尿Tamm-Horsfall蛋白包被细胞检测对肾小管损伤定位诊断的意义
作者：蔡碧涓 冯陶 窦长琪 魏今 华道宥 成方六 卢义侠
单位：蔡碧涓 冯陶 窦长琪 魏今 华道宥 成方六；(北京医科大学泌尿外科研究所 100083)卢义侠(北京医科大学第一医院儿科)
关键词：尿；糖蛋白类；肾小管
提要 用酶联免疫技术检查尿Tamm
提要 用酶联免疫技术检查尿Tamm-Horsfall蛋白包被细胞(THPC)，肾间质小管病患者阳性率为68.7%(11/16)，肾肿瘤为28.2%(13/46)，而肾小球肾炎(17例)及肾盂、输尿管、膀胱疾患(共75例)，全部阴性。提示尿THPC检测有助于尿脱落细胞的肾源定位，是判定肾小管损伤的一项有用指标。
Tamm-Horsfall蛋白(THP)是肾小管髓袢升支粗段产生的肾脏特异糖蛋白，被覆在该部位与远曲管表面[1]。1984年，Abrass用免疫荧光法检测尿沉渣中THP包被细胞(THPC)，认为有助脱落细胞的肾源定位[2]。我们采用免疫酶技术联苯胺试剂显色法测定了肾间质小管疾病、急性肾小球肾炎、泌尿系肿瘤及健康人尿的THPC.以探讨此检查对肾小管损伤及尿脱落细胞定位诊断的意义。
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对象与方法
一、对象
1. 肾疾患者(79例)：急性肾小球肾炎(简称肾炎)17例(男10例，女7例，年龄3～23岁)，诊断标准依据文献[3，4]；肾间质小管病16例(男5例，女11例，年龄14天～55岁)，包括肾盂肾炎6例，肾小管酸中毒3例，药毒性间质性肾炎7例，均为活动期住院病例；肾肿瘤46例(男34例，女12例，年龄18～52岁)。
2. 肾盂、输尿管疾患者(13例)：男8例，女5例，年龄54～74岁，均为肿瘤患者，包括肾盂肿瘤10例，输尿管肿瘤3例。
3. 膀胱疾患组(62例)：急性膀胱炎3例，均为女性，年龄18～ 28岁；膀胱癌59例，男53例，女6例，年龄24～78岁。以上各组中的肿瘤患者均经手术病理证实。全部病例中，除药毒性间质性肾炎有3例发展为急性肾功能衰竭(血尿素氮28.6mmol/L以上)外，其他各例肾功能均正常。
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4. 正常对照组：68名，其中34名系本院健康男性职工或献血员，年龄18～60岁；另34名为幼儿园健康儿童，男25名，女9名，年龄3～5岁，无泌尿系疾患，尿常规检查正常。
二、检查指标
取晨尿5ml，离心沉淀，用上清测定尿THP[5]及尿γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)[6]；取沉渣观察细胞成分与管型后进行THPC检查。
三、尿THPC测定
尿沉渣加磷酸盐缓冲液(PBS)，离心沉淀，弃上清；共2次。取沉淀涂于玻片，干燥后，滴95%酒精固定。如沉渣中白细胞少于5个/高倍视野，直接滴稀释的酶标记THP抗体(按文献方法[7，8]自制，经分子量、紫外光谱及加拿大Cedarlane实验室单克隆THP抗体
定合格)，放湿盒37ºC30分，取出用PBS洗2次，用不含NaCl的磷酸盐缓冲液(PB)洗1次，干燥后滴加0.3%联苯胺酒精溶液100ml与36%亚硝基铁氰化钠液1ml的混合液覆盖涂片，半分钟后加等量1：2000稀释的30%H2O2，放置12分钟，用普通显微镜观察。THPC胞浆呈深蓝色(阳性)，非THPC则胞浆无色(阴性)。THPC一般比白细胞约大1/3，核单一呈圆形，约占细胞体积的1/3；与多形核白细胞的区分在于细胞核的形状与数目。遇胞浆蓝染、细胞核比例增大、体积比白细胞大2～3倍以上的大型THPC时，应进一步作HE染色，鉴定是否为肿瘤细胞。如尿沉渣中白细胞多于5个/高倍视野，固定后先滴0.5%H2O2甲醇盐酸溶液，放置5分钟，以去除内源性过氧化酶，用PBS冲洗后，再如上处理。
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结 果
一、各组尿THPC阳性率及THP含量比较(表1)
表1 泌尿系不同部位疾病尿THPC阳性率及THP含量
分组
尿THPC
尿THP含量(μg/mg肌酐)
受检例数
阳性例数
受检例数
M
范围
阳性例数Δ(%)
