及标定用，但不能代替实际的稳定性资料。
7.1应制定稳定性检定规划，包括在规定效期全过程中，每间隔一定时间进行制品的物理化学完整性试验(如断裂或聚合)，效力试验，无菌试验，以及水份、pH和防腐剂的稳定性的测定。
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7.2确保制品生物活性的稳定性试验(例如定量体外效力试验)应包括厂内参比品。如可能，在试验的全过程中只使用一批试验抗原(如：纯化的抗原、细胞或组织)。应用定量效力试验使对生物活性进行有意义的比较成为可能。
7.3加速稳定性试验，即将制品贮存在温度高于常规贮存温度后的稳定性试验，可能有助于鉴定及建立稳定性指示试验。表示稳定性的特定参数应通过对每一批制品用趋向分析方法进行监测。
7.4由稳定性试验的条件和结果确定产品的贮存条件及效期。
8临床前研究
由于生产条件或配方的改变可引起制品生物活性的明显变化。因此，建议在临床前研究中使用的单抗应与临床试验中拟使用的单抗的生产工艺一致。
8.1 MAB的交叉反应性试验
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当相同或相关抗原决定簇在人的非预定的细胞或靶组织表达时，可观察到抗体与它们结合。非靶组织结合可能具有严重后果，特别是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时。因此，一般在Ⅰ期临床试验前应经过用人组织或细胞进行交叉反应性或非靶组织结合的实验室检测。对于双特异性抗体，除检测双特异性产品外，还应对每株亲本抗体进行逐个评估。
8.1.1检测交叉反应性的体外试验
目前，用人细胞或组织进行免疫细胞化学及免疫组织化学技术检测，应使用有效的并被确认的新技术(参照5.1.6)。
8.1.2测定交叉反应性的体内试验
当有适当模型时，单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性应在动物中进行一次综合的体内试验。试验结果，特别是对具有溶细胞性的免疫结合物或具有ADCC活性的抗体，通常要求进行更广泛的临床前试验，包括用一种以上动物超剂量及重复剂量进行动物试验。设计临床试验时应考虑对非靶组织的定位。
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8.2临床前药理学和毒性试验
8.2.1设计单克隆抗体临床前安全试验是为了预测在人体中可能的毒性
评估在人体中潜在不良反应副作用的可能性和严重程度，并可能确定安全初始剂量和逐步提高剂量。有关单克隆抗体的临床前试验，包括免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和效应功能。
8.2.2动物毒理学研究
当设计单克隆抗体的毒理学试验时，应考虑如下：
8.2.2.1若被试样品为未偶联抗体，且无合适的动物模型或无携带相关抗原的动物，且与人组织交叉反应性试验明显阴性，则毒理学试验不是必须的。
8.2.2.2动物体内相关抗原的性质与人体内相关抗原的生物学分布、功能及结构应具有可比性。但是，对于所用的动物模型，不必要求对单克隆抗体的抗原密度或亲和力绝对相等。例如，结合力差异可通过增加剂量或服药频率来弥补。应鉴定动物和人之间存在的抗原数，单克隆抗体的抗原亲和力或对单克隆抗体结合的细胞应答反应等方面存在的差异。这可以更精确的推断人用的安全初始剂量，并评估安全范围。
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8.2.2.3对单克隆抗体通常不要求进行常规诱变性的评估。
8.2.2.4拟给育龄妇女反复或长期使用的产品，应该用适当的动物模型进行反复的深入的研究包括致畸试验。
8.2.3药效学和动物药代动力学
8.2.3.1当有动物模型时，则应尽可能证明药理学效应与剂量的依赖性，以及有效剂量的范围，可以更好地预测治疗指数。
药代动力学模型有助于阐明临床前活性及毒性，有助于推荐适当的剂量范围，进而可以改进临床试验的设计方案。这种研究有助于最终确定药代动力学及药效学。
8.2.3.2下列方面可以指导药代动力学及药效学试验动物种类的选择：
8.2.3.2.1最好选择与人有交叉反应或相同靶抗原的动物模型来进行试验。对于抗人而未在动物模型中表达的人抗原或外源抗原(细菌、病毒等)的未偶联单克隆抗体，若不是为了论述生产问题，可以不必用缺乏靶抗原的动物做试验。
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8.2.3.2.2当有抗原结合资料表明灵长类为最相关种属时，则对未偶联的单克隆抗体的试验采用非人灵长类动物是适宜的。
8.2.3.2.3应对使用正常啮齿类动物和鼠异源移植模型精确预测单克隆抗体在人体的药代动力学行为的可能性进行严格评估。异源移植模型对评估单克隆抗体与人体内肿瘤结合的能力更有意义。
8.2.3.3药代动力学参数应用一种或多种试验方法确定(如放射性标记的单克隆抗体应用ELISA和测定放射性的方法来试验)。对于任何类型的免疫结合物，完整的结合物应与游离单克隆抗体和游离配基相区别(如毒素、药物或放射性核素)。
8.2.3.4鼠源抗体对于小鼠为非免疫原性物质，但在人体内具免疫原性，这就使得在鼠, http://www.100md.com