肌型肌酸激酶亚型快速测定法及其临床应用
作者：王 玻Δ 王燕玲 杨振华
单位：(北京医院检验科 100730)
关键词：
肌型肌酯激酶
肌型肌酯激酶(CK-MM)亚型的研究是近年来临床酶学中一项重要的发展[国外医学临床生物化学与检验分册1989；10：13]。CK-MM亚型是急性心肌梗塞(AMI)患者血中最早出现异常的生化指标，有助于AMI早期诊断和发病时间的判断。对溶栓治疗的患者，CK-MM亚型是判断栓塞有无溶解的最好的一项生化指标。
在CK-MM亚型研究中应用了等电聚焦、聚焦层析、高效液相色谱、免疫浸渍等方法。这些方法技术复杂，时间长，很难成为临床实验室实用方法。下面介绍的方法是在常压条件下，用20分钟就可以将CK-MM亚型分开。近一年多我们已将此方法用于临床并对19例AMI和7例心绞痛患者的CK-MM亚型变化进行了初步分析。
, 百拇医药
一、方法
取9.5×8.5cm玻璃片，在水平板上浇以溶化的2%琼脂糖缓冲液(pH6.6)12ml，成胶后在距阴极侧1.5cm处放一加样条，每孔加标本10μl，待数分钟后用滤纸条沾去多余血清。将凝胶板放在电泳槽中间的冷却板上，用流水冷却。电泳槽两侧各放入50ml pH8.0的电泳缓冲液，以十二层滤纸搭桥。电泳条件为稳流60mA，开始时电压约为200V，电泳20分钟后，电压升高到300V，切断电源。在凝胶表面铺一层浓5倍的CK基质(Baker公司试剂盒)，45°C温育20分钟，取出用蒸馏水充分冲洗约一分钟，弃去多余水份，加入新配制的呈色剂(0.3%NBT500μl加0.1%PMS 20μl，暗处呈色10分钟，此时在板的阴极侧可见3条明显的MM亚型区带，从阳极开始分别命名为MM1、MM2和MM3，或者是CK-3a、CK-3b和CK-3c。在光密谋计上扫描定量，滤光片570nm，狭缝2mm，仪器自动打印各区带百分比。也可用10%NaOH溶液将各区带颜色在沸水中洗脱后，在分光光度计上比色，计算其百分比。
, 百拇医药
二、结果和讨论
本法特点是选择一个合适的不连续缓冲体系：即琼脂糖胶和电泳槽中缓冲液的pH和成份不一样，在电泳时形成一个前导和后导离子的界面，将标本中的CK-MM压缩成细条，这样在短时间电泳后就能将3条CK-MM亚带分开。此外，此系统还保证在低压电压条件下可能通过较大电流，这样就能在短时间内完成分离工作。
本法尽管使用较低电压，但由于电流较大，因此电泳时仍能产生很大热量，如不加以解决，可引起酶蛋白变性乃至改变区带百分比。有人发现[Clin Chem 1989；35：1]当电压升到1700V时，在MM1前可出现新区带。我们设计了专用电泳槽，琼脂糖凝胶板可全部放在冷却槽上，冷却槽面板改用玻璃，增加了散热效率。这样可以不需要专门冷却仪器而用流水就能很好散热。
由于使用pH较低的缓冲液，电泳后凝胶板中pH较低，保证了CK呈色的敏感性而又抑制了非特异性呈色。
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为了检查本法的精确性，取一份AMI患者血清用此法进行5次电泳测定CK-MM亚型，每1次电泳用1块泳脂糖凝胶板，每块凝胶板上加6个同一血清标本，共测定30次。MM1、MM2和MM3的均值分别为28.1±1.3%、45.0±1.3%和26.8±1.4%，CV值为：4.6%、2.9%和5.1%。国外有文献报道CK-MM1、CK-MM2和CK-MM3测定精密度CV值分别为5.0%、9.0%和7.5%。[Clin B:ochem 1989；22：125]
我们对18名正常体检者进行了分析，总CK
=55.2±16.0μ/L，MM1 61.8±7.9%，MM2 28.7±7.5%，MM3 9.5±4.6%，MM3/MM1 0.18±0.12。
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19例AMI患者发病后不同时间中CK-MM亚型变化情况见附表。从表中可以看出AMI患者血清中CK-MM亚型出现有规律变化。发病后CK-MM3开始上升并伴有CK-MM1的下降，故MM3/MM1比例变化最为明显；在5～10小时组此类变化达到顶点，CK-MM3百分率和MM3/MM1比例达到最高点分别是为35.6和2.43,而CK-MM1降到最低点为16.7%；随后CK-MM3出现下降，CK-MM1逐步上升；MM3/MM1比例在20～25小时组已恢复到正常范围，在此组以前，百分率最高的一直是CK-MM2，和正常组以CK-MM1为主有明显差异；而在25小时以后各组中，则CK-MM1明显升高，成为CK-MM中的主要成分，各项数值基本上和正常对照组一致。7例心绞痛患者总CK为65.1±19.4μ/L，MM1 MM2和MM3百分率分别为50.1±16.3、34.0±12.1和118±9.8，仍为MM1〉MM2〉MM3和正常对照组差异不大，MM3/MM1比值都在1.0以下。