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正常对照组
68
0(0.0)
28
4.4
0.3～ 62.4
5(17.8)
肾疾患组
急性肾炎
17
0(0.0)
17
12.5
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1.3～65.7
4(23.5)
间质小管病
13ΔΔ
8(61.5)*
13ΔΔ
30.5*
4.6～320.8
9(69.2*)
肾肿瘤
46
13(28.2)
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14.8
1.4～317.8
13(43.3)
肾盂输尿管肿瘤组
13
0(0.0)
9
5.5
0～95.4
1(11.1)
膀胱疾患组
急性膀胱炎
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3
0(0.0)……………
膀胱癌
59
0(0.0)
30
7.6
0～79.0
7(23.3)
注：Δ尿THP含量超过18μg/mg肌酐为阳性 ΔΔ未包括3例急性肾功能衰竭患者，此3例尿THPC均阳性，尿THP含量各为5.13,5.34和14.6Mg/mg肌酐 *与急性肾炎组比较,P<0.001
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健康者和肾盂、输尿管、膀胱疾病患者的尿液中均未检出THPC，而肾疾患79例中24例查到THPC，阳性率为30.4%。肾疾患组与其他各组间的差异有非常显著意义(P<0.005)。尿中THP含量与THP阳性率也是肾疾患组高于对照组或膀胱疾患组(P<0.005或0.05)。
在肾疾患组中，急性肾炎患者尿中均未查见THPC，而间质小管病患者尿THPC阳性率为68.7%(11/16)；两组间尿THP含量的差异也有非常显著意义(P<0.001)。
二、尿THPC与THP含量并行测定分析
对部分标本采用双盲法进行尿THPC与THP含量并行测定分析，结果见表2
表2 部分肾疾患及泌尿肿瘤患者尿THPC与THP并行测定结果(例数)
疾病
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THP(+)
THP)(-)
THP(-)
THP(+)
合计
THPC(+)
THPC(-)
THPC(+)
THPC(-)
急性肾炎
0
13
0
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4
17
间质小管病
5
1
6
4
16
肾肿瘤
4
12
3
9
28
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其他泌尿
0
31
0
8
39
系肿瘤*
9
57
9
25
100
合计
注：*包括肾盂肿瘤7例，输尿管肿瘤2例，膀胱癌30例
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急性肾炎17例中，THPC及THP两项均阴性占76.5%(13/17)，其余为THP单项阳性，无一例THPC阳性。而间质不管病组两项均阴性者仅1例(6.3%)其余为THPC及THP两项或单项阳性。肾肿瘤28例中，两项或单项阳性者占57.1%(16/28)，两项均阴性占42.9%(12/28)。其他泌尿系肿瘤39例尿THPC均阴性，只有8例(20.5%)THP单项阳性。并行测定的全部病例中，THPC和THP两项测定结果一致者共占66%(66/100)。
三、尿THP与γ-GT并行测定分析
尿γ-GT活性在近曲管受损时增高，是肾损伤的一项敏感指标[9]。对急性肾炎与间质小管病两组中肾功能正常的30例患者进行了尿THP与γ-GT并行定量测定，结果表明两项指标呈密切正相关(Υ=0.305,P<0.05)。以尿γ-GT超过0.60U/mg肌酐、尿THP超过18μg/mg肌酐为阳性，这两项指标也呈高度正相关(列联系数Υ=0.19，一致率80%，P=0.0016)，反映尿THP增高与肾小管一定程度受损有关。
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讨 论
