Alzheimer病的细胞骨架蛋白质研究
作者：袁锦楣 高素荣 李彤 吴丽娟 陈清棠
单位：(北京医科大学第一医院神经科 100034)
关键词：Alzheimer病；神经微丝
中华医学杂志900803
摘要 采用160000及200000磷酸化及非磷酸化酸神经丝单克隆抗体为探针，研究Alzhermer病(AD)的细胞骨架改变。发现在AD脑的神经元细胞体内有高分子磷酸化神经丝积聚，而老年斑内未发现任何一种神经丝的异常堆积，提示磷酸化神经丝在神经元胞体内的积聚，可能为AD的早期发病机理。
Alzhermer病(AD)的发病原因至今不明，但已公认神经原纤维缠结与老年斑为AD病理诊断的依据，并证实AD有痴呆程度与神经原纤维缠结的数量呈正比。因而近年来对AD病因的研究大多集中于神经原纤维缠结的细胞骨架改变及老年斑的淀粉样蛋白核心上。近年来的研究还发现，AD患者的皮质、海马、黑质等部位有递质异常，主要是胆碱能递质异常，而其受体保持正常。递质的转运主要通过细胞骨架进行，尤其是高分子磷酸化神经丝蛋白是神经丝与其他细胞器的主要联系体，因而研究AD的高分子神经丝蛋白，可能有助于探索本病的发病机理。
, 百拇医药
材料与方法
经普通病理证实为AD的患者2例。例1，男，69岁；例2，女，90岁。2例均有典型的临床病史，普通病理发现脑内神经元细胞减少，不同程度的神经元纤维缠结及老年斑。以2例非正常死亡的健康成年人为对照，均为男性，年龄分别为22岁和20岁。该2例脑的普通病量检查均未发现任何神经元纤维缠结及老年斑。
免疫细胞化学染色：采用石蜡包埋节片，分别为4μm及10μm两种厚度。采用辣根氧化酶抗辣根氧化酶技术进行免疫细胞化学染色。
所用的单克隆抗体为：SMI31；抗160000及200000磷酸化神经丝单克隆抗体。SMI32；抗160000及200000非磷酸化神经丝单克隆抗体。第2抗体为羊抗鼠IgG，第3抗体为小鼠PAP复合物。
具体步骤如下：将4μm及10μm的石蜡脑切片经脱蜡、水化后以0.2%双氧水去除内源性辣根氧化酶活性，再经5%正常羊血清处理后，以不同稀释度的第1抗体(SMI31，1：6000；SMI32，1：2000)在4°C冰室中孵育过夜。再依次以1：50的第2抗体及1：100的第3抗体，分别在室温中各孵育2小时，最后以邻苯二胺显色。每一步骤间均以Tris缓冲液充分冲洗。同一部位的脑组织切片，同时进行HE及Bodisn银染色法进行对比。每次免疫细胞化学染色均设有不加第1抗体的空白对照。
, 百拇医药
结 果
正常脑组织的神经元细胞中的神经丝均可与磷酸化及非磷酸化神经丝单克隆抗体(SMI31及SMI32)发生免疫反应。以大锥体细胞的免疫反应最为明显。典型的表现是非磷酸化神经丝主要分布在核周胞浆及树突中(图1)，皮质下神经纤维着色较浅。磷酸化神经丝则主要分布在神经元细胞胞浆的周边部及轴突中(图2)，皮质下神经纤维着色较深。
图1 非磷酸化神经丝主要分布在神经无限制的核周。海马区PAP免疫细胞化学染色×160
图2 磷酸化神经丝主要分布在神经元的周边及轴索中。额叶皮质，PAP免疫细胞化学染色×160
在AD患者脑组织切片中，非磷酸化神经丝在神经元细胞内的分布和正常脑组织无明显差别。磷酸化神经丝则呈条状、块状或火焰状以极浓的颜色在神经元细胞的胞浆内积聚(图3)。在某些结构不完整的神经元细胞内，磷酸化神经丝的积聚并不较结构、形态完整的细胞严重。在老年斑中，均未发现有磷酸化及非磷酸化神经丝的异常堆积。
, http://www.100md.com
图3 磷酸化神经丝在神经元胞体内积聚。额叶皮质，PAP免疫细胞化学染色×80
讨 论
