电子自旋共振自旋捕集吸烟气相自由基的研究*
作者：赵保路 晏良军 候京武 忻文娟
单位：(北京，中国科学院生物物理研究所 100080)
关键词：吸烟；游离基；电子自旋共振；自旋捕集
中华医学杂志900708
摘要 应用电子自旋共振(ESR)自旋捕集技术直接观测了吸烟气相中的自由基，根据用不同自旋捕集剂，在不同溶剂中捕集的自由基所得ESR波谱的参数，对自由基进行了辨认。发现吸烟气相中主要捕集的是烷氧自由基，约占波谱成分的60～70%，另一类是烷基自由基。这对清除吸烟中的自由基和预防烟对人类造成的危害具有重要意义。
吸烟可以引起多种严重疾病，其中最严重的是癌症和心脏病。究其原因，很可能是来自吸烟中的自由基[1，2]。吸烟中的自由基分两部分，一部分存在于吸渐的焦油中，称为固相自由基，是长寿命的，主要含醌类和多环芳烃自由基，它们直接或间接与致癌物有关，用过滤嘴可以减少部分这类自由基的毒性；另一部分为吸烟气相中的自由基，是短寿命的，无法用过滤嘴的方法将其滤去。国外于1985年开始对这部分自由基进行了研究[3]。我们用电子自旋共振(ESR)自旋捕集技术，直接观察了吸烟气相中的自由基。根据所得到的ESR波谱，对自由基进行发归属。这将有助于对吸烟气相中有害自由基的清除，对预防吸烟引起的各种疾病具有重要意义。
, http://www.100md.com
材料和方法
1. 试剂：二甲基吡咯啉氮酮(5，5-dimethyl-1-pyrrolin-1-oxide，DMPO)(美国Sigma公司)。使用前经活性炭提纯，没有发现杂质ESR信号。N-特丁基-2-苯硝酮(N-tert-butyl-2-phenyl nitrone，PBN)(Aldrich Chemistry公司)，未经提纯，直接使用。其它试剂均为国产(AR级)。
2. 吸烟气相中自由基的捕集：中南海(或长乐)牌香烟由北京卷烟厂提供。用自已设计制造的连续抽烟机，流量400ml/min，或用标准间断抽烟机，35ml/2s抽1次，间隔1分钟。用Cambridge滤纸收集焦油。然后将烟气导入2ml自旋捕集溶液。烟气通入自旋捕集溶液后，捕集其中的自由基。
3. ESR测试：将捕集到的气相自由基的自旋捕集溶液从抽烟机上取出，通氮气5分钟，装入内径3mm石英管中，置ESR谐振腔测试，室温记录ESR波谱。测试条件：微波功率19.7mW，X波段，100kHz高频调制，调制幅度0.1mT。ESR波谱仪为Bruck-E200。
, 百拇医药
结果和讨论
1支中南海牌香烟气在0.01mol/L PBN的CCL4、CHCl3和苯溶液中产生的ESR波谱(图1，2)和计算的ESR波谱的超精细分裂常数(附表)可以看出，吸烟气相的自由基，主要有3类。一类是烷氧基自由基比烷基自由基(RO*)，它是主要成分，占整个波谱的60%～70%；另一类是烷基(R*)，它只占波谱的很少一部分[4]。但这并不说明，吸烟气相中烷氧自由基比烷基自由基多。因为PBN对烷基自由基的捕集效率比烷氧基自由基低，同时烷基自由基不稳定，容易转变成烷过氧基自由基[5]。此外，在四氯化碳中PBN还捕集到一种由3个峰组成的波谱，可能是由烷氧基自由基PBN转变成的烯烃氮氧基，其反应过程如下[4]：
这种推论，在PBN苯溶液捕集实验中得到进一步证实。此类3峰波谱在最初得到的ESR波谱中(图2a)并不明显，但随着时间的增加，越来越明显(图2b)，而烷氧基自由基PBN加合物的ESR波谱成分却相应减少。
, 百拇医药
图1 一支中南海牌香烟气相通过CCL4(a)、CHCl3(b)中的0.1mmol/L PBN溶液的ESR波.测试前样品通N2 5分钟
图2 一支中南海牌香烟气相通过苯中的0.01mol/L PBN溶液通N2 5分钟立即(a)及半小时(b)测得ESR波谱
附表 自旋捕集一支中南海牌香烟气相自由基ESR波谱参数 捕集剂
自由基
aN(mT)
aβH(mT)
, 百拇医药
aγH(mT)
PBN/CCL4
RO-PBN
1.39
0.18…
R-PBN
1.44
0.33…
烯烃氮氧基
1.02……
PBN/CHCl3
RO-PBN
, 百拇医药
1.39
0.21…
R-PBN
1.44
0.33…
PBN/苯
RO-PBN
1.37
0.21…
R-PBN
1.41
0.33…
烯烃氮氧基
, 百拇医药
1.04……
DMPO/苯
RO-DMPO
1.38
0.86
0.30
图3 一支中南海牌香烟气相通过苯中的0.05mol/L DMPO溶液的ESR波谱
