DNA定量分析大肠癌患者预后的研究
作者：崔凤东 喻德洪 秦鸿义 屠岳 孔宪涛 张鲁榕 张洁
单位：崔凤东 喻德洪 秦鸿义 屠岳(上海，第二军医大学长海医院 200433)；孔宪涛 张鲁榕 张洁(上海，第二军医大学长征医院)
关键词：流动血细胞计数；结肠肿瘤；直肠肿瘤；脱氧核糖核酸
摘要 对100例根治性结
摘要 对100例根治性结、直肠癌患者的手术标本进行了流式细胞DNA定量分析，探讨DNA倍体对结直肠癌患者的预后价值及与其他病理指标的关系。结果表明，DNA倍体不仅是一个可靠的、有价值的预后指标，且对该病理分期是一个有价值的补充。
石蜡包埋组织流式细胞仪(flow cytometer，FCM)DNA定量分析是近年创立的新技术[1]，在肿瘤病理回顾性研究中有特殊的价值。我们以大肠癌石蜡包埋组织为材料，探讨了异常DNA含量对大肠癌患者的预后价值。
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材料和方法
一、材料
选择1980～1983年长海医院结肠癌及直肠癌切除术并有随访资料110例的石蜡块标本，其中根治性切除100例，姑息性切除10例。病例随访时间均超过5年。
二、方法
1. 病理观察：每个石蜡块作一张5μm切片，结合存档病理切片及报告确定病理分类、病理分期(Dukes分期)和恶性程度(Broders分级)。每例结合存档切片挑选2～3块，以其中20例患者肿瘤远端无癌组织的肠管石蜡块作正常对照。
2. FCM DNA检测：每个石蜡块切3～4片30μm的切片，通常仅取1片，较小的标本取2片，将切片完整地放入10ml玻璃试管中，加5ml二甲苯脱蜡，置37°C10分钟，重复3次。依次经5ml 100%、95%、70%和50%乙醇水化，室温，每步10分钟，蒸馏水洗涤2次，加2ml pH1.6的0.5%胃蛋白酶水溶液，置37°C水浴箱振荡消化30分钟，用2ml PBS终止消化，经160目(76μm)的尼龙网过滤，滤液以1500r/min离心5分钟，去上清液，加1%*****X-100和0.1mg/ml RNA酶(中国科学院上海生物制品研究所提供)各1ml，37°C孵育10分钟，1500r/min离心5分钟，去上清液，加1ml50μg/ml碘化丙啶摇匀，避光冷藏(0～4°C)30分钟，用260目(41μm)尼龙网过滤后用EPICSC型(美国Coulter Corp产品)FCM检测，用荧光小球调试仪器的变异系数，将红荧光的CV值稳定在2%以下，峰值定在60道，以每秒150个细胞的速度检测1万个细胞，全部标本在2小时内测完，将直方图存入磁盘。将存入的原始资料输入EASY88电子计算机系统用Coulter应用软件PARA 1程序和INTERGRA程序分析处理。20例肿瘤远端无癌组织肠管细胞DNA直方图均为两峰图形(G0G1/G2M，图1)G0G1峰的CV值为4.80±0.67s，他们与其对应的肿瘤组织DNA直方图的第1个峰完全吻合，G2M峰的百分比为7.38(s为2.50)。若肿瘤DNA直方图仅有两个峰且第2个峰占的百分比小于14.88%，该肿瘤为二倍体型，若肿瘤直方图有一个附加的G0G1峰则为非整倍体型，若这个附加的G0G1峰的DNA指数(DNA index，DI)介于1.94～2.06之间则为四倍体型(图1～3)。
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相对DNA含量 相对DNA含量
Ⅰ Ⅱ
图1 Ⅰ肠管细胞DNA直方图 Ⅱ二倍体肿瘤DNA直方图
相对DNA含量
图2 非整倍体肿瘤DNA直方图
相对DNA含量
图3 四倍体肿瘤DNA直方图
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3. 统计学处理：用寿命表法分析病例随访资料，绘制Kaplan-Meier曲线，用时序检验比较不同倍体的生存率。用x2检验分析DNA倍体与其他病理指标的关系。
