应用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶建立帕金森病动物模型的实验研究
作者：陈生弟 徐德隆 余慧贞 盛锦根 汤克俭 王志刚 梁蒲芳 唐琴梅 徐修蓉
单位：陈生弟 徐德隆 余慧贞 盛锦根 汤克俭(上海第二医科大学附属瑞金医院神经科200025)；王志刚 梁蒲芳(上海第二医科大学病理解剖教研室)；唐琴梅 徐修蓉(中国科学院上海药物研究所)
关键词：帕金林病；动物，实验；多巴胺；脑啡肽类
中华医学杂志900504
提要 给恒河猴和C57BL小鼠应用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)后，对实验动物产生的行为、生化和病理改变进行了研究。结果发现实验组猴和鼠分别表现出帕金森病样症状和爬杆试验障碍；猴黑质、壳核、尾状核多巴胺(DA)和鼠纹状DA、甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽含量显著降低；猴和鼠黑质DA神经元严重变性。
, 百拇医药
帕金林病(PD)是老年期常见的神经系统变性疾病。近年来，PD的病因学研究取得了很大的进展，尤其在环境因素研究方面，如新近发现的嗜神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)就是典型例证[1]。我们应用MPTP建立恒河猴和小鼠PD动物模型，以便研究脑神经递质、神经肽及神经病理学的改变，试图探讨PD的发病机理。
材料与方法
实验动物取正常雄性恒河猴9只，体重2.3～7.0kg，平均4.5kg；雄性C57BL小鼠33只，平均体重25g。将上述动物随机分为对照组(猴3只，鼠18只)和实验组(猴6只，鼠15只)。MPTP溶于0.9%生理盐水。采用猴下肢隐静脉注射给药，鼠腹腔注射给药。实验组用药剂量和时间，1只猴按0.35mg/kg给MPTP，第1天3次，第2、3天各给2次；1只猴按0.5mg/kg给药，第1天3次，第2、3天各给2次；2只猴按0.3mg/kg给药，1次/天，共4天，然后按0.38mg/kg，1次/天，共3天；2只猴按0.35mg/kg给药，1次/天，共5天，停3天，然后再给3天。15只鼠每只按36mg/kg给药，1次/天，共7天。实验组猴产生PD症状后口服Madopar治疗。对照组3只猴和18只鼠均给每日相应量的生理盐水。
, 百拇医药
服药后用录像、摄影和爬杆试验等方法记录观察猴和鼠的行为活动。将猴和鼠分别于MPTP末次注射后10、14和21天处死。采用高效液相色谱-电化学法(HPLC-EC)[2]检测猴黑质、壳核、尾状和鼠纹状体多巴胺(DA)、3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)含量。采用放射免疫法检测鼠纹状体甲硫氨酸脑啡肽(MEK)和亮氨酸脑啡肽(LEK)含量，并用t检验进行统计学处理。采用光、电镜技术观察猴黑质、尾状枋、豆状枋、迷走背枋、兰斑和额叶皮质及鼠黑质和纹状体的神经病理学改变。
结 果
一、行为改变
1. MPTP应用后的急性反应：实验组猴在第2或第4次静注MPTP后2～3分钟均出现不同程度的瞳孔扩大、瞌睡、间歇性闭眼、流涎、心跳增快、身体摇晃，深吸气、仰或俯卧，头、口唇和四肢震颤，头后仰或转向一侧，对声音或痛刺激仅有睁眼凝视或惊恐反应，以及大小便次数增多等现象。以后每次用药该反应重复出现，每次持续5～30分钟。实验组鼠在第6～7次MPTP注射后30～45分钟，出现躯干震颤、竖毛、尾巴过伸及动作减少。同时出现爬杆试验障碍表现(秩和检验法，P〈0.005)，约持续2～3小时。
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2. MPTP应用后的PD症状：在MPTP开始注射后的第4～6天起，实验组猴均逐渐表现为表情呆滞、两眼凝视、瞬目减少、背弓起、行动迟缓、动作减少、肢体姿势性震颤、肌张力增高、发音低弱、吞咽困难；有时表现出短暂发作性行为异常(矛盾性运动)或运动丧失(冻结现象)。症状逐日加重，以致几乎不能活动，仅能俯卧或侧卧，进食困难，每日必需鼻饲牛奶或依靠鼻饲Madopar维持生命。
3. PD猴对治疗的反应：给PD猴口服Madopar 125～250mg/次，一般在20分钟后症状开始缓解，1～1.5小时后症状改善最为明显。每次治疗症状改善约维持3～4小时。
二、神经生化改变
1. 应用HPLC-EC测定对照组和实验组猴黑质、壳核、尾状核和鼠纹状体DA、DOPAC和HVA含量的结果见表1，2。可见实验组接受MPTP注射后，猴的黑质、壳核、尾状核和小鼠的纹状体中DA、DOPAC和HVA含量与对照组比较显著减少，其中DA分别减少72.5%、93.3%、91.2%和94.0%(P<0.05～0.001)；DOPAC分别减少91.3%、95.1%、93.5%和61.0%(P〈0.05～0.001)；HVA分别减少76.4%、71.4%、85.1%和65.0%(P〈0.05～0.001)。
, 百拇医药
表1 MPTP对恒河猴黑质、壳核和尾状枋DA、DOPAC、HVA含量的影响 组别
动物数(只)
