中国人新β-地中海贫血突变类型一例——β-珠蛋白基因起始密码子(ATG)中T→G*
作者：谢慎思1 谭荣安2 林关绵仙2 胡玉娟2 顾银良3 Anifa M. C. Li4
单位：1. 湖南医科大学分子生物学研究室，长沙，邮政编码 410078；2. 香港大学生化系；3. 上海医科大学；4. 香港大学附属玛丽医院儿科
关键词：地中海贫血；核苷酸；密码子
中华医学杂志900506
提要 用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称PCR)体外选择性地扩增β-珠蛋白基因的两个片段后，与我国人中常见的6种β-地贫突变相应的探针进行初筛，并进行直接双链DNA顺序分析。发现1例新的β-地贫突变，在β-珠蛋白基因起始密码子(ATG)中T→G，突变取消了该区的一个NcoI位点，故可用NcoI酶切PCR产物以直接证实该变异的存在，可用于产前诊断。此外，先证者尚携带有另一β41/42(-4bp)等位基因，且复合有α-地贫-2，右侧缺失3.7kbI型杂合子，是一极罕见的双重复合杂合子。
, 百拇医药
β-地中海贫血(β-地贫)，是由于β-珠蛋白基因突变导致β-珠蛋白肽链肌如(β°)或合成不足(β+)而引起的遗传性溶血性贫血病。其突变的分子基础具有异质性，其主要分子损害或为点突变；或为核苷酸序列的小片段缺失或插入，在各民族中有各自常见的突变类型。在我国人群中，已知β-地贫突变有β41/42(-4bp)，IVS-2-654(G→T)；β-28(A→G)；β17(A→T)；β71/72(+A)；IVS-1-5(C→T)；β43(G→T)；β34(+4)；β-29(A→G)；β30(T→C)等[1～3]，特别是前6种较为常见。最近我们通过对聚合酶链式反应扩增的β-珠蛋白基因片段的直接测序，发现中国人中一个新的单核苷酸取代，是在β-珠蛋白基因的起始密码子ATG→AGG，并对先证者父母进行了同样研究证实。
材料和方法
DNA样品系从β-地贫病人及其父母的外周血白细胞分离制备。先证者，女性，1岁半，系香港人，为香港大学医学院儿科系血液室住院病人。
, 百拇医药
体外基因扩增，根据Saiki等[4，5]的方法改良，常规扩增β-珠蛋白基因两个片段，分别用引物A+B或C+D，其片段大小分别为746bp和584bp。此寡聚核苷酸引物在β-珠蛋白基因中的定位及核苷酸顺序见图1。每一扩增反应用基因组DNA1μg，引物对各50pmol/L，在95°C5分钟，使DNA变性解链后，加入2～5U Taq(Thermus Aquaticus)DNA聚合酶(New England Biolabs产品)，然后在45°C退火40秒钟、67°C3分钟使DNA链延长，之后再93°C30秒、45°C40秒、67°C3分钟，如此循环30次，最后一个循环在67°C10分钟，使未完成的DNA链充分延长，反应产物经1.5%琼脂糖胶电泳检测，溴乙啶染色，紫外摄影。
引物及探针顺序：
A，5′-GGACAGGTACGGCTGTCATCACTTA3′
, 百拇医药
B，5′-TCATTCGTCTGTTTCCCATTCTAAA3′
C，5′-TGATACAATGTTATCATGCCTCTTTG3′
D，5′-GCACTGACCTGGGACATTCCCTTTT3′
E，5′-GGTTGGCCAATCTACTCCC3′
-28 N 5′-GCTGGGCAAAAGTCAGG3′
M 5′-GCTGGGCATAGAAGTCAGG3′
41/42 N 5′-AAGGACTCAAAGAACCTCT3′
M 5′-CAGAGGTTGAGTTCCTTTGG3′
, 百拇医药
IVS-2-654 N 5′-GGGTTAAGGCAATAGCAAT3′
M 5′-ATTGCTATTACCTTAACCC3′
17 M 5′-CTGTGGGGCTAAGGTGAACG3′
71/72 M 5′-GGTGCCTTTAAGTGATGGC3′
图1 β-地贫的5种突变类型在β-珠蛋白基因中的定位及用于PCR的4种引物(A、B、C、D)及1种测序引物E的定位及A+B，C+D所扩增片段大小示意图
斑点杂交分析：用六种突变探针及三种正常探针检测(探针顺序见图1)，根据文献[6]方法加以改良，将1/10至1/20聚合酶链式反应(PCR)产物打点至Zeta-proba尼龙膜上，用32P标记的寡核苷酸探针杂交，其杂交及洗膜温度分别在Tm-3及Tm-1[Tm=4(G+C)+2(A+T)][6]。
