阿霉素肾病大鼠生物膜电荷的变化与蛋白尿的关系*
作者：陈重义 姜新猷 郭梅 王季安 柏 毅
单位：陈重义 姜新猷 郭梅 王季安(南京医学院儿科系 210005)柏 毅(东南大学生物医学工程系)
关键词：肾变病；肾小球；电子数据处理
提要 应用电子计算机图像分析的方法 提要 应用电子计算机图像分析的方法，研究阿霉素肾病大鼠肾小球及红细胞阴电荷的变化及其与蛋白尿的关系。结果，在出现蛋白尿之前大鼠的肾小球及红细胞上阴电荷已明显下降。两种阴电荷的变化呈正相关，且二者与尿蛋白量均呈负相关。肾小球足突融合发生于蛋白尿之前。
近年来不少文献证实，肾病综合征时除肾小球阴电荷减少外，还有外周血红细胞、血小板上阴电荷的丢失，认为该病可能是一种全身性膜电荷变化的疾病[1，2]。为了进一步了解生物膜电荷变化在肾病综合征发病中的作用，我们用Alcian蓝染色，并经过电子计算机图象分析，研究了阿霉素肾病大鼠肾小球及红细胞上阴电荷的变化及其与蛋白尿的关系。现将结果报道如下。
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对象与方法
一、动物模型制备
我们采用Sprague-Dawley系雌性大鼠，体重140～190g，用阿霉素(Adriamycin,ADR，意大利Farmitalia公司产品)按7mg/kg1次尾静脉注射。由于预试验结果证实，此种方法处理后大鼠均发生蛋白尿，蛋白尿发生于注射ADR后15天左右(14～22天)，我们将大鼠分为五个组，A组：正常对照组，不注射ADR；B组：注射ADR后48小时处死；C组：注射ADR后14天时处死；D组：当尿蛋白≥40mg/24小时14天处死；E组：当尿蛋白≥40mg/24小时28天时处死。每组大鼠3只，处死时检测血生化指标，并进行红细胞及肾小球Alcian蓝染色及肾组织的光镜、电镜和免疫荧光检查。
二、肾小球Alcian蓝染色
用异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后进行右肾动脉插管。先注入3.8%枸橼酸钠1ml抗凝，而后用生理盐水冲洗，直至洗出液清晰、肾脏发白为止。此后按Bankir方法注入戊二醛-Alcian蓝染色液1ml/100g(用0.1mol/L，pH6.4的二甲胂酸盐缓冲液配制，含戊二醛2.5%，Alcian蓝0.5%)，5分钟注完。最后用少许生理盐水冲洗、取肾组织，放入中性甲醛中固定，按常规方法脱水，石蜡包埋、切片。左肾未灌注，取材后送光镜、电镜、免疫荧光检查。
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三、红细胞Alcian蓝染色
按文献[1]方法，所有结果均为6×108个红细胞结合Alcian蓝量(μg)。
四、肾脏切片的电子计算机图象分析
电子计算机图象处理系统(主机型号为VAX-11/730，图象分析机型号为Model75)为512×512×8位，灰度分辨率可达256级。在用Alcian蓝染色的肾小球，我们测定：(1)从最高灰度值255到最低灰度(着色强度最大)之间的一段灰度级数，为肾小球染色深度，以及(2)在所选定的灰度值范围内肾小球着色部分占该肾小球总面积的百分比。每份标本同时检测3个肾小球，计算出其平均值。
所得数据用方差分析进行统计学处理。
结 果
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一、阿霉素肾病大鼠的血生化及尿蛋白量
B组和C组在处死时均未出现蛋白尿，而出现蛋白尿的D、E两组则有血清总蛋白下降、A/G倒置、血清胆固醇不同程度升高，提示已形成肾病综合征模型(表1)。光镜下肾小球无明显改变，免疫荧光检查未见IgG及C3沉积。
表1 各组大鼠血生化及尿蛋白量(
±S)*
组别
总蛋白
(g/L)
白蛋白
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(mmol/L)
胆固醇
(μmol/L)
血肌酐
(μmol/L)
出现蛋
白尿天数**
平均尿蛋白
(mg/24h)***
A
71±4
38±1
1.79±0.23
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35±9…
2.5±1.3
B
71±17
48±10
2.44±0.26
71±9…
5.8±3.6
C
70±1
43±2
2.42±0.08
62±9…
4.5±0.7
D
64±8
29±5
2.94±0.18
44±26