±
(ng/g湿重组织)
DA
DOPAC
HVA
实验组
5～6
黑质
811±571**
, 百拇医药
397±191*
2732±1342**
壳核
196±75**
147±86
1715±931
尾状枋
396±529*
103±114***
1025±480*
对照组
2～3
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黑质
2949±933
4580±5026
11582±1161
壳枋
2931±1032
3010±1375
5995±2539
尾状核
4510±3001
1577±427
6887±8899
, 百拇医药
注： 与对照组相比，*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001
表2 MPTP对鼠纹状体DA、DOPAC、HVA含量的影响 组别
鼠数(只)±(ng/g湿重组织)
DA
DOPAC
HVA
实验组
7
0.8±0.4**
, 百拇医药
0.7±0.4*
0.60±0.08**
对照组
12
13.1±0.9
1.8±0.2
1.70±0.10
注：与对照组相比，*P〈0.05，**P〈0.001
2. 应用放射免疫法测定对照组和实验组鼠纹状体MEK、LEK含量的结果见表3。可见实验组鼠接受MPTP注射后，纹状体中脑啡肽含量与对照组相比显著减少，其中MEK减少75%(P〈0.001)，LEK减少66%(P〈0.005)。
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表3 MPTP对小鼠纹状体脑啡肽含量的影响 组别
鼠数(只)±(ng/g湿重组织)
MEK
LEK
实验组
7
273±60**
72±18*
对照组
12
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1069±112
209±26
注：与对照组相比，*P〈0.005，**P〈0.001
三、神经病理改变
光镜：实验组猴黑质神经元明显脱失，胶质细胞增生，残留神经元固缩、变性坏死或脱髓鞘，部分细胞胞浆明显肿胀、空泡变性；鼠黑质背侧部神经元减少。其它部位无明显异常改变。
电镜：实验组猴和鼠黑质神经元固缩，神经元周围的神经毯软化，血管壁破损和出血，胶质细胞增生，出现双核并列，并可见猴豆状核和鼠纹状体胶质细胞突起水肿。
讨 论
MPTP于1947年首次由Ziering等合成[3]，系呱替啶同类物1-甲基-4-苯基-4-丙酸氧呱啶(APPP)的衍生物[4]，其神经毒性作用当时并未引起人们注意。至1979年，一位美国青年因注射药物内含MPTP而产生了严重的帕金森氏综合征[5]，从而MPTP的神经毒性作用才逐渐被人们所认误识。Burns等[6]首先报道应用MPTP成功地制备恒河猴PD动物模型。不久，其他学者也报道了应用MPTP制备成C57BL小鼠纹状体DA不足动物模型[7，8]。本组实验选用恒河猴和C57BL小鼠作为实验动物静脉或腹腔注射MPTP，实验猴和鼠早期出现了急性血清素样反应。实验的第4～6天起，实验组猴均逐渐出现了PD症状，且四种给药剂量，全部制成PD动物模型，其中以后两种剂量更为理想。应用抗PD药物Madopar能暂时使PD症状明显改善，停药后症状则又重现。不能治愈符合人类PD的临床特征。采用HPLC-EC法测定实验组猴黑质、壳核、尾状核和鼠纹状体DA及其代谢产物的含量结果均显著降低。光镜检查实验组猴和鼠选择性黑质神经元变性。表明MPTP主要选择性地损害黑质DA神经元，造成黑质纹状体系统DA含量显著降低，从而导致PD样症状的产生。至于本实验组猴和鼠在应用MPTP时早期出现的急性反应，可能是由于MPTP直接对去甲肾上腺素和5-羟色胺能系统或阿片受体功能的影响所致[1，9，10]。本组实验光镜观察结果与Burns等[6，11]报道一致。然而，本组实验用电镜观察到了实验组猴的豆状核和鼠的纹状体胶质细胞突起水肿。表明人类PD的病理变化特征，除了黑质神经元变性为其主要特点外，脑的其它区域的神经元亦同时受累；而由MPTP引起猴和鼠的病理变化也表现为上述特点。
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此外，本组实验除对MPTP引起DA改变的研究外，同时对脑啡肽有无改变进行了测定。结果发现应用MPTP后，实验组鼠纹状体MEK和LEK含量比对照组分别减少75%和66%。虽然小鼠在应用MPTP后表现出的症状不如猴典型，但在纹状体DA及其代谢产物的变化和黑质神经元变性方面与猴的生化、病理变化甚为相似，故可认为是一个较理想的PD动物模型。
MPTP分别由美国国立卫生研究院R.S.Burns博士和中国科学院上海药物研究所张鸿良高级工程师赠送和合成，谨致谢意
参考文献
1. Ballard PA, et al. Permanent human parkinsonism due to 1-methy1-4-pheny1-1,2,3,6-tetrahydropynidine(MPTP): seven cases. Neurol 1985；35：949.