, 百拇医药
直接双链DNA顺序：将PCR产物纯化，碱变性后与2pmoL r32P末端标记的测序引物(其顺序见图1)退火，用测序酶(SequenaseTM,USB公司产品)按测序指南进行直接双链DNA测序。
突变的进一步证明：将PCR扩增的β-珠蛋白基因片段1(引物A+B)，用Nco消化后，以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，以溴乙啶染色，紫外摄影。
α-珠蛋白基因分析：先证者及其父母的DNA样品各10μg，分别用BamHI,Bgl Ⅱ和ApaI消化后，用32P标记的RBα1，1.5kb探针做Southern印迹杂交分析。
结 果
图2为该家系成员的红细胞溶血液经尿素-Triton-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱，图中先证者的溶血液分离染色后，未见有β-珠蛋白链的区带，表明为β°地贫，其家庭成员的DNA分析见附表。
, 百拇医药
附表 先证者及其父母的DNA分析结果
α-珠蛋白基因分析
β-珠蛋白基因分析
RBα11.5kb探针
基因类型
突变类型
基因类型
Bam HI片段
Bgl Ⅱ片段
Apa Ⅰ片段
41/42
(-4bp)
, 百拇医药
起始
T→G
父
14，12，7.0
2.7，1.7
0.89，αα/αα
-
+
βA/β°
母
14，10
16，12，7.0
2.5，0.89
, 百拇医药
αα/-α3.7
+
-
β°/βA
先证者
14，10
16，12，7.0
2.5，2.7，1.7
0.89
αα/-α3.7
+
+
, http://www.100md.com β°/β°
1.先证者 2.父 3.母
图2 红细胞溶血液经尿素-Triton-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Taq DNA聚合酶的高反应温度，既有利于引物与DNA专一性退火，又增加了反应速度，使扩增后产物经凝胶电泳，溴乙啶染色后，区带清晰可见(图3)。
1为ΦX174RF DNA HeaⅢ片段分子量标志2、3、4分别为先证者、父、母的基因组DNA扩增的样品
图3 经PCR法扩增的DNA的琼脂糖凝胶电泳图
, 百拇医药
先证者及其父母的DNA以PCR扩增后的产物打点至Zeta-Proba尼龙膜上，并与r32P标记的β41/42突变及正常探针杂交，其放射自显影结果(图4)表明，先证者为β41/42(-4bp)的杂合子，其异常基因来自母系。进一步将PCR产物纯化、变性、用测序酶进行直接双链DNA测序，结果(图5)表明，先证者的另一β-珠蛋白基因起始密码子(ATG)中发生一新的点突变，即T→G，且此变异来自父系。由于此突变取消了β-珠蛋白基因在这一区域内的一个NcoI位点(CCATGG)(图6a)，故先证者及其父母的DNA经扩增后产物，用NcoI酶切后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳、溴乙啶染色后，可直接分析(图6b)，结果表明其母与正常对照组DNA经NcoI酶切后，原扩增的746bp带，产生了两个较短的片段(562bp和184bp)，而先证者及其父则出现一未被消化的区带，由此进一步证实其起始密码子突变(T→G)，从而在该区取消了一个NcoI位点，此结果说明该新的变异来自父系。从上述可见先证者实为β起始(T→G)/β41/42(-4bp)的复合杂合子。
, 百拇医药
N：表示正常探针
M：表示突变探针
15：先证者
15A：父
15B：母
14、19：为对照样品
图4 PCR扩增的DNA样品dot blot杂交放射自显影图
图5 PCR扩增的基因组DNA直接双链测序(1)CCAT(G)GGTGCA
(2)CCATGGTGCA(3)CCAT(G)GGTGCA
, 百拇医药
图6(a) 起始密码子突变的直接证明——扩增的
β-珠蛋白基因746bp片段的定位及NcoI位点在基因上的定位
图6(b) 起始密码子突变的直接证明——PCR产物经NCO I酶以后，1.5%琼脂糖凝胶电泳图(2.正常对照 3.先证者 4.先证者之父 5.先证者之母)
