自发性遗传糖尿病BB鼠慢性心脏超微结构病变的定量研究
作者：周晓朋 钟学礼 朱禧星 钟慈声 俞永富
单位：周晓朋 钟学礼 朱禧星(上海医科大学附属华生医院糖尿病研究室 200040)；钟慈声 俞永富(上海医科大学电镜室)
关键词：糖尿病；毛细血管；肌原纤维；电子显微镜检查
提要 对自发性糖尿病BB鼠慢性心脏病变进行电镜定量研究
提要 对自发性糖尿病BB鼠慢性心脏病变进行电镜定量研究，观察到心肌肌原纤维含量明显减少，纤维局灶性坏死等。心肌毛细胞管基底膜明显增厚，与血糖呈正相关。从超微结构上证实糖尿病心脏病变与代谢紊乱有密切关系。
糖尿病心脏病是糖尿病重要的远期并发症和死亡原因。其病理、发病机制迄今尚未阐明[1]。自发性、遗传性糖尿病BioBreeding(BB)鼠能模拟人类糖尿病的自然发病、病程发展和转归，是最近似于人类糖尿病的理想动物模型[2]。我们从加拿大引进纯系BB种鼠，在国内首次繁殖并复制出糖尿病BB鼠模型，观察糖尿病心脏超微结构的病变以及控制代谢紊乱和中西药物对糖尿病慢性心脏病变的影响。
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材料与方法
一、自发性糖尿病BB鼠模型的建立
1. 纯系BB亲代种鼠由加拿大的Thiber教授提供，在本校实验动物部将亲代种鼠随机配对并繁殖出子代BB鼠制备自发性糖尿病动物模型。
2. 糖尿病诊断标准：子代鼠出生后10～20周，每日普查尿糖，定期测定血糖。凡血糖〉10mmol/L，尿糖〉++，即诊断为糖尿病。
二、慢性实验的分组及治疗
1. 慢性实验的糖尿病BB鼠22只(雄鼠15只，雌鼠7只)平均年龄43周(39～46周)，平均病程26周(21～33周)，正常同龄对照鼠4只。实验鼠定期(4周)测定血糖，以此计算慢性病程中的平均血糖水平。
2. 糖尿病BB鼠，每日给予长效鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)注射治疗，以控制代谢紊乱及维持生存。剂量根据实验设计及尿糖定性结果调整，约每日2～4U/只。达美康系法国施维雅药厂产品，剂量根据体重计算，约每日30～40mg/只。八味地黄丸配方为熟地、泽泻、茯苓、丹皮、山茱萸、山药、肉桂、附子，剂量为每日1.2g/只。药物均匀溶于饮用水中给实组鼠服用。
, 百拇医药
3. 根据胰岛素治疗情况和平均血糖水平，将糖尿病鼠分为严格血糖控制组(血糖〈10mmol/L)和血糖控制较差组(血糖≥10mmol/L)。对血糖控制较差组，又根据治疗用药的不同，分为单用PZI治疗组及PZI加用达美康或八味地黄丸治疗组。
三、电镜标本的取材与制备
实验鼠麻醉处死，迅速取下心脏，在左室心肌处取材，切成1mm大小的组织块8～10块置入戊二醛固定液中，经锇酸后固定，酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋。半薄切片检查定位，用LKB4800型超薄切片机制成50～70nm的超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅双染后电镜观察。
四、电镜观察及图象定量分析测定
1. 在Hitachi-HUIIA型透射电镜上系统观察，并随机拍摄中心区域13个视野，电镜放大8000倍。
, 百拇医药
2. 用VIDS Ⅲ型图象定量分析系统(美国AMS公司产品)，测定心肌毛细血管基底膜(CBM)的厚度和心肌细胞内肌原纤维的体积分数(VF)。方法：待测图象输入视频处理器，用光标器沿显示屏上待测图象边界测量，各测定参数进入图象数据处理机得出结果。
统计学处理:定量数据以
±S表示，并进行显著性t检验和相关分析。
结 果
一、糖尿病心肌毛细血管基底膜增厚及其与代谢控制和中西药物治疗的关系(表1～3)
表1 糖尿病鼠与正常鼠心肌CBM厚度的比较
组别
, 百拇医药
例数
血糖(mmol/L)
CBM(nm)
正常BB鼠
4
6.6±1.2
36±4
糖尿病BB鼠
22
14.7±5.2
63±14
注：P〈0.001
表2 代谢控制对糖尿病BB鼠CBM增厚的影响
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组别
例数
血糖(mmol/L)
CBM(nm)
血糖严格控制
7
8.2±1.2
50±8
血糖控制较差
15
17.7±3.0
69±12
注：P〈0.01
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表3 不同治疗对糖尿病BB鼠CBM厚度的影响