为了进一步证实以上自由基的辨认，又用另一种自旋捕集剂DMPO捕集吸烟气相中的自由基，所得ESR波谱主要是由一个aN=1.38mT，aβH=0.86mT和aγH=0.3mT的自由基DMPO加合物的ESR波谱组成(附表)。它是和叔丁氧基自由基DMPO加合物的ESR波谱一致的[5]。除了这一主要成分外，还有一些复杂的波谱成分，但由于重叠难以进行谱线分析。说明在吸烟气相中有多种自由基成分存在，但由于DMPO对氧中心自由基捕集效率最高，所以得到了以叔丁氧基自由基自旋加合物为主的ESR波谱，和PBN捕集实验结果一致。
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另外，用PBN和DMPO水溶液捕集吸烟气相中的自由基，都未得到可检测的ESR波谱。进一步说明在吸烟气相中的自由基主要是烷氧基自由基。因为烷氧基自由基在极性介质中是不稳定的。
从香烟燃烧占到自旋捕集溶液大约为300mm，相当于从吸烟燃烧点通过气管到达肺细胞的距离。烷氧基自由基为短寿命自由基，基寿命〈1s[6]。寿命这样短的自由基不可能通过这样长的距离，即已衰变掉了。因此，可以设想，烷氧基自由基是在进入捕集剂(或肺细胞)之前形成的，而不是香烟燃烧时直接生成的。对香烟燃烧时生成哪些自由基，以及烷氧基自由基的形成过程，Pryor等[4]提出了一个吸烟气相自由基形成的稳态假说，并通过一些模型化合物得到了证实。认为吸烟气相中的自由基是不断形成和衰变的。香烟最初燃烧生成一氧化氮，一氧化氮和燃烧中生成的大部分有机物反应性不强，但在烟气流中容易和氧反应生成二氧化氮，二氧化氮很容易和烟气流中的烯烃反应，生成烷基自由基，烷基自由基非常容易氧化生成过氧基自由基。他们用一氧化氮/异丙烯/空气混合物通过在苯中的PBN溶液，得到了类似吸烟气相中自由基加合物的ESR波谱。
, http://www.100md.com
根据流行病学调查，在各种癌症死亡中，约30%是由于吸烟引起的，死于肺癌的吸烟者是非吸烟者的10倍以上。如果不吸烟，估计86%肺癌死亡可幸免。口腔癌死亡中的50～70%与吸烟有关。重度吸烟者发生喉癌的危险性是非吸烟者的20～30倍。30～40%的膀胱癌和肾癌与吸烟有关。吸烟者食管癌的发病率为非吸烟者的10倍，究其原因，也是由于吸烟产生的自由基[2]。近年研究表明，吸烟是心肌梗塞的主要因素。心脏病发病的危险性和吸烟的数量呈正比。戒烟者缺血性心脏病的死亡率低于继续吸烟者。吸烟引起心脏病可能是通过自由基机理[1]。如果能找到一种有效的方法可以清除吸烟中的自由基，那将大大减少因吸烟引起的癌症、心脏病和其它严重疾病。目前我们正在从事这方面的研究，并已取得了一些可喜的成果。
参考文献
1. 赵保路.吸烟、自由基和心脏病.自然杂志 1989；12：610.
, 百拇医药 2. 赵保路.吸烟，自由基和癌.自然杂志 1989；12：453.
3. Church DF, Pryor WA. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ Health Perspect 1985；64：111.
4. Pryor WA, et al. An ESR spin trapping study of the radicals produced in NO/Olefin reactions: a mechanism for the production of the apparently long-lived radicals in gasphase smoke. J Am Chem Soc 1984；106：5073.
5. Halpern A, Knieper J. Spin trapping of radicals in gasphase tobacco smoke In: Proceedings of the seventeenth international symposium on free radicals. Colorado, 1985：306.
6. Pryor WA, et al. An electron spin resonance study of mainstream and sidestream cigarette smoke: nature of the free radicals in gas-phase smoke and in cigarette tar Environ Health Perspect 1983；47：345.