此外，该家系成员DNA均分别经BamHI和Bgl Ⅱ及ApaⅠ酶切后，用RBα-1(1.5kb)探针进行Southern印迹分析，先证者及其母出现14.5kb和10.5kb的Bam HI片段；16，12和7.0kb的Bel Ⅱ片段以及2.5kb和0.89kb的ApaⅠ片段，综合此结果，说明先证者为遗传性α-地贫-2杂合子/β°地贫复合杂合子，即为一双重复合杂子。其母系α-地贫-2杂合子/β-地贫杂合子，即α/β地贫复合杂合子。其基因系谱分析结果见图7。
, 百拇医药
图7 先证者基因型系谱分析
讨 论
本例起始密码子ATG→AGG突变属首次报道，是引起β-地贫的又一新类型。因起始密码子突变导致α-地贫早已有所报道[7～9]，是一罕见的类型，由于起始密码子突变，引起该区一个NcoⅠ位点消失，故可用NcoⅠ酶切PCR扩增的DNA，直接检出该变异(图6)，α-地贫中起始密码子突变亦有NcoI位点消失。β-地贫突变导致限制酶位点改变，早已有报道，目前已发现者约14种[1]。此为具有该类突变的高危患儿的产前诊断提供了更简单、快速、直接的非同位素方法。
此外，先证者携带的β41/42(-4bp)突变，为中国人最常见的突变类型，约占34%～46%[1]，但此类双重杂合子尚属罕见，而复合有α-地贫-2，右侧缺失，3.7kb(I)型杂合子(-α3，7)形成双重复合杂合子则更属罕见。至今未见有类似报道。而其母为α/β地贫复合杂合子亦属少见类型。
, 百拇医药
β-地贫突变的阐明是确立产前诊断的前提，应用体外基因扩增技术来确定β-地贫突变，是可用斑点印迹杂交法，用我国人中常见的6种突变相应的探针，对常见突变进行初步筛选，而对未知突变类型则常需进一步作顺序分析来加以确定。我们用PCR扩增的基因组DNA直接测序技术，仅需1～2μgDNA样品，便能简便、快速地在1周内获得满意结果，此对产前诊断十分有利。
参考文献
1. Kazazian HH Jr, Boehm CD. Molecular basis and prenatal diagnosis of beta-thalassemia. Blood 1988；72：1107.
2. Orkin SH, Kazazian HH Jr. The mutation and polymorphism of the human beta-globin gene and its surrounding DNA. Annu Rev Genet 1984；18：131.
, http://www.100md.com
3. Zhang JZ, et al. Molecular basis of betathalassemia in south China strategy for DNA analysis. Hum Genet 1988；78：37.
4. Saiki RK, et al. Enxymatic amplification of betaglobin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985；230：1350.
5. Cai SP, et al. A simpie approach to prenatal diag nosis of β-Thalassemia in a geograhic area where multiple nutations occur. Blood 1988；71：1357.
, http://www.100md.com
6. Diaz-Chico JC, et al. The detection of beta-globin gene mutation in beta-thalassemia using oligonucleotide probes and amplified DNA Biochim Biophys Acta 1988；949：43.
7. Pirastu M, et al. Initiation condon mutation as a cause of alpha-thalassemia J Biol Chem 1984；259：12315.
8. Olivieri NF, et al. An alpha-globin gene initiation codon mutation in a black family with HbH disease. Blood 1987；70：729.