THP由肾髓袢升支粗段细胞的高尔基体产生，分布于该节段上皮细胞与远曲管表面。肾间质、近曲管与集合管不存在THP[1]。Fowler[10]用免疫组化法检查膀胱移行上皮，也无THP抗原。当肾脏因炎症、梗阻、肿瘤等病变受损时，含有THP的髓袢及远曲管上皮细胞脱落于尿中，即为尿THPC。肾肿瘤中，可能起源于远曲管的肾细胞癌可用THP单克隆抗体检测到THP抗原(ABC法)[11]。从本组检测结果，肾盂、输尿管肿瘤及膀胱疾病患者，尿THPC均为阴性，尿THP含量也较低，而肾疾患组尿THPC阳性率为30.4%(24/79)，尿THP含量也较高，提示尿THPC检查有助于尿脱落细胞肾源定位。这与Abrass[2]用免疫荧光法检测的结果基本一致。
对检出的尿THPC，我们曾抽样进行HE复染，证实系脱落的变性肾小管上皮细胞。由于本法阳性细胞胞浆呈深蓝色而易于辨认，其检出率高于尿中脱落细胞HE染色检查。本组41例肾肿瘤同时进行两法检查，尿THPC法阳性率24.4%，而脱落细胞法阳性率14.6%，前者比后者均高1.7倍。
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正常尿中只有少量THP，肾小管受损时THP排泄增多，管型即由THP组成[12]。Arthur报道，在肾移植排斥患者中，尿THP增高早于血肌酐升高，可用作排斥肾损伤的指标[13]。在肾小管因梗阻、炎症受损时，基底膜破裂，尿中THP可在肾间质沉着，间质肾炎与肾盂肾炎THP沉着阳性率高于急(慢)性肾炎[12]。本文结果尿THP含量是肾疾患组高于其它组；肾间质小管病高于急性肾炎。至于尿THPC与肾损伤的关系，文献报道很少。我们通过并行测定，发现尿THPC与尿THP两者一致率为66%，而尿THP与反映近曲管损伤的尿γ-GT酶活力又呈高度正相关，一致率为80%，间接反映尿THPC出现与肾小管损伤有关。并行测定中也有部分病例，尿THPC与THP并不一致，如急性肾炎与膀胱癌患者中，尿THPC阴性而THP单项阳性者占21.4%(12/56)，间质小管病与肾肿瘤患者中，THP单项阳性者占29.5%(13/44)。这些病例肾功能均正常，可能损伤仅使肾小管排泌THP增多而细胞尚未坏死脱落，或脱落量少未能检出。间质小管病16例中，单项THPC阳性者6例(37.5%)，其中3例为药毒性间质肾炎导致的急性肾功能衰竭，尿中检出大量THPC，HE染色证实为坏死肾小管上皮细胞，而尿THP偏低，可能与细胞已坏死、丧失排泌THP功能有关。肾肿瘤组也有3例(10.7%)单有THPC脱落而THP正常。故尿中THPC阳性率取决于髓袢及远曲管上皮受损程度、上皮细胞是否脱落，以及检查技术等因素。如能同时测定尿THP含量，间质小管病的阳性率将从68.7%(11/16)升至93.7%(15/16)。
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尿THPC检查对患者无损伤，方法简便所需时间短，不需特殊设备，标本还可长期保存。按照本文介绍的方法检测，已除去内源性过氧化酶干扰，尿中白细胞多也不会出现假阳性。以上结果提示，尿THPC检查可作为肾小管损伤及尿中脱落细胞定位诊断的辅助方法，其临床意义值得进一步深入探讨。
参考文献
1. Hoyer JR, Tamm-Horsfall glycoprotein ultrastructull immuno-peroxi dase localization in ratis kidney. Lab Invest 1979；41：168.
2. Abrass k, et al. Tamm-Horsfall protein coating urinary cells of renal origin. Kid Int 1984；25：215.
, 百拇医药
3. 儿科肾脏病科研协作组. 关于小儿肾小球疾病临床分类和治疗建议，中华儿科杂志 1979；17：248.
4. 北戴河肾炎座谈会纪要 原发性肾小球疾病的临床分类，诊断和治疗. 中华内科杂志 1978；2：130.
5. 冯陶，蔡碧涓. Tamm-Horsfall 蛋白定量测定及影响因素. 北京医科大学学报 1988；20：283.
6. 上海市立医学化验所. 临床生化检验. 上册. 第1版.上海科学技术出版社，1979：329.