神经原纤维缠结不单是Alzheimer病病理诊断的特征性标志，也可见于正常老年人、进行性核上性麻痹、Down症候群、帕金森病痴呆等的脑组织病理切片中[1]。除正常老年人在不存在痴呆情况下可以出现少量的神经原纤维缠结外，神经原纤维缠结的数量总是与痴呆的程度密切相关。随着超微结构研究技术及免疫学技术的进展，已证实神经原纤维缠结系一种双股螺旋丝(PHF)在神经元细胞浆内的异常堆积。PHF可能是神经丝与微管的结合，可与正常神经丝享有一定的共同抗原决定簇[1]。神经原纤维缠结发展到一定程度，可使神经元细胞变性、破坏，残留下嗜银的原纤维斑块，称老年斑。使用不同种类的细胞骨架及PHF单克隆抗体，可以作为一种特殊的分子探针对神经元纤维缠结进行免疫细胞化学研究。
我们采用的是高分子磷酸化及非磷酸化神经丝单克隆抗体，此两种单克隆抗体可特异性地在体内分别与磷酸化及非磷酸化神经丝起免疫反应[2]。本组2例AD的脑皮质中，均出现了高分子磷酸化神经丝在神经元细胞浆内积聚现象，但这种聚积并不与神经元细胞变性的程度相平行。更值得注意的是老年斑内并未发现此2种高分子正常神经丝的任何一种发生异常积聚。我们推测，高分子量磷酸化神经丝在神经元细胞浆内的异常积聚，系AD神经元细胞变性的早期阶段，随着神经原纤维缠结变性程度的加重，PHF与正常高分子磷酸化神经丝的共同抗原簇减弱直至消失，以致老年斑仅能与抗PHF及抗tau蛋白等单克隆抗体起免疫反应。
, 百拇医药
本研究发现在AD的神经元细胞中聚积的神经丝主要是高分子磷酸化神经丝，而非磷酶化神经丝的改变不明显。目前认为高分子磷酸化神经丝为神经丝与其他细胞骨架的主要联系体，在轴浆流运输中起重要作用。细胞骨架的磷酸化，可使转移后的神经丝更为紧密，以防止它们的蛋白质溶解变性[7]。正常情况下，神经丝的磷酸化主要在轴索中进行[8]。在AD的神经元细胞体内发现了大量的高分子磷酸化神经丝的积聚，考虑可能是象铝或IDPN中毒一样，由于神经纤维损伤、流动受阻，导致神精丝转运障碍而在其近端部蓄积，或是神经元细胞内发生了异常的磷酸化过程。由于在AD患者中神经元纤维缠结及双老年斑中发现的tau蛋白亦是磷酸化的，在帕金森病的Lewy体中也发现了磷酸化神经丝及双螺旋丝的沉积[8]，因而考虑神经元细胞体内的异常磷酸化过程可能是造成这种障碍的主要原因。也许对不同程度的AD、不合并痴呆症状的老年人以及可以出现神经元纤维缠结的其他疾病作更多的多种细胞骨架研究，可揭示磷酸化细胞骨架在神经元细胞体内异常积聚的原因。
, 百拇医药
参考文献
1. Anderton BH, et al. Monoclonal antibodies show that neurofibrillary tangles and neurofilaments share antigenic determinants. Nature 1982；298：84.
2. Sternberger LA, Sternberger NH.Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonpho-sphorylated forms of neurofilaments in situ Proc Natl Acad Sci USA 1983；80：6126.
3. Goldstein ME, et al. Phosphorylation protects neurofilament against proteolysis. J Neuroimmu nology 1987；14：149.
4. Bancher C, et al. An antigenic profile of lewy Bodies: immunocytochemical indication for protein phosphorylation and ubiquitination. J Neuropathol Exp Neurol 1989；48：81.