9. Fucharoen S, et al. Beta-thalassemia associated with α-thalassemia in thailand. Hemoglobin 1988；12：581.
* 本工作得到京港学术交流中心及香港大学生化系资助
(1989年9月25日收稿 1990年2月10日修回), http://www.100md.com(谢慎思1 谭荣安2 林关绵仙2 胡玉娟2 顾银良3 Anifa M. C. Li4)
单位：1. 湖南医科大学分子生物学研究室，长沙，邮政编码 410078；2. 香港大学生化系；3. 上海医科大学；4. 香港大学附属玛丽医院儿科
关键词：地中海贫血；核苷酸；密码子
中华医学杂志900506
提要 用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称PCR)体外选择性地扩增β-珠蛋白基因的两个片段后，与我国人中常见的6种β-地贫突变相应的探针进行初筛，并进行直接双链DNA顺序分析。发现1例新的β-地贫突变，在β-珠蛋白基因起始密码子(ATG)中T→G，突变取消了该区的一个NcoI位点，故可用NcoI酶切PCR产物以直接证实该变异的存在，可用于产前诊断。此外，先证者尚携带有另一β41/42(-4bp)等位基因，且复合有α-地贫-2，右侧缺失3.7kbI型杂合子，是一极罕见的双重复合杂合子。
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β-地中海贫血(β-地贫)，是由于β-珠蛋白基因突变导致β-珠蛋白肽链肌如(β°)或合成不足(β+)而引起的遗传性溶血性贫血病。其突变的分子基础具有异质性，其主要分子损害或为点突变；或为核苷酸序列的小片段缺失或插入，在各民族中有各自常见的突变类型。在我国人群中，已知β-地贫突变有β41/42(-4bp)，IVS-2-654(G→T)；β-28(A→G)；β17(A→T)；β71/72(+A)；IVS-1-5(C→T)；β43(G→T)；β34(+4)；β-29(A→G)；β30(T→C)等[1～3]，特别是前6种较为常见。最近我们通过对聚合酶链式反应扩增的β-珠蛋白基因片段的直接测序，发现中国人中一个新的单核苷酸取代，是在β-珠蛋白基因的起始密码子ATG→AGG，并对先证者父母进行了同样研究证实。
材料和方法
DNA样品系从β-地贫病人及其父母的外周血白细胞分离制备。先证者，女性，1岁半，系香港人，为香港大学医学院儿科系血液室住院病人。
, 百拇医药
体外基因扩增，根据Saiki等[4，5]的方法改良，常规扩增β-珠蛋白基因两个片段，分别用引物A+B或C+D，其片段大小分别为746bp和584bp。此寡聚核苷酸引物在β-珠蛋白基因中的定位及核苷酸顺序见图1。每一扩增反应用基因组DNA1μg，引物对各50pmol/L，在95°C5分钟，使DNA变性解链后，加入2～5U Taq(Thermus Aquaticus)DNA聚合酶(New England Biolabs产品)，然后在45°C退火40秒钟、67°C3分钟使DNA链延长，之后再93°C30秒、45°C40秒、67°C3分钟，如此循环30次，最后一个循环在67°C10分钟，使未完成的DNA链充分延长，反应产物经1.5%琼脂糖胶电泳检测，溴乙啶染色，紫外摄影。
引物及探针顺序：
A，5′-GGACAGGTACGGCTGTCATCACTTA3′
, 百拇医药
B，5′-TCATTCGTCTGTTTCCCATTCTAAA3′
C，5′-TGATACAATGTTATCATGCCTCTTTG3′
D，5′-GCACTGACCTGGGACATTCCCTTTT3′
E，5′-GGTTGGCCAATCTACTCCC3′
-28 N 5′-GCTGGGCAAAAGTCAGG3′
M 5′-GCTGGGCATAGAAGTCAGG3′
41/42 N 5′-AAGGACTCAAAGAACCTCT3′
M 5′-CAGAGGTTGAGTTCCTTTGG3′
, 百拇医药
IVS-2-654 N 5′-GGGTTAAGGCAATAGCAAT3′
M 5′-ATTGCTATTACCTTAACCC3′
17 M 5′-CTGTGGGGCTAAGGTGAACG3′
71/72 M 5′-GGTGCCTTTAAGTGATGGC3′
图1 β-地贫的5种突变类型在β-珠蛋白基因中的定位及用于PCR的4种引物(A、B、C、D)及1种测序引物E的定位及A+B，C+D所扩增片段大小示意图
斑点杂交分析：用六种突变探针及三种正常探针检测(探针顺序见图1)，根据文献[6]方法加以改良，将1/10至1/20聚合酶链式反应(PCR)产物打点至Zeta-proba尼龙膜上，用32P标记的寡核苷酸探针杂交，其杂交及洗膜温度分别在Tm-3及Tm-1[Tm=4(G+C)+2(A+T)][6]。