7. Tamm l, Horsfall FL, A mucoprotein derived from human urine which reacts with influenza. mumps Newcastle disease viruses. J Exp Med 1952；95：71.
, 百拇医药
8. Hoyer JR, et al. Ontogeny of Tamm-Horsfall urinary glycoprotein, Lab Invest 1974；30：757.
9. Ward JP, et al. Urinary γ-glutamyl transpeptidase, an indicator of renal ischemia injury and homograft rejection. Br J of Urol 1975；47：765.
10. Fowler JE, The interaction of urinary Tamm-Horsfall protein with transitional epithelium. J Urol 1987；138：446.
11. 顾方六，等. 肾细胞癌的细胞起源，应用肾脏特异性单克隆抗体的免疫组化研究. 北京医科大学学报 1989；21：187.
12. Richard AZ, et al. Pathological localization of Tamm-Horsfall protein in interstitial deposits in renal disease. Lab Invest 1974；30：757.
13. Arthur HC, et al. Interstitial Tamm-Horsfall protein in rejecting renal allografts. Lab Invest 1984；50：519.
(1988年11月5日收稿 1989年9月27日修回), 百拇医药
单位：蔡碧涓 冯陶 窦长琪 魏今 华道宥 成方六；(北京医科大学泌尿外科研究所 100083)卢义侠(北京医科大学第一医院儿科)
关键词：尿；糖蛋白类；肾小管
提要 用酶联免疫技术检查尿Tamm
提要 用酶联免疫技术检查尿Tamm-Horsfall蛋白包被细胞(THPC)，肾间质小管病患者阳性率为68.7%(11/16)，肾肿瘤为28.2%(13/46)，而肾小球肾炎(17例)及肾盂、输尿管、膀胱疾患(共75例)，全部阴性。提示尿THPC检测有助于尿脱落细胞的肾源定位，是判定肾小管损伤的一项有用指标。
Tamm-Horsfall蛋白(THP)是肾小管髓袢升支粗段产生的肾脏特异糖蛋白，被覆在该部位与远曲管表面[1]。1984年，Abrass用免疫荧光法检测尿沉渣中THP包被细胞(THPC)，认为有助脱落细胞的肾源定位[2]。我们采用免疫酶技术联苯胺试剂显色法测定了肾间质小管疾病、急性肾小球肾炎、泌尿系肿瘤及健康人尿的THPC.以探讨此检查对肾小管损伤及尿脱落细胞定位诊断的意义。
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对象与方法
一、对象
1. 肾疾患者(79例)：急性肾小球肾炎(简称肾炎)17例(男10例，女7例，年龄3～23岁)，诊断标准依据文献[3，4]；肾间质小管病16例(男5例，女11例，年龄14天～55岁)，包括肾盂肾炎6例，肾小管酸中毒3例，药毒性间质性肾炎7例，均为活动期住院病例；肾肿瘤46例(男34例，女12例，年龄18～52岁)。
2. 肾盂、输尿管疾患者(13例)：男8例，女5例，年龄54～74岁，均为肿瘤患者，包括肾盂肿瘤10例，输尿管肿瘤3例。
3. 膀胱疾患组(62例)：急性膀胱炎3例，均为女性，年龄18～ 28岁；膀胱癌59例，男53例，女6例，年龄24～78岁。以上各组中的肿瘤患者均经手术病理证实。全部病例中，除药毒性间质性肾炎有3例发展为急性肾功能衰竭(血尿素氮28.6mmol/L以上)外，其他各例肾功能均正常。
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4. 正常对照组：68名，其中34名系本院健康男性职工或献血员，年龄18～60岁；另34名为幼儿园健康儿童，男25名，女9名，年龄3～5岁，无泌尿系疾患，尿常规检查正常。
二、检查指标
取晨尿5ml，离心沉淀，用上清测定尿THP[5]及尿γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)[6]；取沉渣观察细胞成分与管型后进行THPC检查。