, 百拇医药
2. 徐修蓉，等.以D-樟脑-β磺酸为离子对试剂反相高效液相色谱测定大鼠脑组织中生物胺及其代谢产物.中国药物学报 1987；8：113.
3. Ziering A, et al. Piperidine derivatives. Part Ⅲ 4-arypiperidines. J Org Chem 1947；12：894.
4. Blume E. Street drugs yield primate parkinson's model. JAMA 1983；250：13.
5. Davis GC, et al. Chronic parkinsonism secondary to intravenous injection of meperidine analogues, Psychiatry Res 1979；1：249.
, 百拇医药
6. Burns RS, et al. A primate model of parkinsonism Selective destruction of dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra by N-methy1-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Proc Natl Acad Sci USA 1983；80：4546.
7. Heikkila RE, et al. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine in mice. Science 1984；224：1451.
8. Hallman H, et al. Neurochemical and histochemical characterization of the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine on brain catecholamine neurons in the mouse. J Neurochem 1985；44：117.
, 百拇医药
9. Langston JW. et al. Pargyline prevents MPTP-induced parkinsonism in primates. Science 1984；225：1480.
10. Langston JW. MPTP neurotoxicity: an overview and characterization of phases of toxicity. Life Sci 1985；36：201.
11. Langston JW, et al. Selective nigral toxicity after systemic administration of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)in the squirrel monkey. Brain Res 1984；292：390.
(1989年10月10日收稿), 百拇医药
单位：陈生弟 徐德隆 余慧贞 盛锦根 汤克俭(上海第二医科大学附属瑞金医院神经科200025)；王志刚 梁蒲芳(上海第二医科大学病理解剖教研室)；唐琴梅 徐修蓉(中国科学院上海药物研究所)
关键词：帕金林病；动物，实验；多巴胺；脑啡肽类
中华医学杂志900504
提要 给恒河猴和C57BL小鼠应用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)后，对实验动物产生的行为、生化和病理改变进行了研究。结果发现实验组猴和鼠分别表现出帕金森病样症状和爬杆试验障碍；猴黑质、壳核、尾状核多巴胺(DA)和鼠纹状DA、甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽含量显著降低；猴和鼠黑质DA神经元严重变性。
, 百拇医药
帕金林病(PD)是老年期常见的神经系统变性疾病。近年来，PD的病因学研究取得了很大的进展，尤其在环境因素研究方面，如新近发现的嗜神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)就是典型例证[1]。我们应用MPTP建立恒河猴和小鼠PD动物模型，以便研究脑神经递质、神经肽及神经病理学的改变，试图探讨PD的发病机理。
材料与方法
实验动物取正常雄性恒河猴9只，体重2.3～7.0kg，平均4.5kg；雄性C57BL小鼠33只，平均体重25g。将上述动物随机分为对照组(猴3只，鼠18只)和实验组(猴6只，鼠15只)。MPTP溶于0.9%生理盐水。采用猴下肢隐静脉注射给药，鼠腹腔注射给药。实验组用药剂量和时间，1只猴按0.35mg/kg给MPTP，第1天3次，第2、3天各给2次；1只猴按0.5mg/kg给药，第1天3次，第2、3天各给2次；2只猴按0.3mg/kg给药，1次/天，共4天，然后按0.38mg/kg，1次/天，共3天；2只猴按0.35mg/kg给药，1次/天，共5天，停3天，然后再给3天。15只鼠每只按36mg/kg给药，1次/天，共7天。实验组猴产生PD症状后口服Madopar治疗。对照组3只猴和18只鼠均给每日相应量的生理盐水。
, 百拇医药