结 果
一、病理分类、分期
100例根治性切除患者：腺癌88例、粘液样癌8例、乳头状癌3例、未分化癌1例；Broders分级：Ⅰ级13例、Ⅱ级59例、Ⅲ级26例、Ⅳ级2例；Dukes分期：A期22例、B期40例、C期38例，10例姑息性切除患者均为D期。
二、DNA倍体与预后的关系
100例根治性结肠癌和直接癌切除术标本中，二倍体肿瘤55例，非整倍体肿瘤36例，四倍体肿瘤9例。二倍体肿瘤患者的预后较非二倍体肿瘤患者的预后好(P<0.01),四倍体肿瘤患者的预后较非整倍体肿瘤患者的预后差(P〈0.01，图4)。
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时间(月)
图4 二倍体(A)、非整倍体(B)和四倍体(C)肿瘤患者生存曲线
DukesA、B、C3期中，二倍体肿瘤患者的5年生存率分别为100%(12/12)、96%(22/23)和60%(12/20)，而非二倍体肿瘤患者的5年生存率分别为60%(6/10)、59(10/17)和44%(8/18)，二倍体肿瘤患者的预后均较非二倍体肿瘤患者的预后好(P〈0.01)。
三、DNA倍体与其他病理指标的关系
1. DNA倍与Dukes分期的关系：DukesA、B、C、D期中非二倍体的比例分别为45%、43%、47%、100%。Dukes A、B、C期中非二倍体的比较差异无显著意义(P〉0.05)，Dukes D期非二倍体的比例较Dukes A、B、C期高(P〈0.01)。
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2. DNA倍体与肿瘤恶性程度的关系：统计88例结肠腺癌及直肠腺癌Ⅰ、Ⅱ级肿瘤非二倍体的比例为37%(26/71)，Ⅲ级肿瘤非二倍体的比例为88%(15/17)，两者差异有显著意义(P〈0.01)。
讨 论
大肠癌病理学预后指标虽有一些传统形态学指标，但其预计非转移性大肠癌复发方面仅有50～70%的正确性[2]。现行预后系统也存在着很多问题，首先，没有统一的方法确定大肠癌的分期，常用的有Dukes分期、改良Dukes分期及Astler-Coller分期等。这些分期方法本身尚不完备；第二，重要的病理预后指标来自术后标本的检查，术前不能确定；第三，有些形态学指标如浸润深度、分级等依赖病理学工作者的主观判断，有一定的误差。
大肠癌异质性细胞亚群的存在，对化药疗物呈现出不同的敏感性[3]。随着时间的推移，肿瘤发生细胞亚群的消长，仅在病程中的某一点获得的现行预后指标对大肠癌患者的处理是不够的，有必要探索一种准确、客观、可复复并能在术前获得的预后和治疗学指标。检测异常DNA会含量不但可作为恶性肿瘤的标志之一，且可反映肿瘤的恶性程度及生物学行为，而FCM在检测异常DNA含量方面具有简便、快速、客观、高度敏感等优点[4～9]。大肠癌细胞DNA含量与患者预后有关，二倍体和近二倍体肿瘤患者的存活期较长[10～12]，Kokal等[11]曾报道二倍体和近二倍体肿瘤患者的5年生存率是非整倍体肿瘤患者的10倍，分化较差的肿瘤中非整倍体的比例较高。本组资料亦符合上述观点。对同一病理分期中二倍体和非二倍体肿瘤患者5年生存率比较表明，DNA倍体对Dukes分期是一个极有价值的补充。
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总之，FCM DNA定量分析是一种独立、客观、简便、快速、精确、可重复并能在术前获得的预后指标，有很高的临床应用价值。
参考文献
1. Hedley DW, et al. Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material using flow cytometry. J Histochem Cytochem 1983；31：1333.