三、尿THPC测定
尿沉渣加磷酸盐缓冲液(PBS)，离心沉淀，弃上清；共2次。取沉淀涂于玻片，干燥后，滴95%酒精固定。如沉渣中白细胞少于5个/高倍视野，直接滴稀释的酶标记THP抗体(按文献方法[7，8]自制，经分子量、紫外光谱及加拿大Cedarlane实验室单克隆THP抗体
定合格)，放湿盒37ºC30分，取出用PBS洗2次，用不含NaCl的磷酸盐缓冲液(PB)洗1次，干燥后滴加0.3%联苯胺酒精溶液100ml与36%亚硝基铁氰化钠液1ml的混合液覆盖涂片，半分钟后加等量1：2000稀释的30%H2O2，放置12分钟，用普通显微镜观察。THPC胞浆呈深蓝色(阳性)，非THPC则胞浆无色(阴性)。THPC一般比白细胞约大1/3，核单一呈圆形，约占细胞体积的1/3；与多形核白细胞的区分在于细胞核的形状与数目。遇胞浆蓝染、细胞核比例增大、体积比白细胞大2～3倍以上的大型THPC时，应进一步作HE染色，鉴定是否为肿瘤细胞。如尿沉渣中白细胞多于5个/高倍视野，固定后先滴0.5%H2O2甲醇盐酸溶液，放置5分钟，以去除内源性过氧化酶，用PBS冲洗后，再如上处理。, http://www.100md.com
结 果
一、各组尿THPC阳性率及THP含量比较(表1)
表1 泌尿系不同部位疾病尿THPC阳性率及THP含量
分组
尿THPC
尿THP含量(μg/mg肌酐)
受检例数
阳性例数
受检例数
M
范围
阳性例数Δ(%)
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正常对照组
68
0(0.0)
28
4.4
0.3～ 62.4
5(17.8)
肾疾患组
急性肾炎
17
0(0.0)
17
12.5
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1.3～65.7
4(23.5)
间质小管病
13ΔΔ
8(61.5)*
13ΔΔ
30.5*
4.6～320.8
9(69.2*)
肾肿瘤
46
13(28.2)
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14.8
1.4～317.8
13(43.3)
肾盂输尿管肿瘤组
13
0(0.0)
9
5.5
0～95.4
1(11.1)
膀胱疾患组
急性膀胱炎
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0(0.0)……………
膀胱癌
59
0(0.0)
30
7.6
0～79.0
7(23.3)
注：Δ尿THP含量超过18μg/mg肌酐为阳性 ΔΔ未包括3例急性肾功能衰竭患者，此3例尿THPC均阳性，尿THP含量各为5.13,5.34和14.6Mg/mg肌酐 *与急性肾炎组比较,P<0.001
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健康者和肾盂、输尿管、膀胱疾病患者的尿液中均未检出THPC，而肾疾患79例中24例查到THPC，阳性率为30.4%。肾疾患组与其他各组间的差异有非常显著意义(P<0.005)。尿中THP含量与THP阳性率也是肾疾患组高于对照组或膀胱疾患组(P<0.005或0.05)。
在肾疾患组中，急性肾炎患者尿中均未查见THPC，而间质小管病患者尿THPC阳性率为68.7%(11/16)；两组间尿THP含量的差异也有非常显著意义(P<0.001)。
二、尿THPC与THP含量并行测定分析
对部分标本采用双盲法进行尿THPC与THP含量并行测定分析，结果见表2
表2 部分肾疾患及泌尿肿瘤患者尿THPC与THP并行测定结果(例数)
疾病
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THP(+)
THP)(-)
THP(-)
THP(+)
合计
THPC(+)
THPC(-)
THPC(+)
THPC(-)
急性肾炎
0
13
0
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4
17
间质小管病
5
1
6
4
16
肾肿瘤
4
12
3
9
28
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其他泌尿
0
31
0
8
39
系肿瘤*
9
57
9
25
100
合计
注：*包括肾盂肿瘤7例，输尿管肿瘤2例，膀胱癌30例