服药后用录像、摄影和爬杆试验等方法记录观察猴和鼠的行为活动。将猴和鼠分别于MPTP末次注射后10、14和21天处死。采用高效液相色谱-电化学法(HPLC-EC)[2]检测猴黑质、壳核、尾状和鼠纹状体多巴胺(DA)、3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)含量。采用放射免疫法检测鼠纹状体甲硫氨酸脑啡肽(MEK)和亮氨酸脑啡肽(LEK)含量，并用t检验进行统计学处理。采用光、电镜技术观察猴黑质、尾状枋、豆状枋、迷走背枋、兰斑和额叶皮质及鼠黑质和纹状体的神经病理学改变。
结 果
一、行为改变
1. MPTP应用后的急性反应：实验组猴在第2或第4次静注MPTP后2～3分钟均出现不同程度的瞳孔扩大、瞌睡、间歇性闭眼、流涎、心跳增快、身体摇晃，深吸气、仰或俯卧，头、口唇和四肢震颤，头后仰或转向一侧，对声音或痛刺激仅有睁眼凝视或惊恐反应，以及大小便次数增多等现象。以后每次用药该反应重复出现，每次持续5～30分钟。实验组鼠在第6～7次MPTP注射后30～45分钟，出现躯干震颤、竖毛、尾巴过伸及动作减少。同时出现爬杆试验障碍表现(秩和检验法，P〈0.005)，约持续2～3小时。
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2. MPTP应用后的PD症状：在MPTP开始注射后的第4～6天起，实验组猴均逐渐表现为表情呆滞、两眼凝视、瞬目减少、背弓起、行动迟缓、动作减少、肢体姿势性震颤、肌张力增高、发音低弱、吞咽困难；有时表现出短暂发作性行为异常(矛盾性运动)或运动丧失(冻结现象)。症状逐日加重，以致几乎不能活动，仅能俯卧或侧卧，进食困难，每日必需鼻饲牛奶或依靠鼻饲Madopar维持生命。
3. PD猴对治疗的反应：给PD猴口服Madopar 125～250mg/次，一般在20分钟后症状开始缓解，1～1.5小时后症状改善最为明显。每次治疗症状改善约维持3～4小时。
二、神经生化改变
1. 应用HPLC-EC测定对照组和实验组猴黑质、壳核、尾状核和鼠纹状体DA、DOPAC和HVA含量的结果见表1，2。可见实验组接受MPTP注射后，猴的黑质、壳核、尾状核和小鼠的纹状体中DA、DOPAC和HVA含量与对照组比较显著减少，其中DA分别减少72.5%、93.3%、91.2%和94.0%(P<0.05～0.001)；DOPAC分别减少91.3%、95.1%、93.5%和61.0%(P〈0.05～0.001)；HVA分别减少76.4%、71.4%、85.1%和65.0%(P〈0.05～0.001)。
, 百拇医药
表1 MPTP对恒河猴黑质、壳核和尾状枋DA、DOPAC、HVA含量的影响 组别
动物数(只)
±(ng/g湿重组织)DA
DOPAC
HVA
实验组
5～6
黑质
811±571**
, 百拇医药
397±191*
2732±1342**
壳核
196±75**
147±86
1715±931
尾状枋
396±529*
103±114***
1025±480*
对照组
2～3
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黑质
2949±933
4580±5026
11582±1161
壳枋
2931±1032
3010±1375
5995±2539
尾状核
4510±3001
1577±427
6887±8899
, 百拇医药
注： 与对照组相比，*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001
表2 MPTP对鼠纹状体DA、DOPAC、HVA含量的影响 组别
鼠数(只)
±(ng/g湿重组织)DA
DOPAC
HVA
实验组
7
0.8±0.4**
, 百拇医药
0.7±0.4*
0.60±0.08**
对照组
12
13.1±0.9
1.8±0.2
1.70±0.10
注：与对照组相比，*P〈0.05，**P〈0.001
2. 应用放射免疫法测定对照组和实验组鼠纹状体MEK、LEK含量的结果见表3。可见实验组鼠接受MPTP注射后，纹状体中脑啡肽含量与对照组相比显著减少，其中MEK减少75%(P〈0.001)，LEK减少66%(P〈0.005)。
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表3 MPTP对小鼠纹状体脑啡肽含量的影响 组别
鼠数(只)
±(ng/g湿重组织)MEK
LEK
实验组
7
273±60**
72±18*
对照组
12
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1069±112
209±26
注：与对照组相比，*P〈0.005，**P〈0.001
三、神经病理改变
光镜：实验组猴黑质神经元明显脱失，胶质细胞增生，残留神经元固缩、变性坏死或脱髓鞘，部分细胞胞浆明显肿胀、空泡变性；鼠黑质背侧部神经元减少。其它部位无明显异常改变。
电镜：实验组猴和鼠黑质神经元固缩，神经元周围的神经毯软化，血管壁破损和出血，胶质细胞增生，出现双核并列，并可见猴豆状核和鼠纹状体胶质细胞突起水肿。
讨 论