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单位：陈重义 姜新猷 郭梅 王季安(南京医学院儿科系 210005)柏 毅(东南大学生物医学工程系)
关键词：肾变病；肾小球；电子数据处理
提要 应用电子计算机图像分析的方法 提要 应用电子计算机图像分析的方法，研究阿霉素肾病大鼠肾小球及红细胞阴电荷的变化及其与蛋白尿的关系。结果，在出现蛋白尿之前大鼠的肾小球及红细胞上阴电荷已明显下降。两种阴电荷的变化呈正相关，且二者与尿蛋白量均呈负相关。肾小球足突融合发生于蛋白尿之前。
近年来不少文献证实，肾病综合征时除肾小球阴电荷减少外，还有外周血红细胞、血小板上阴电荷的丢失，认为该病可能是一种全身性膜电荷变化的疾病[1，2]。为了进一步了解生物膜电荷变化在肾病综合征发病中的作用，我们用Alcian蓝染色，并经过电子计算机图象分析，研究了阿霉素肾病大鼠肾小球及红细胞上阴电荷的变化及其与蛋白尿的关系。现将结果报道如下。
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对象与方法
一、动物模型制备
我们采用Sprague-Dawley系雌性大鼠，体重140～190g，用阿霉素(Adriamycin,ADR，意大利Farmitalia公司产品)按7mg/kg1次尾静脉注射。由于预试验结果证实，此种方法处理后大鼠均发生蛋白尿，蛋白尿发生于注射ADR后15天左右(14～22天)，我们将大鼠分为五个组，A组：正常对照组，不注射ADR；B组：注射ADR后48小时处死；C组：注射ADR后14天时处死；D组：当尿蛋白≥40mg/24小时14天处死；E组：当尿蛋白≥40mg/24小时28天时处死。每组大鼠3只，处死时检测血生化指标，并进行红细胞及肾小球Alcian蓝染色及肾组织的光镜、电镜和免疫荧光检查。
二、肾小球Alcian蓝染色
用异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后进行右肾动脉插管。先注入3.8%枸橼酸钠1ml抗凝，而后用生理盐水冲洗，直至洗出液清晰、肾脏发白为止。此后按Bankir方法注入戊二醛-Alcian蓝染色液1ml/100g(用0.1mol/L，pH6.4的二甲胂酸盐缓冲液配制，含戊二醛2.5%，Alcian蓝0.5%)，5分钟注完。最后用少许生理盐水冲洗、取肾组织，放入中性甲醛中固定，按常规方法脱水，石蜡包埋、切片。左肾未灌注，取材后送光镜、电镜、免疫荧光检查。
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三、红细胞Alcian蓝染色
按文献[1]方法，所有结果均为6×108个红细胞结合Alcian蓝量(μg)。
四、肾脏切片的电子计算机图象分析
电子计算机图象处理系统(主机型号为VAX-11/730，图象分析机型号为Model75)为512×512×8位，灰度分辨率可达256级。在用Alcian蓝染色的肾小球，我们测定：(1)从最高灰度值255到最低灰度(着色强度最大)之间的一段灰度级数，为肾小球染色深度，以及(2)在所选定的灰度值范围内肾小球着色部分占该肾小球总面积的百分比。每份标本同时检测3个肾小球，计算出其平均值。
所得数据用方差分析进行统计学处理。
结 果
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一、阿霉素肾病大鼠的血生化及尿蛋白量
B组和C组在处死时均未出现蛋白尿，而出现蛋白尿的D、E两组则有血清总蛋白下降、A/G倒置、血清胆固醇不同程度升高，提示已形成肾病综合征模型(表1)。光镜下肾小球无明显改变，免疫荧光检查未见IgG及C3沉积。
表1 各组大鼠血生化及尿蛋白量(
±S)*组别
总蛋白
(g/L)
白蛋白
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(mmol/L)
胆固醇
(μmol/L)
血肌酐
(μmol/L)
出现蛋
白尿天数**
平均尿蛋白
(mg/24h)***
A
71±4
38±1
1.79±0.23
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35±9…
2.5±1.3
B
71±17
48±10
2.44±0.26
71±9…
5.8±3.6
C
70±1
43±2
2.42±0.08
62±9…
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D
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