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急性肾炎17例中，THPC及THP两项均阴性占76.5%(13/17)，其余为THP单项阳性，无一例THPC阳性。而间质不管病组两项均阴性者仅1例(6.3%)其余为THPC及THP两项或单项阳性。肾肿瘤28例中，两项或单项阳性者占57.1%(16/28)，两项均阴性占42.9%(12/28)。其他泌尿系肿瘤39例尿THPC均阴性，只有8例(20.5%)THP单项阳性。并行测定的全部病例中，THPC和THP两项测定结果一致者共占66%(66/100)。
三、尿THP与γ-GT并行测定分析
尿γ-GT活性在近曲管受损时增高，是肾损伤的一项敏感指标[9]。对急性肾炎与间质小管病两组中肾功能正常的30例患者进行了尿THP与γ-GT并行定量测定，结果表明两项指标呈密切正相关(Υ=0.305,P<0.05)。以尿γ-GT超过0.60U/mg肌酐、尿THP超过18μg/mg肌酐为阳性，这两项指标也呈高度正相关(列联系数Υ=0.19，一致率80%，P=0.0016)，反映尿THP增高与肾小管一定程度受损有关。
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讨 论
THP由肾髓袢升支粗段细胞的高尔基体产生，分布于该节段上皮细胞与远曲管表面。肾间质、近曲管与集合管不存在THP[1]。Fowler[10]用免疫组化法检查膀胱移行上皮，也无THP抗原。当肾脏因炎症、梗阻、肿瘤等病变受损时，含有THP的髓袢及远曲管上皮细胞脱落于尿中，即为尿THPC。肾肿瘤中，可能起源于远曲管的肾细胞癌可用THP单克隆抗体检测到THP抗原(ABC法)[11]。从本组检测结果，肾盂、输尿管肿瘤及膀胱疾病患者，尿THPC均为阴性，尿THP含量也较低，而肾疾患组尿THPC阳性率为30.4%(24/79)，尿THP含量也较高，提示尿THPC检查有助于尿脱落细胞肾源定位。这与Abrass[2]用免疫荧光法检测的结果基本一致。
对检出的尿THPC，我们曾抽样进行HE复染，证实系脱落的变性肾小管上皮细胞。由于本法阳性细胞胞浆呈深蓝色而易于辨认，其检出率高于尿中脱落细胞HE染色检查。本组41例肾肿瘤同时进行两法检查，尿THPC法阳性率24.4%，而脱落细胞法阳性率14.6%，前者比后者均高1.7倍。
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正常尿中只有少量THP，肾小管受损时THP排泄增多，管型即由THP组成[12]。Arthur报道，在肾移植排斥患者中，尿THP增高早于血肌酐升高，可用作排斥肾损伤的指标[13]。在肾小管因梗阻、炎症受损时，基底膜破裂，尿中THP可在肾间质沉着，间质肾炎与肾盂肾炎THP沉着阳性率高于急(慢)性肾炎[12]。本文结果尿THP含量是肾疾患组高于其它组；肾间质小管病高于急性肾炎。至于尿THPC与肾损伤的关系，文献报道很少。我们通过并行测定，发现尿THPC与尿THP两者一致率为66%，而尿THP与反映近曲管损伤的尿γ-GT酶活力又呈高度正相关，一致率为80%，间接反映尿THPC出现与肾小管损伤有关。并行测定中也有部分病例，尿THPC与THP并不一致，如急性肾炎与膀胱癌患者中，尿THPC阴性而THP单项阳性者占21.4%(12/56)，间质小管病与肾肿瘤患者中，THP单项阳性者占29.5%(13/44)。这些病例肾功能均正常，可能损伤仅使肾小管排泌THP增多而细胞尚未坏死脱落，或脱落量少未能检出。间质小管病16例中，单项THPC阳性者6例(37.5%)，其中3例为药毒性间质肾炎导致的急性肾功能衰竭，尿中检出大量THPC，HE染色证实为坏死肾小管上皮细胞，而尿THP偏低，可能与细胞已坏死、丧失排泌THP功能有关。肾肿瘤组也有3例(10.7%)单有THPC脱落而THP正常。故尿中THPC阳性率取决于髓袢及远曲管上皮受损程度、上皮细胞是否脱落，以及检查技术等因素。如能同时测定尿THP含量，间质小管病的阳性率将从68.7%(11/16)升至93.7%(15/16)。
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尿THPC检查对患者无损伤，方法简便所需时间短，不需特殊设备，标本还可长期保存。按照本文介绍的方法检测，已除去内源性过氧化酶干扰，尿中白细胞多也不会出现假阳性。以上结果提示，尿THPC检查可作为肾小管损伤及尿中脱落细胞定位诊断的辅助方法，其临床意义值得进一步深入探讨。
参考文献
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(1988年11月5日收稿 1989年9月27日修回), 百拇医药