附表 19例AMI患者发病后不同时间CK-MM亚型变化情况(±S)
, http://www.100md.com
发病时间
(h)
CK(U/L)
CK-MM1
(%)
CK-MM2
(%)
CK-MM3
(%)
MM3/MM1
0～5
202±273
40±28
, 百拇医药
45±19
15±10
2.27±2.44
～10
637±359
17±8
48±13
36±12
2.43±0.97
～15
962±719
23±9
47±9
, 百拇医药
30±12
1.74±1.23
～20
1577±988
27±11
52±6
21±10
1.09±0.97
～25
1295±960
42±12
43±10
, http://www.100md.com 15±10
0.41±0.24
～30
1162±1004
47±14
41±12
12±8
0.23±0.19
～35
844±632
63±13
30±11
6±3
, 百拇医药
0.11±0.06
～48
697±524
70±12
25±9
5±4
0.06±0.09
上述结果证实了CK-MM测定有助于心肌梗塞和心绞痛的鉴别诊断，特别是MM3/MM1比值小于1.0，CK-MM2含量小于CK-MM1时更支持心绞痛诊断。但应注意到在心肌梗塞早期时，CK-MM亚型仍可能正常，如在本实验0～5小时组内有4例的MM3/MM1比值在1.0以下，但随后这4例标本都显示异常MM3/MM1比值。
值得注意的是在AMI时，在所有酶学测定中CK-MM亚型变化是出现最早的试验，在0～5小时组内有4例总CK活性分别为44、40、30和54，但MM3/MM1比值分别为5.62、1.73、4.28和6.0，明显大于1.0。故CK-MM亚型测定不仅有助于鉴别诊断，还可早期诊断心肌梗塞。
AMI时CK-MM亚型变化很快，不仅出现早，恢复也早。我们研究发现：如CK-MM3持续上升说明AMI发病时间在10小时以内；以MM2为主时，发病时间在25小时以内；超过24小时后，则以MM1为主，恢复正常图形。对于一些无明显心前区疼痛患者，或者频发心绞痛后出现AMI患者，很难判断AMI的准确发病时间，此时CK-MM亚型测定将有助于解决此问题。
Δ研究生
(1990年1月16日收稿 同年3月8日修回), 百拇医药
单位：(北京医院检验科 100730)
关键词：
肌型肌酯激酶
肌型肌酯激酶(CK-MM)亚型的研究是近年来临床酶学中一项重要的发展[国外医学临床生物化学与检验分册1989；10：13]。CK-MM亚型是急性心肌梗塞(AMI)患者血中最早出现异常的生化指标，有助于AMI早期诊断和发病时间的判断。对溶栓治疗的患者，CK-MM亚型是判断栓塞有无溶解的最好的一项生化指标。
在CK-MM亚型研究中应用了等电聚焦、聚焦层析、高效液相色谱、免疫浸渍等方法。这些方法技术复杂，时间长，很难成为临床实验室实用方法。下面介绍的方法是在常压条件下，用20分钟就可以将CK-MM亚型分开。近一年多我们已将此方法用于临床并对19例AMI和7例心绞痛患者的CK-MM亚型变化进行了初步分析。
, 百拇医药
一、方法
取9.5×8.5cm玻璃片，在水平板上浇以溶化的2%琼脂糖缓冲液(pH6.6)12ml，成胶后在距阴极侧1.5cm处放一加样条，每孔加标本10μl，待数分钟后用滤纸条沾去多余血清。将凝胶板放在电泳槽中间的冷却板上，用流水冷却。电泳槽两侧各放入50ml pH8.0的电泳缓冲液，以十二层滤纸搭桥。电泳条件为稳流60mA，开始时电压约为200V，电泳20分钟后，电压升高到300V，切断电源。在凝胶表面铺一层浓5倍的CK基质(Baker公司试剂盒)，45°C温育20分钟，取出用蒸馏水充分冲洗约一分钟，弃去多余水份，加入新配制的呈色剂(0.3%NBT500μl加0.1%PMS 20μl，暗处呈色10分钟，此时在板的阴极侧可见3条明显的MM亚型区带，从阳极开始分别命名为MM1、MM2和MM3，或者是CK-3a、CK-3b和CK-3c。在光密谋计上扫描定量，滤光片570nm，狭缝2mm，仪器自动打印各区带百分比。也可用10%NaOH溶液将各区带颜色在沸水中洗脱后，在分光光度计上比色，计算其百分比。
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二、结果和讨论
本法特点是选择一个合适的不连续缓冲体系：即琼脂糖胶和电泳槽中缓冲液的pH和成份不一样，在电泳时形成一个前导和后导离子的界面，将标本中的CK-MM压缩成细条，这样在短时间电泳后就能将3条CK-MM亚带分开。此外，此系统还保证在低压电压条件下可能通过较大电流，这样就能在短时间内完成分离工作。