2. Temple WJ, et al. Correlation of cell cycle analysis with Dukes' staging in colon cancer patients. J Surg Res 1980；28：314.
3. Von Hoff DD. Implications of tumor cell heterogeneity for in vitro drug sensitivity testing. Semin Oncol 1985；12：327.
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4. Armitage NC, et al. The influence of tumor cell DNA abnormalities on survival in colorectal cancer. Br J Surg 1985；72：828.
5. Streffer C, et al. Predictive assays for the therapy of rectum carcinoma. Radiother Oncol 1986；5：303.
6. Finan PJ, et al. Is DNA aneuploidy a good prognostic indicator in patients with advanced colorectal cancer? Br J Cancer 1986；54：327.
7. Hedley DW, et al. Application of DNA flow cytometry to paraffin-embedded archival material for the study of aneuploidy and its clinical sign-ificance. Cytometry 1985；6：327.
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8. Tribukait B, et al. The significance of ploidy and proliferation in the clinical and biological evaluation of bladder tumors: a study of 100 untreated cases. Br J Urol 1982；54：130.
9. Fsorslund G, et al. The significance of DNA distribution pattern in rectal carcinoma. A preliminary study. Dis Colon Rectum 1984；27：579.
10. Scott NA, et al. The relative prognostic value of flow cytometric DNA analysis and conventional clinicopathologic criteria in patients with operable rectal carcinoma. Dis Colon Rectum 1987；30：513.
11. Kokal W, et al. Tumor DNA content in the prognosis of colorectal carcinoma. JAMA 1986；255：3123.
12. Linden WA, et al. Flow cytometric analysis of cervical smears and solid tumors Acta Pathol Microbiol Scand Sect(A)[Suppl] 1981；274：443.
(1989年7月28日收稿 1990年2月17日修回), http://www.100md.com
单位：崔凤东 喻德洪 秦鸿义 屠岳(上海，第二军医大学长海医院 200433)；孔宪涛 张鲁榕 张洁(上海，第二军医大学长征医院)
关键词：流动血细胞计数；结肠肿瘤；直肠肿瘤；脱氧核糖核酸
摘要 对100例根治性结
摘要 对100例根治性结、直肠癌患者的手术标本进行了流式细胞DNA定量分析，探讨DNA倍体对结直肠癌患者的预后价值及与其他病理指标的关系。结果表明，DNA倍体不仅是一个可靠的、有价值的预后指标，且对该病理分期是一个有价值的补充。
石蜡包埋组织流式细胞仪(flow cytometer，FCM)DNA定量分析是近年创立的新技术[1]，在肿瘤病理回顾性研究中有特殊的价值。我们以大肠癌石蜡包埋组织为材料，探讨了异常DNA含量对大肠癌患者的预后价值。
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材料和方法
一、材料
选择1980～1983年长海医院结肠癌及直肠癌切除术并有随访资料110例的石蜡块标本，其中根治性切除100例，姑息性切除10例。病例随访时间均超过5年。
二、方法