* 国家自然科学基金资助项目
(1989年8月30日收稿 1990年4月3日修回), http://www.100md.com
单位：(北京，中国科学院生物物理研究所 100080)
关键词：吸烟；游离基；电子自旋共振；自旋捕集
中华医学杂志900708
摘要 应用电子自旋共振(ESR)自旋捕集技术直接观测了吸烟气相中的自由基，根据用不同自旋捕集剂，在不同溶剂中捕集的自由基所得ESR波谱的参数，对自由基进行了辨认。发现吸烟气相中主要捕集的是烷氧自由基，约占波谱成分的60～70%，另一类是烷基自由基。这对清除吸烟中的自由基和预防烟对人类造成的危害具有重要意义。
吸烟可以引起多种严重疾病，其中最严重的是癌症和心脏病。究其原因，很可能是来自吸烟中的自由基[1，2]。吸烟中的自由基分两部分，一部分存在于吸渐的焦油中，称为固相自由基，是长寿命的，主要含醌类和多环芳烃自由基，它们直接或间接与致癌物有关，用过滤嘴可以减少部分这类自由基的毒性；另一部分为吸烟气相中的自由基，是短寿命的，无法用过滤嘴的方法将其滤去。国外于1985年开始对这部分自由基进行了研究[3]。我们用电子自旋共振(ESR)自旋捕集技术，直接观察了吸烟气相中的自由基。根据所得到的ESR波谱，对自由基进行发归属。这将有助于对吸烟气相中有害自由基的清除，对预防吸烟引起的各种疾病具有重要意义。
, http://www.100md.com
材料和方法
1. 试剂：二甲基吡咯啉氮酮(5，5-dimethyl-1-pyrrolin-1-oxide，DMPO)(美国Sigma公司)。使用前经活性炭提纯，没有发现杂质ESR信号。N-特丁基-2-苯硝酮(N-tert-butyl-2-phenyl nitrone，PBN)(Aldrich Chemistry公司)，未经提纯，直接使用。其它试剂均为国产(AR级)。
2. 吸烟气相中自由基的捕集：中南海(或长乐)牌香烟由北京卷烟厂提供。用自已设计制造的连续抽烟机，流量400ml/min，或用标准间断抽烟机，35ml/2s抽1次，间隔1分钟。用Cambridge滤纸收集焦油。然后将烟气导入2ml自旋捕集溶液。烟气通入自旋捕集溶液后，捕集其中的自由基。
3. ESR测试：将捕集到的气相自由基的自旋捕集溶液从抽烟机上取出，通氮气5分钟，装入内径3mm石英管中，置ESR谐振腔测试，室温记录ESR波谱。测试条件：微波功率19.7mW，X波段，100kHz高频调制，调制幅度0.1mT。ESR波谱仪为Bruck-E200。
, 百拇医药
结果和讨论
1支中南海牌香烟气在0.01mol/L PBN的CCL4、CHCl3和苯溶液中产生的ESR波谱(图1，2)和计算的ESR波谱的超精细分裂常数(附表)可以看出，吸烟气相的自由基，主要有3类。一类是烷氧基自由基比烷基自由基(RO*)，它是主要成分，占整个波谱的60%～70%；另一类是烷基(R*)，它只占波谱的很少一部分[4]。但这并不说明，吸烟气相中烷氧自由基比烷基自由基多。因为PBN对烷基自由基的捕集效率比烷氧基自由基低，同时烷基自由基不稳定，容易转变成烷过氧基自由基[5]。此外，在四氯化碳中PBN还捕集到一种由3个峰组成的波谱，可能是由烷氧基自由基PBN转变成的烯烃氮氧基，其反应过程如下[4]：
这种推论，在PBN苯溶液捕集实验中得到进一步证实。此类3峰波谱在最初得到的ESR波谱中(图2a)并不明显，但随着时间的增加，越来越明显(图2b)，而烷氧基自由基PBN加合物的ESR波谱成分却相应减少。
, 百拇医药
图1 一支中南海牌香烟气相通过CCL4(a)、CHCl3(b)中的0.1mmol/L PBN溶液的ESR波.测试前样品通N2 5分钟
图2 一支中南海牌香烟气相通过苯中的0.01mol/L PBN溶液通N2 5分钟立即(a)及半小时(b)测得ESR波谱
附表 自旋捕集一支中南海牌香烟气相自由基ESR波谱参数 捕集剂
自由基
aN(mT)
aβH(mT)
, 百拇医药
aγH(mT)
PBN/CCL4
RO-PBN
1.39
0.18…
R-PBN
1.44
0.33…
烯烃氮氧基
1.02……
PBN/CHCl3
RO-PBN
, 百拇医药
1.39
0.21…
R-PBN
1.44
0.33…
PBN/苯
RO-PBN
1.37
0.21…
R-PBN
1.41
0.33…
烯烃氮氧基
, 百拇医药
1.04……
DMPO/苯
RO-DMPO
1.38
0.86
0.30
图3 一支中南海牌香烟气相通过苯中的0.05mol/L DMPO溶液的ESR波谱