(1989年12月12日收稿 1990年3月30日修回), http://www.100md.com
单位：(北京医科大学第一医院神经科 100034)
关键词：Alzheimer病；神经微丝
中华医学杂志900803
摘要 采用160000及200000磷酸化及非磷酸化酸神经丝单克隆抗体为探针，研究Alzhermer病(AD)的细胞骨架改变。发现在AD脑的神经元细胞体内有高分子磷酸化神经丝积聚，而老年斑内未发现任何一种神经丝的异常堆积，提示磷酸化神经丝在神经元胞体内的积聚，可能为AD的早期发病机理。
Alzhermer病(AD)的发病原因至今不明，但已公认神经原纤维缠结与老年斑为AD病理诊断的依据，并证实AD有痴呆程度与神经原纤维缠结的数量呈正比。因而近年来对AD病因的研究大多集中于神经原纤维缠结的细胞骨架改变及老年斑的淀粉样蛋白核心上。近年来的研究还发现，AD患者的皮质、海马、黑质等部位有递质异常，主要是胆碱能递质异常，而其受体保持正常。递质的转运主要通过细胞骨架进行，尤其是高分子磷酸化神经丝蛋白是神经丝与其他细胞器的主要联系体，因而研究AD的高分子神经丝蛋白，可能有助于探索本病的发病机理。
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材料与方法
经普通病理证实为AD的患者2例。例1，男，69岁；例2，女，90岁。2例均有典型的临床病史，普通病理发现脑内神经元细胞减少，不同程度的神经元纤维缠结及老年斑。以2例非正常死亡的健康成年人为对照，均为男性，年龄分别为22岁和20岁。该2例脑的普通病量检查均未发现任何神经元纤维缠结及老年斑。
免疫细胞化学染色：采用石蜡包埋节片，分别为4μm及10μm两种厚度。采用辣根氧化酶抗辣根氧化酶技术进行免疫细胞化学染色。
所用的单克隆抗体为：SMI31；抗160000及200000磷酸化神经丝单克隆抗体。SMI32；抗160000及200000非磷酸化神经丝单克隆抗体。第2抗体为羊抗鼠IgG，第3抗体为小鼠PAP复合物。
具体步骤如下：将4μm及10μm的石蜡脑切片经脱蜡、水化后以0.2%双氧水去除内源性辣根氧化酶活性，再经5%正常羊血清处理后，以不同稀释度的第1抗体(SMI31，1：6000；SMI32，1：2000)在4°C冰室中孵育过夜。再依次以1：50的第2抗体及1：100的第3抗体，分别在室温中各孵育2小时，最后以邻苯二胺显色。每一步骤间均以Tris缓冲液充分冲洗。同一部位的脑组织切片，同时进行HE及Bodisn银染色法进行对比。每次免疫细胞化学染色均设有不加第1抗体的空白对照。
, 百拇医药
结 果
正常脑组织的神经元细胞中的神经丝均可与磷酸化及非磷酸化神经丝单克隆抗体(SMI31及SMI32)发生免疫反应。以大锥体细胞的免疫反应最为明显。典型的表现是非磷酸化神经丝主要分布在核周胞浆及树突中(图1)，皮质下神经纤维着色较浅。磷酸化神经丝则主要分布在神经元细胞胞浆的周边部及轴突中(图2)，皮质下神经纤维着色较深。
图1 非磷酸化神经丝主要分布在神经无限制的核周。海马区PAP免疫细胞化学染色×160
图2 磷酸化神经丝主要分布在神经元的周边及轴索中。额叶皮质，PAP免疫细胞化学染色×160
在AD患者脑组织切片中，非磷酸化神经丝在神经元细胞内的分布和正常脑组织无明显差别。磷酸化神经丝则呈条状、块状或火焰状以极浓的颜色在神经元细胞的胞浆内积聚(图3)。在某些结构不完整的神经元细胞内，磷酸化神经丝的积聚并不较结构、形态完整的细胞严重。在老年斑中，均未发现有磷酸化及非磷酸化神经丝的异常堆积。
, http://www.100md.com
图3 磷酸化神经丝在神经元胞体内积聚。额叶皮质，PAP免疫细胞化学染色×80
讨 论