本法尽管使用较低电压，但由于电流较大，因此电泳时仍能产生很大热量，如不加以解决，可引起酶蛋白变性乃至改变区带百分比。有人发现[Clin Chem 1989；35：1]当电压升到1700V时，在MM1前可出现新区带。我们设计了专用电泳槽，琼脂糖凝胶板可全部放在冷却槽上，冷却槽面板改用玻璃，增加了散热效率。这样可以不需要专门冷却仪器而用流水就能很好散热。
由于使用pH较低的缓冲液，电泳后凝胶板中pH较低，保证了CK呈色的敏感性而又抑制了非特异性呈色。
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为了检查本法的精确性，取一份AMI患者血清用此法进行5次电泳测定CK-MM亚型，每1次电泳用1块泳脂糖凝胶板，每块凝胶板上加6个同一血清标本，共测定30次。MM1、MM2和MM3的均值分别为28.1±1.3%、45.0±1.3%和26.8±1.4%，CV值为：4.6%、2.9%和5.1%。国外有文献报道CK-MM1、CK-MM2和CK-MM3测定精密度CV值分别为5.0%、9.0%和7.5%。[Clin B:ochem 1989；22：125]
我们对18名正常体检者进行了分析，总CK
=55.2±16.0μ/L，MM1 61.8±7.9%，MM2 28.7±7.5%，MM3 9.5±4.6%，MM3/MM1 0.18±0.12。, http://www.100md.com
19例AMI患者发病后不同时间中CK-MM亚型变化情况见附表。从表中可以看出AMI患者血清中CK-MM亚型出现有规律变化。发病后CK-MM3开始上升并伴有CK-MM1的下降，故MM3/MM1比例变化最为明显；在5～10小时组此类变化达到顶点，CK-MM3百分率和MM3/MM1比例达到最高点分别是为35.6和2.43,而CK-MM1降到最低点为16.7%；随后CK-MM3出现下降，CK-MM1逐步上升；MM3/MM1比例在20～25小时组已恢复到正常范围，在此组以前，百分率最高的一直是CK-MM2，和正常组以CK-MM1为主有明显差异；而在25小时以后各组中，则CK-MM1明显升高，成为CK-MM中的主要成分，各项数值基本上和正常对照组一致。7例心绞痛患者总CK为65.1±19.4μ/L，MM1 MM2和MM3百分率分别为50.1±16.3、34.0±12.1和118±9.8，仍为MM1〉MM2〉MM3和正常对照组差异不大，MM3/MM1比值都在1.0以下。
附表 19例AMI患者发病后不同时间CK-MM亚型变化情况(
±S), http://www.100md.com
发病时间
(h)
CK(U/L)
CK-MM1
(%)
CK-MM2
(%)
CK-MM3
(%)
MM3/MM1
0～5
202±273
40±28
, 百拇医药
45±19
15±10
2.27±2.44
～10
637±359
17±8
48±13
36±12
2.43±0.97
～15
962±719
23±9
47±9
, 百拇医药
30±12
1.74±1.23
～20
1577±988
27±11
52±6
21±10
1.09±0.97
～25
1295±960
42±12
43±10
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0.41±0.24
～30
1162±1004
47±14
41±12
12±8
0.23±0.19
～35
844±632
63±13
30±11
6±3
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0.11±0.06
～48
697±524
70±12
25±9
5±4
0.06±0.09
上述结果证实了CK-MM测定有助于心肌梗塞和心绞痛的鉴别诊断，特别是MM3/MM1比值小于1.0，CK-MM2含量小于CK-MM1时更支持心绞痛诊断。但应注意到在心肌梗塞早期时，CK-MM亚型仍可能正常，如在本实验0～5小时组内有4例的MM3/MM1比值在1.0以下，但随后这4例标本都显示异常MM3/MM1比值。
值得注意的是在AMI时，在所有酶学测定中CK-MM亚型变化是出现最早的试验，在0～5小时组内有4例总CK活性分别为44、40、30和54，但MM3/MM1比值分别为5.62、1.73、4.28和6.0，明显大于1.0。故CK-MM亚型测定不仅有助于鉴别诊断，还可早期诊断心肌梗塞。
AMI时CK-MM亚型变化很快，不仅出现早，恢复也早。我们研究发现：如CK-MM3持续上升说明AMI发病时间在10小时以内；以MM2为主时，发病时间在25小时以内；超过24小时后，则以MM1为主，恢复正常图形。对于一些无明显心前区疼痛患者，或者频发心绞痛后出现AMI患者，很难判断AMI的准确发病时间，此时CK-MM亚型测定将有助于解决此问题。
Δ研究生
(1990年1月16日收稿 同年3月8日修回), 百拇医药