1. 病理观察：每个石蜡块作一张5μm切片，结合存档病理切片及报告确定病理分类、病理分期(Dukes分期)和恶性程度(Broders分级)。每例结合存档切片挑选2～3块，以其中20例患者肿瘤远端无癌组织的肠管石蜡块作正常对照。
2. FCM DNA检测：每个石蜡块切3～4片30μm的切片，通常仅取1片，较小的标本取2片，将切片完整地放入10ml玻璃试管中，加5ml二甲苯脱蜡，置37°C10分钟，重复3次。依次经5ml 100%、95%、70%和50%乙醇水化，室温，每步10分钟，蒸馏水洗涤2次，加2ml pH1.6的0.5%胃蛋白酶水溶液，置37°C水浴箱振荡消化30分钟，用2ml PBS终止消化，经160目(76μm)的尼龙网过滤，滤液以1500r/min离心5分钟，去上清液，加1%*****X-100和0.1mg/ml RNA酶(中国科学院上海生物制品研究所提供)各1ml，37°C孵育10分钟，1500r/min离心5分钟，去上清液，加1ml50μg/ml碘化丙啶摇匀，避光冷藏(0～4°C)30分钟，用260目(41μm)尼龙网过滤后用EPICSC型(美国Coulter Corp产品)FCM检测，用荧光小球调试仪器的变异系数，将红荧光的CV值稳定在2%以下，峰值定在60道，以每秒150个细胞的速度检测1万个细胞，全部标本在2小时内测完，将直方图存入磁盘。将存入的原始资料输入EASY88电子计算机系统用Coulter应用软件PARA 1程序和INTERGRA程序分析处理。20例肿瘤远端无癌组织肠管细胞DNA直方图均为两峰图形(G0G1/G2M，图1)G0G1峰的CV值为4.80±0.67s，他们与其对应的肿瘤组织DNA直方图的第1个峰完全吻合，G2M峰的百分比为7.38(s为2.50)。若肿瘤DNA直方图仅有两个峰且第2个峰占的百分比小于14.88%，该肿瘤为二倍体型，若肿瘤直方图有一个附加的G0G1峰则为非整倍体型，若这个附加的G0G1峰的DNA指数(DNA index，DI)介于1.94～2.06之间则为四倍体型(图1～3)。
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相对DNA含量 相对DNA含量
Ⅰ Ⅱ
图1 Ⅰ肠管细胞DNA直方图 Ⅱ二倍体肿瘤DNA直方图
相对DNA含量
图2 非整倍体肿瘤DNA直方图
相对DNA含量
图3 四倍体肿瘤DNA直方图
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3. 统计学处理：用寿命表法分析病例随访资料，绘制Kaplan-Meier曲线，用时序检验比较不同倍体的生存率。用x2检验分析DNA倍体与其他病理指标的关系。
结 果
一、病理分类、分期
100例根治性切除患者：腺癌88例、粘液样癌8例、乳头状癌3例、未分化癌1例；Broders分级：Ⅰ级13例、Ⅱ级59例、Ⅲ级26例、Ⅳ级2例；Dukes分期：A期22例、B期40例、C期38例，10例姑息性切除患者均为D期。
二、DNA倍体与预后的关系
100例根治性结肠癌和直接癌切除术标本中，二倍体肿瘤55例，非整倍体肿瘤36例，四倍体肿瘤9例。二倍体肿瘤患者的预后较非二倍体肿瘤患者的预后好(P<0.01),四倍体肿瘤患者的预后较非整倍体肿瘤患者的预后差(P〈0.01，图4)。
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时间(月)
图4 二倍体(A)、非整倍体(B)和四倍体(C)肿瘤患者生存曲线
DukesA、B、C3期中，二倍体肿瘤患者的5年生存率分别为100%(12/12)、96%(22/23)和60%(12/20)，而非二倍体肿瘤患者的5年生存率分别为60%(6/10)、59(10/17)和44%(8/18)，二倍体肿瘤患者的预后均较非二倍体肿瘤患者的预后好(P〈0.01)。
三、DNA倍体与其他病理指标的关系
1. DNA倍与Dukes分期的关系：DukesA、B、C、D期中非二倍体的比例分别为45%、43%、47%、100%。Dukes A、B、C期中非二倍体的比较差异无显著意义(P〉0.05)，Dukes D期非二倍体的比例较Dukes A、B、C期高(P〈0.01)。
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2. DNA倍体与肿瘤恶性程度的关系：统计88例结肠腺癌及直肠腺癌Ⅰ、Ⅱ级肿瘤非二倍体的比例为37%(26/71)，Ⅲ级肿瘤非二倍体的比例为88%(15/17)，两者差异有显著意义(P〈0.01)。
讨 论
大肠癌病理学预后指标虽有一些传统形态学指标，但其预计非转移性大肠癌复发方面仅有50～70%的正确性[2]。现行预后系统也存在着很多问题，首先，没有统一的方法确定大肠癌的分期，常用的有Dukes分期、改良Dukes分期及Astler-Coller分期等。这些分期方法本身尚不完备；第二，重要的病理预后指标来自术后标本的检查，术前不能确定；第三，有些形态学指标如浸润深度、分级等依赖病理学工作者的主观判断，有一定的误差。