神经原纤维缠结不单是Alzheimer病病理诊断的特征性标志，也可见于正常老年人、进行性核上性麻痹、Down症候群、帕金森病痴呆等的脑组织病理切片中[1]。除正常老年人在不存在痴呆情况下可以出现少量的神经原纤维缠结外，神经原纤维缠结的数量总是与痴呆的程度密切相关。随着超微结构研究技术及免疫学技术的进展，已证实神经原纤维缠结系一种双股螺旋丝(PHF)在神经元细胞浆内的异常堆积。PHF可能是神经丝与微管的结合，可与正常神经丝享有一定的共同抗原决定簇[1]。神经原纤维缠结发展到一定程度，可使神经元细胞变性、破坏，残留下嗜银的原纤维斑块，称老年斑。使用不同种类的细胞骨架及PHF单克隆抗体，可以作为一种特殊的分子探针对神经元纤维缠结进行免疫细胞化学研究。
我们采用的是高分子磷酸化及非磷酸化神经丝单克隆抗体，此两种单克隆抗体可特异性地在体内分别与磷酸化及非磷酸化神经丝起免疫反应[2]。本组2例AD的脑皮质中，均出现了高分子磷酸化神经丝在神经元细胞浆内积聚现象，但这种聚积并不与神经元细胞变性的程度相平行。更值得注意的是老年斑内并未发现此2种高分子正常神经丝的任何一种发生异常积聚。我们推测，高分子量磷酸化神经丝在神经元细胞浆内的异常积聚，系AD神经元细胞变性的早期阶段，随着神经原纤维缠结变性程度的加重，PHF与正常高分子磷酸化神经丝的共同抗原簇减弱直至消失，以致老年斑仅能与抗PHF及抗tau蛋白等单克隆抗体起免疫反应。
, 百拇医药
本研究发现在AD的神经元细胞中聚积的神经丝主要是高分子磷酸化神经丝，而非磷酶化神经丝的改变不明显。目前认为高分子磷酸化神经丝为神经丝与其他细胞骨架的主要联系体，在轴浆流运输中起重要作用。细胞骨架的磷酸化，可使转移后的神经丝更为紧密，以防止它们的蛋白质溶解变性[7]。正常情况下，神经丝的磷酸化主要在轴索中进行[8]。在AD的神经元细胞体内发现了大量的高分子磷酸化神经丝的积聚，考虑可能是象铝或IDPN中毒一样，由于神经纤维损伤、流动受阻，导致神精丝转运障碍而在其近端部蓄积，或是神经元细胞内发生了异常的磷酸化过程。由于在AD患者中神经元纤维缠结及双老年斑中发现的tau蛋白亦是磷酸化的，在帕金森病的Lewy体中也发现了磷酸化神经丝及双螺旋丝的沉积[8]，因而考虑神经元细胞体内的异常磷酸化过程可能是造成这种障碍的主要原因。也许对不同程度的AD、不合并痴呆症状的老年人以及可以出现神经元纤维缠结的其他疾病作更多的多种细胞骨架研究，可揭示磷酸化细胞骨架在神经元细胞体内异常积聚的原因。
, 百拇医药
参考文献
1. Anderton BH, et al. Monoclonal antibodies show that neurofibrillary tangles and neurofilaments share antigenic determinants. Nature 1982；298：84.
2. Sternberger LA, Sternberger NH.Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonpho-sphorylated forms of neurofilaments in situ Proc Natl Acad Sci USA 1983；80：6126.
3. Goldstein ME, et al. Phosphorylation protects neurofilament against proteolysis. J Neuroimmu nology 1987；14：149.
4. Bancher C, et al. An antigenic profile of lewy Bodies: immunocytochemical indication for protein phosphorylation and ubiquitination. J Neuropathol Exp Neurol 1989；48：81.
(1989年12月12日收稿 1990年3月30日修回), http://www.100md.com