MPTP于1947年首次由Ziering等合成[3]，系呱替啶同类物1-甲基-4-苯基-4-丙酸氧呱啶(APPP)的衍生物[4]，其神经毒性作用当时并未引起人们注意。至1979年，一位美国青年因注射药物内含MPTP而产生了严重的帕金森氏综合征[5]，从而MPTP的神经毒性作用才逐渐被人们所认误识。Burns等[6]首先报道应用MPTP成功地制备恒河猴PD动物模型。不久，其他学者也报道了应用MPTP制备成C57BL小鼠纹状体DA不足动物模型[7，8]。本组实验选用恒河猴和C57BL小鼠作为实验动物静脉或腹腔注射MPTP，实验猴和鼠早期出现了急性血清素样反应。实验的第4～6天起，实验组猴均逐渐出现了PD症状，且四种给药剂量，全部制成PD动物模型，其中以后两种剂量更为理想。应用抗PD药物Madopar能暂时使PD症状明显改善，停药后症状则又重现。不能治愈符合人类PD的临床特征。采用HPLC-EC法测定实验组猴黑质、壳核、尾状核和鼠纹状体DA及其代谢产物的含量结果均显著降低。光镜检查实验组猴和鼠选择性黑质神经元变性。表明MPTP主要选择性地损害黑质DA神经元，造成黑质纹状体系统DA含量显著降低，从而导致PD样症状的产生。至于本实验组猴和鼠在应用MPTP时早期出现的急性反应，可能是由于MPTP直接对去甲肾上腺素和5-羟色胺能系统或阿片受体功能的影响所致[1，9，10]。本组实验光镜观察结果与Burns等[6，11]报道一致。然而，本组实验用电镜观察到了实验组猴的豆状核和鼠的纹状体胶质细胞突起水肿。表明人类PD的病理变化特征，除了黑质神经元变性为其主要特点外，脑的其它区域的神经元亦同时受累；而由MPTP引起猴和鼠的病理变化也表现为上述特点。
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此外，本组实验除对MPTP引起DA改变的研究外，同时对脑啡肽有无改变进行了测定。结果发现应用MPTP后，实验组鼠纹状体MEK和LEK含量比对照组分别减少75%和66%。虽然小鼠在应用MPTP后表现出的症状不如猴典型，但在纹状体DA及其代谢产物的变化和黑质神经元变性方面与猴的生化、病理变化甚为相似，故可认为是一个较理想的PD动物模型。
MPTP分别由美国国立卫生研究院R.S.Burns博士和中国科学院上海药物研究所张鸿良高级工程师赠送和合成，谨致谢意
参考文献
1. Ballard PA, et al. Permanent human parkinsonism due to 1-methy1-4-pheny1-1,2,3,6-tetrahydropynidine(MPTP): seven cases. Neurol 1985；35：949.
, 百拇医药
2. 徐修蓉，等.以D-樟脑-β磺酸为离子对试剂反相高效液相色谱测定大鼠脑组织中生物胺及其代谢产物.中国药物学报 1987；8：113.
3. Ziering A, et al. Piperidine derivatives. Part Ⅲ 4-arypiperidines. J Org Chem 1947；12：894.
4. Blume E. Street drugs yield primate parkinson's model. JAMA 1983；250：13.
5. Davis GC, et al. Chronic parkinsonism secondary to intravenous injection of meperidine analogues, Psychiatry Res 1979；1：249.
, 百拇医药
6. Burns RS, et al. A primate model of parkinsonism Selective destruction of dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra by N-methy1-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Proc Natl Acad Sci USA 1983；80：4546.
7. Heikkila RE, et al. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine in mice. Science 1984；224：1451.
8. Hallman H, et al. Neurochemical and histochemical characterization of the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine on brain catecholamine neurons in the mouse. J Neurochem 1985；44：117.
, 百拇医药
9. Langston JW. et al. Pargyline prevents MPTP-induced parkinsonism in primates. Science 1984；225：1480.
10. Langston JW. MPTP neurotoxicity: an overview and characterization of phases of toxicity. Life Sci 1985；36：201.
11. Langston JW, et al. Selective nigral toxicity after systemic administration of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)in the squirrel monkey. Brain Res 1984；292：390.
(1989年10月10日收稿), 百拇医药