为了进一步证实以上自由基的辨认，又用另一种自旋捕集剂DMPO捕集吸烟气相中的自由基，所得ESR波谱主要是由一个aN=1.38mT，aβH=0.86mT和aγH=0.3mT的自由基DMPO加合物的ESR波谱组成(附表)。它是和叔丁氧基自由基DMPO加合物的ESR波谱一致的[5]。除了这一主要成分外，还有一些复杂的波谱成分，但由于重叠难以进行谱线分析。说明在吸烟气相中有多种自由基成分存在，但由于DMPO对氧中心自由基捕集效率最高，所以得到了以叔丁氧基自由基自旋加合物为主的ESR波谱，和PBN捕集实验结果一致。
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另外，用PBN和DMPO水溶液捕集吸烟气相中的自由基，都未得到可检测的ESR波谱。进一步说明在吸烟气相中的自由基主要是烷氧基自由基。因为烷氧基自由基在极性介质中是不稳定的。
从香烟燃烧占到自旋捕集溶液大约为300mm，相当于从吸烟燃烧点通过气管到达肺细胞的距离。烷氧基自由基为短寿命自由基，基寿命〈1s[6]。寿命这样短的自由基不可能通过这样长的距离，即已衰变掉了。因此，可以设想，烷氧基自由基是在进入捕集剂(或肺细胞)之前形成的，而不是香烟燃烧时直接生成的。对香烟燃烧时生成哪些自由基，以及烷氧基自由基的形成过程，Pryor等[4]提出了一个吸烟气相自由基形成的稳态假说，并通过一些模型化合物得到了证实。认为吸烟气相中的自由基是不断形成和衰变的。香烟最初燃烧生成一氧化氮，一氧化氮和燃烧中生成的大部分有机物反应性不强，但在烟气流中容易和氧反应生成二氧化氮，二氧化氮很容易和烟气流中的烯烃反应，生成烷基自由基，烷基自由基非常容易氧化生成过氧基自由基。他们用一氧化氮/异丙烯/空气混合物通过在苯中的PBN溶液，得到了类似吸烟气相中自由基加合物的ESR波谱。
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根据流行病学调查，在各种癌症死亡中，约30%是由于吸烟引起的，死于肺癌的吸烟者是非吸烟者的10倍以上。如果不吸烟，估计86%肺癌死亡可幸免。口腔癌死亡中的50～70%与吸烟有关。重度吸烟者发生喉癌的危险性是非吸烟者的20～30倍。30～40%的膀胱癌和肾癌与吸烟有关。吸烟者食管癌的发病率为非吸烟者的10倍，究其原因，也是由于吸烟产生的自由基[2]。近年研究表明，吸烟是心肌梗塞的主要因素。心脏病发病的危险性和吸烟的数量呈正比。戒烟者缺血性心脏病的死亡率低于继续吸烟者。吸烟引起心脏病可能是通过自由基机理[1]。如果能找到一种有效的方法可以清除吸烟中的自由基，那将大大减少因吸烟引起的癌症、心脏病和其它严重疾病。目前我们正在从事这方面的研究，并已取得了一些可喜的成果。
参考文献
1. 赵保路.吸烟、自由基和心脏病.自然杂志 1989；12：610.
, 百拇医药 2. 赵保路.吸烟，自由基和癌.自然杂志 1989；12：453.
3. Church DF, Pryor WA. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ Health Perspect 1985；64：111.
4. Pryor WA, et al. An ESR spin trapping study of the radicals produced in NO/Olefin reactions: a mechanism for the production of the apparently long-lived radicals in gasphase smoke. J Am Chem Soc 1984；106：5073.
5. Halpern A, Knieper J. Spin trapping of radicals in gasphase tobacco smoke In: Proceedings of the seventeenth international symposium on free radicals. Colorado, 1985：306.
6. Pryor WA, et al. An electron spin resonance study of mainstream and sidestream cigarette smoke: nature of the free radicals in gas-phase smoke and in cigarette tar Environ Health Perspect 1983；47：345.
* 国家自然科学基金资助项目
(1989年8月30日收稿 1990年4月3日修回), http://www.100md.com