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直接双链DNA顺序：将PCR产物纯化，碱变性后与2pmoL r32P末端标记的测序引物(其顺序见图1)退火，用测序酶(SequenaseTM,USB公司产品)按测序指南进行直接双链DNA测序。
突变的进一步证明：将PCR扩增的β-珠蛋白基因片段1(引物A+B)，用Nco消化后，以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，以溴乙啶染色，紫外摄影。
α-珠蛋白基因分析：先证者及其父母的DNA样品各10μg，分别用BamHI,Bgl Ⅱ和ApaI消化后，用32P标记的RBα1，1.5kb探针做Southern印迹杂交分析。
结 果
图2为该家系成员的红细胞溶血液经尿素-Triton-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离图谱，图中先证者的溶血液分离染色后，未见有β-珠蛋白链的区带，表明为β°地贫，其家庭成员的DNA分析见附表。
, 百拇医药
附表 先证者及其父母的DNA分析结果
α-珠蛋白基因分析
β-珠蛋白基因分析
RBα11.5kb探针
基因类型
突变类型
基因类型
Bam HI片段
Bgl Ⅱ片段
Apa Ⅰ片段
41/42
(-4bp)
, 百拇医药
起始
T→G
父
14，12，7.0
2.7，1.7
0.89，αα/αα
-
+
βA/β°
母
14，10
16，12，7.0
2.5，0.89
, 百拇医药
αα/-α3.7
+
-
β°/βA
先证者
14，10
16，12，7.0
2.5，2.7，1.7
0.89
αα/-α3.7
+
+
, http://www.100md.com β°/β°
1.先证者 2.父 3.母
图2 红细胞溶血液经尿素-Triton-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Taq DNA聚合酶的高反应温度，既有利于引物与DNA专一性退火，又增加了反应速度，使扩增后产物经凝胶电泳，溴乙啶染色后，区带清晰可见(图3)。
1为ΦX174RF DNA HeaⅢ片段分子量标志2、3、4分别为先证者、父、母的基因组DNA扩增的样品
图3 经PCR法扩增的DNA的琼脂糖凝胶电泳图
, 百拇医药
先证者及其父母的DNA以PCR扩增后的产物打点至Zeta-Proba尼龙膜上，并与r32P标记的β41/42突变及正常探针杂交，其放射自显影结果(图4)表明，先证者为β41/42(-4bp)的杂合子，其异常基因来自母系。进一步将PCR产物纯化、变性、用测序酶进行直接双链DNA测序，结果(图5)表明，先证者的另一β-珠蛋白基因起始密码子(ATG)中发生一新的点突变，即T→G，且此变异来自父系。由于此突变取消了β-珠蛋白基因在这一区域内的一个NcoI位点(CCATGG)(图6a)，故先证者及其父母的DNA经扩增后产物，用NcoI酶切后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳、溴乙啶染色后，可直接分析(图6b)，结果表明其母与正常对照组DNA经NcoI酶切后，原扩增的746bp带，产生了两个较短的片段(562bp和184bp)，而先证者及其父则出现一未被消化的区带，由此进一步证实其起始密码子突变(T→G)，从而在该区取消了一个NcoI位点，此结果说明该新的变异来自父系。从上述可见先证者实为β起始(T→G)/β41/42(-4bp)的复合杂合子。
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N：表示正常探针
M：表示突变探针
15：先证者
15A：父
15B：母
14、19：为对照样品
图4 PCR扩增的DNA样品dot blot杂交放射自显影图
图5 PCR扩增的基因组DNA直接双链测序(1)CCAT(G)GGTGCA
(2)CCATGGTGCA(3)CCAT(G)GGTGCA
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图6(a) 起始密码子突变的直接证明——扩增的
β-珠蛋白基因746bp片段的定位及NcoI位点在基因上的定位
图6(b) 起始密码子突变的直接证明——PCR产物经NCO I酶以后，1.5%琼脂糖凝胶电泳图(2.正常对照 3.先证者 4.先证者之父 5.先证者之母)
此外，该家系成员DNA均分别经BamHI和Bgl Ⅱ及ApaⅠ酶切后，用RBα-1(1.5kb)探针进行Southern印迹分析，先证者及其母出现14.5kb和10.5kb的Bam HI片段；16，12和7.0kb的Bel Ⅱ片段以及2.5kb和0.89kb的ApaⅠ片段，综合此结果，说明先证者为遗传性α-地贫-2杂合子/β°地贫复合杂合子，即为一双重复合杂子。其母系α-地贫-2杂合子/β-地贫杂合子，即α/β地贫复合杂合子。其基因系谱分析结果见图7。