组别
例数
血糖(mmol/L)
CBM(nm)
PZI
5
17.3±2.5
77±7
PZI加达美康
4
18.6±4.4*
, 百拇医药
72±6*
PZI加八味地黄丸
6
17.4±2.8**
60±13**
注：与PZI组比较 *P〈0.05 **P〈0.05
结果表明，慢性糖尿病BB鼠心肌CBM厚度比正常鼠明显增加。严格控制血糖能明显减轻心肌CBM增厚的严重程度。相关分析也表明CBM厚度与血糖水平呈相关(Υ=0.45，P〈0.05)。加用八味地黄丸治疗的糖尿病鼠，CBM增厚程度明显轻于单用PZI治疗组。
二、心肌细胞超微结构病变
1. 正常BB鼠心肌细胞中，肌原纤维是胞浆的主要成分，粗细肌丝整剂排列，明暗各带清晰可见(图1)。糖尿病鼠表现为肌原纤维含量明显减少，肌丝断裂、扭曲。线粒体明显增多出现肿胀变形、嵴断裂、基底空化(图2)。大量糖原颗粒沉积在肌原纤维之间和线粒体周围，脂滴含量也明显增多。肌浆网T管系统扩张，大量空泡形成。有时还可见心肌收缩带形成，表现为与闰盘连接的数个至数十个高度收缩变形的肌节，明暗各带均辨认不清。严重时还可见心肌纤维局灶性坏死，肌丝溶解消失。此外还可见闰盘结构异常，粘合膜处间隙扩张，内有颗粒状物沉积。
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图1 正常BB鼠心肌细胞。肌原纤维结构完整，明暗
各带清晰可见。醋酸铀枸橼酸铅染色×12000
图2 糖尿病BB鼠心肌细胞。肌原纤维明显减少、断裂、扭曲(f)。线粒体增多，结构异常，嵴断裂、膜破裂、基质空化(m)。胞浆中还可见脂褐素颗粒、脂滴。醋酸铀枸橼酸铅染色×12000
2.肌原纤维体积分数(VF)的定量测定(表4，5)
表4 糖尿病与正常BB鼠心肌细胞肌原纤维的VF
组别
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例数
血糖(mmol/L)
肌原纤维VF
正常
4
6.6±1.2
42±4
糖尿病
22
14.7±5.2
34±6
注：P〈0.02
表5 不同治疗对溏尿病BB鼠心肌细胞肌原纤维VF的影响
组别
例数
> Transfer interrupted!, 百拇医药
单位：周晓朋 钟学礼 朱禧星(上海医科大学附属华生医院糖尿病研究室 200040)；钟慈声 俞永富(上海医科大学电镜室)
关键词：糖尿病；毛细血管；肌原纤维；电子显微镜检查
提要 对自发性糖尿病BB鼠慢性心脏病变进行电镜定量研究
提要 对自发性糖尿病BB鼠慢性心脏病变进行电镜定量研究，观察到心肌肌原纤维含量明显减少，纤维局灶性坏死等。心肌毛细胞管基底膜明显增厚，与血糖呈正相关。从超微结构上证实糖尿病心脏病变与代谢紊乱有密切关系。
糖尿病心脏病是糖尿病重要的远期并发症和死亡原因。其病理、发病机制迄今尚未阐明[1]。自发性、遗传性糖尿病BioBreeding(BB)鼠能模拟人类糖尿病的自然发病、病程发展和转归，是最近似于人类糖尿病的理想动物模型[2]。我们从加拿大引进纯系BB种鼠，在国内首次繁殖并复制出糖尿病BB鼠模型，观察糖尿病心脏超微结构的病变以及控制代谢紊乱和中西药物对糖尿病慢性心脏病变的影响。
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材料与方法
一、自发性糖尿病BB鼠模型的建立
1. 纯系BB亲代种鼠由加拿大的Thiber教授提供，在本校实验动物部将亲代种鼠随机配对并繁殖出子代BB鼠制备自发性糖尿病动物模型。
2. 糖尿病诊断标准：子代鼠出生后10～20周，每日普查尿糖，定期测定血糖。凡血糖〉10mmol/L，尿糖〉++，即诊断为糖尿病。
二、慢性实验的分组及治疗
1. 慢性实验的糖尿病BB鼠22只(雄鼠15只，雌鼠7只)平均年龄43周(39～46周)，平均病程26周(21～33周)，正常同龄对照鼠4只。实验鼠定期(4周)测定血糖，以此计算慢性病程中的平均血糖水平。
2. 糖尿病BB鼠，每日给予长效鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)注射治疗，以控制代谢紊乱及维持生存。剂量根据实验设计及尿糖定性结果调整，约每日2～4U/只。达美康系法国施维雅药厂产品，剂量根据体重计算，约每日30～40mg/只。八味地黄丸配方为熟地、泽泻、茯苓、丹皮、山茱萸、山药、肉桂、附子，剂量为每日1.2g/只。药物均匀溶于饮用水中给实组鼠服用。