大肠癌异质性细胞亚群的存在，对化药疗物呈现出不同的敏感性[3]。随着时间的推移，肿瘤发生细胞亚群的消长，仅在病程中的某一点获得的现行预后指标对大肠癌患者的处理是不够的，有必要探索一种准确、客观、可复复并能在术前获得的预后和治疗学指标。检测异常DNA会含量不但可作为恶性肿瘤的标志之一，且可反映肿瘤的恶性程度及生物学行为，而FCM在检测异常DNA含量方面具有简便、快速、客观、高度敏感等优点[4～9]。大肠癌细胞DNA含量与患者预后有关，二倍体和近二倍体肿瘤患者的存活期较长[10～12]，Kokal等[11]曾报道二倍体和近二倍体肿瘤患者的5年生存率是非整倍体肿瘤患者的10倍，分化较差的肿瘤中非整倍体的比例较高。本组资料亦符合上述观点。对同一病理分期中二倍体和非二倍体肿瘤患者5年生存率比较表明，DNA倍体对Dukes分期是一个极有价值的补充。
, 百拇医药
总之，FCM DNA定量分析是一种独立、客观、简便、快速、精确、可重复并能在术前获得的预后指标，有很高的临床应用价值。
参考文献
1. Hedley DW, et al. Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material using flow cytometry. J Histochem Cytochem 1983；31：1333.
2. Temple WJ, et al. Correlation of cell cycle analysis with Dukes' staging in colon cancer patients. J Surg Res 1980；28：314.
3. Von Hoff DD. Implications of tumor cell heterogeneity for in vitro drug sensitivity testing. Semin Oncol 1985；12：327.
, 百拇医药
4. Armitage NC, et al. The influence of tumor cell DNA abnormalities on survival in colorectal cancer. Br J Surg 1985；72：828.
5. Streffer C, et al. Predictive assays for the therapy of rectum carcinoma. Radiother Oncol 1986；5：303.
6. Finan PJ, et al. Is DNA aneuploidy a good prognostic indicator in patients with advanced colorectal cancer? Br J Cancer 1986；54：327.
7. Hedley DW, et al. Application of DNA flow cytometry to paraffin-embedded archival material for the study of aneuploidy and its clinical sign-ificance. Cytometry 1985；6：327.
, 百拇医药
8. Tribukait B, et al. The significance of ploidy and proliferation in the clinical and biological evaluation of bladder tumors: a study of 100 untreated cases. Br J Urol 1982；54：130.
9. Fsorslund G, et al. The significance of DNA distribution pattern in rectal carcinoma. A preliminary study. Dis Colon Rectum 1984；27：579.
10. Scott NA, et al. The relative prognostic value of flow cytometric DNA analysis and conventional clinicopathologic criteria in patients with operable rectal carcinoma. Dis Colon Rectum 1987；30：513.
11. Kokal W, et al. Tumor DNA content in the prognosis of colorectal carcinoma. JAMA 1986；255：3123.
12. Linden WA, et al. Flow cytometric analysis of cervical smears and solid tumors Acta Pathol Microbiol Scand Sect(A)[Suppl] 1981；274：443.
(1989年7月28日收稿 1990年2月17日修回), http://www.100md.com