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图7 先证者基因型系谱分析
讨 论
本例起始密码子ATG→AGG突变属首次报道，是引起β-地贫的又一新类型。因起始密码子突变导致α-地贫早已有所报道[7～9]，是一罕见的类型，由于起始密码子突变，引起该区一个NcoⅠ位点消失，故可用NcoⅠ酶切PCR扩增的DNA，直接检出该变异(图6)，α-地贫中起始密码子突变亦有NcoI位点消失。β-地贫突变导致限制酶位点改变，早已有报道，目前已发现者约14种[1]。此为具有该类突变的高危患儿的产前诊断提供了更简单、快速、直接的非同位素方法。
此外，先证者携带的β41/42(-4bp)突变，为中国人最常见的突变类型，约占34%～46%[1]，但此类双重杂合子尚属罕见，而复合有α-地贫-2，右侧缺失，3.7kb(I)型杂合子(-α3，7)形成双重复合杂合子则更属罕见。至今未见有类似报道。而其母为α/β地贫复合杂合子亦属少见类型。
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β-地贫突变的阐明是确立产前诊断的前提，应用体外基因扩增技术来确定β-地贫突变，是可用斑点印迹杂交法，用我国人中常见的6种突变相应的探针，对常见突变进行初步筛选，而对未知突变类型则常需进一步作顺序分析来加以确定。我们用PCR扩增的基因组DNA直接测序技术，仅需1～2μgDNA样品，便能简便、快速地在1周内获得满意结果，此对产前诊断十分有利。
参考文献
1. Kazazian HH Jr, Boehm CD. Molecular basis and prenatal diagnosis of beta-thalassemia. Blood 1988；72：1107.
2. Orkin SH, Kazazian HH Jr. The mutation and polymorphism of the human beta-globin gene and its surrounding DNA. Annu Rev Genet 1984；18：131.
, http://www.100md.com
3. Zhang JZ, et al. Molecular basis of betathalassemia in south China strategy for DNA analysis. Hum Genet 1988；78：37.
4. Saiki RK, et al. Enxymatic amplification of betaglobin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985；230：1350.
5. Cai SP, et al. A simpie approach to prenatal diag nosis of β-Thalassemia in a geograhic area where multiple nutations occur. Blood 1988；71：1357.
, http://www.100md.com
6. Diaz-Chico JC, et al. The detection of beta-globin gene mutation in beta-thalassemia using oligonucleotide probes and amplified DNA Biochim Biophys Acta 1988；949：43.
7. Pirastu M, et al. Initiation condon mutation as a cause of alpha-thalassemia J Biol Chem 1984；259：12315.
8. Olivieri NF, et al. An alpha-globin gene initiation codon mutation in a black family with HbH disease. Blood 1987；70：729.
9. Fucharoen S, et al. Beta-thalassemia associated with α-thalassemia in thailand. Hemoglobin 1988；12：581.
* 本工作得到京港学术交流中心及香港大学生化系资助
(1989年9月25日收稿 1990年2月10日修回), http://www.100md.com(谢慎思1 谭荣安2 林关绵仙2 胡玉娟2 顾银良3 Anifa M. C. Li4)