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3. 根据胰岛素治疗情况和平均血糖水平，将糖尿病鼠分为严格血糖控制组(血糖〈10mmol/L)和血糖控制较差组(血糖≥10mmol/L)。对血糖控制较差组，又根据治疗用药的不同，分为单用PZI治疗组及PZI加用达美康或八味地黄丸治疗组。
三、电镜标本的取材与制备
实验鼠麻醉处死，迅速取下心脏，在左室心肌处取材，切成1mm大小的组织块8～10块置入戊二醛固定液中，经锇酸后固定，酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋。半薄切片检查定位，用LKB4800型超薄切片机制成50～70nm的超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅双染后电镜观察。
四、电镜观察及图象定量分析测定
1. 在Hitachi-HUIIA型透射电镜上系统观察，并随机拍摄中心区域13个视野，电镜放大8000倍。
, 百拇医药
2. 用VIDS Ⅲ型图象定量分析系统(美国AMS公司产品)，测定心肌毛细血管基底膜(CBM)的厚度和心肌细胞内肌原纤维的体积分数(VF)。方法：待测图象输入视频处理器，用光标器沿显示屏上待测图象边界测量，各测定参数进入图象数据处理机得出结果。
统计学处理:定量数据以
±S表示，并进行显著性t检验和相关分析。结 果
一、糖尿病心肌毛细血管基底膜增厚及其与代谢控制和中西药物治疗的关系(表1～3)
表1 糖尿病鼠与正常鼠心肌CBM厚度的比较
组别
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例数
血糖(mmol/L)
CBM(nm)
正常BB鼠
4
6.6±1.2
36±4
糖尿病BB鼠
22
14.7±5.2
63±14
注：P〈0.001
表2 代谢控制对糖尿病BB鼠CBM增厚的影响
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组别
例数
血糖(mmol/L)
CBM(nm)
血糖严格控制
7
8.2±1.2
50±8
血糖控制较差
15
17.7±3.0
69±12
注：P〈0.01
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表3 不同治疗对糖尿病BB鼠CBM厚度的影响
组别
例数
血糖(mmol/L)
CBM(nm)
PZI
5
17.3±2.5
77±7
PZI加达美康
4
18.6±4.4*
, 百拇医药
72±6*
PZI加八味地黄丸
6
17.4±2.8**
60±13**
注：与PZI组比较 *P〈0.05 **P〈0.05
结果表明，慢性糖尿病BB鼠心肌CBM厚度比正常鼠明显增加。严格控制血糖能明显减轻心肌CBM增厚的严重程度。相关分析也表明CBM厚度与血糖水平呈相关(Υ=0.45，P〈0.05)。加用八味地黄丸治疗的糖尿病鼠，CBM增厚程度明显轻于单用PZI治疗组。
二、心肌细胞超微结构病变
1. 正常BB鼠心肌细胞中，肌原纤维是胞浆的主要成分，粗细肌丝整剂排列，明暗各带清晰可见(图1)。糖尿病鼠表现为肌原纤维含量明显减少，肌丝断裂、扭曲。线粒体明显增多出现肿胀变形、嵴断裂、基底空化(图2)。大量糖原颗粒沉积在肌原纤维之间和线粒体周围，脂滴含量也明显增多。肌浆网T管系统扩张，大量空泡形成。有时还可见心肌收缩带形成，表现为与闰盘连接的数个至数十个高度收缩变形的肌节，明暗各带均辨认不清。严重时还可见心肌纤维局灶性坏死，肌丝溶解消失。此外还可见闰盘结构异常，粘合膜处间隙扩张，内有颗粒状物沉积。
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图1 正常BB鼠心肌细胞。肌原纤维结构完整，明暗
各带清晰可见。醋酸铀枸橼酸铅染色×12000
图2 糖尿病BB鼠心肌细胞。肌原纤维明显减少、断裂、扭曲(f)。线粒体增多，结构异常，嵴断裂、膜破裂、基质空化(m)。胞浆中还可见脂褐素颗粒、脂滴。醋酸铀枸橼酸铅染色×12000
2.肌原纤维体积分数(VF)的定量测定(表4，5)
表4 糖尿病与正常BB鼠心肌细胞肌原纤维的VF
组别
, http://www.100md.com
例数
血糖(mmol/L)
肌原纤维VF
正常
4
6.6±1.2
42±4
糖尿病
22
14.7±5.2
34±6
注：P〈0.02
表5 不同治疗对溏尿病BB鼠心肌细胞肌原纤维VF的影响
组别
例数
> Transfer interrupted!, 百拇医药