限制酶切片段长度多态性连锁分析检测进行性肌营养不良基因携带者
作者：陈凡 黄尚志 方炳良 罗会 潘晓丽 武盈玉
单位：(中国医学科学院基础医学研究所医学遗传室，100050)陈凡 黄尚志 方炳良 罗会元；(中国医科大学附属二、三医院基础儿科)潘晓丽 武盈玉
关键词：肌营养障碍；连锁多态现象；杂合体测定
中华医学杂志910614
摘要 应用杜氏肌营养不良(DMD)基因旁侧和内部的探针进行了11个DMD家系的染色体限制酶切片段长度多态性单体型连锁分析。在8个资料完整的家系中，检出2个缺失型DMD基因、一个新生突变；有一条X染色体发生了重组。在25个被测女性中，11人为基因携带者，8人正常，6人基因型未定。在这些家系中，70%以上的携带者可进行产前基因诊断。
杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dyatrophy, DMD)和贝氏肌营养不良(Becker muscular dystrophy,BDM)为X连锁隐性遗传性肌肉疾病，都是抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因缺陷所致[1]。DMD较为常见，大约每3000个男婴中就有1名患儿[2]，其中1/3为新生突变。病儿出生时外表完全正常，2～3岁开始出现骨骼肌无力症状，随着年龄增长，肌肉进行性萎缩日益加剧，12岁前失去行走能力，30岁前终因呼吸衰竭等并发症死亡[2]。目前对此病尚无法治疗，在DMD家系中应用限制酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)单体型连锁分析，检出基因携带者并施行产前基因诊断，是防止这些家族中再出生患儿的唯一途径[3]。我们应用754、pERT87-8和P20探针对中国人DMD家系进行RFLP单体型连锁分析，检出基因携带者，现将结果报道如下。
, 百拇医药
对象与方法
一、对象
11个家系分别来自沈阳和北京，其中10个有家族史(指家族中至少有2个患者)，1个家系无家族史。根据患者的临床症状、体征、血清学测定、肌电图改变指标和家系调查等予以确诊。
分别取患儿、患儿的父母、姐妹及母亲亲属中女性成员(若需要时还取男性亲属)的静脉血，分离DNA进行RFLP分析。
二、方法
1、探针：754(DXS84)位于基因外5'侧，检测PstI位点的多态性[4]；pERT87-8(DXS-164)和P20(DXS269)位于基因内部，分别检测TaqI[5]和MspI[6]位点的多态性。754和P20由E.Bakker教授提供，pERT87-8由L.E.Kunkel教授提供。
, 百拇医药
2、RFLP分析：由EDTA抗凝的静脉血中分离细胞核后提取DNA，经限制酶酶解后按本实验室常规方法进行电泳分离、Southern印迹杂交和放射自显影[7]。
3、携带者检出：在家系中根据RFLP单体型进行连锁分析确定。
结 果
1、RFLP分析：在所分析的样品中，745/PstI位点杂合频率较低，而pERT87-8/TaqI和P20/MspI位点的多态性信息量(polymorphic information contents.,PIC)比较高(表1)。
表1 中国人抗肌萎缩蛋白基因内及侧翼RFLP分析 探针
限制酶
等位片段
, 百拇医药
频率(%)
PIC
符号
长度(kb)
中国人
白人*
754
PstI
P
11.0
92.5
62
0.139
, 百拇医药
P
9.0
7.5
38
pERT87-8
TaqI
T
3.8
63.2
29
0.465
t
2.7+1.1
, 百拇医药
36.8
71
P20
MspI
M1
6.8
64.1
35
0.460
m1
3.5
35.9
65
, 百拇医药
M2
2.2
28.2
0.405
m2
1.9
71.2
*：数据引自文献[6，8]
在P20/MspI的RFLP分析中，发现除文献报道的一对多态性等位片段[(-)：6.8kb/(+)：3.5kb]外，还有一对新的多态性等位片段，长度分别为(-)：2.2kb、(+)：1.9kb。
有2个家系的DMD基因是缺失型，分别缺失了基因内P20(家系1)和pERT87-8(家系2)所在的区域(附图)。
, 百拇医药
2、RFLP单体型分析：11个家系中有8个家系的资料比较完整，能够通过连锁分析确定每条X染色体的单体型。家系3无家族史，分析结果表明，患儿的X染色体来源于外祖父，而外祖父的表型完全正常，因此这是一个新生突变。
家系2中II2的母源染色体在754和pERT87-8之间发生了重组。
3、DMD基因携带者的确定：在有单体型分析资料的8个家系中，除家系3系新生突变尚不能确定患儿之母是否为携带者外，其他所有患者的母亲(13人)都是DMD基因的肯定携带者。对家族中其他25个女性成员，通过单体型连锁分析，检出了携带者11人，正常者8人，有6人尚不能确定基因型(表2)。
表2 8个DMD家系女性成员的基因型分析结果 家系
基因携带者
基因型不能确定者
, http://www.100md.com
正常女性
可进行产前诊断者
不能进行产前诊断者
1
I2△，II4△，II8
III3
2
I2，II6△
II2*，II4，II8
3
II2
, 百拇医药 I2
4
I2△II11△
I2△，III5
II5
5
II2△，II5△，III10
III2△，III5，III7
III3，III11
6
II2△，III4，III5
, http://www.100md.com
II4△
II7，III6，III7，III9，III10
7
II3△
8
I2△，II2△，II3，III1，III3
注：家系1、2为缺失型，家系3为新生突变；△ 肯定携带者，* 发生重组的个
1～3为姨；4为外祖母；5为外祖父；6为母；7，8为患者
, 百拇医药
附图 一个pERT87-8位点缺失家系的放射自显影图
讨 论
参照Bakkere等[3]的分析程序，选了754、pERT87-8和P20 3个探针和相应的限制性内切酶进行了DMD家系的RFLP单体型分析。从29个无关个体(男18，女11)近40条X染色体的RFLP分析结果，发现中国人在所有这些位点上的频率都与国外文献报道的不同(表1)。尤其是P20/MspI位点的差别更大，除了文献报道的那对等位片段(6.8kb/3.5kb)出现频率不同外，中国人中还出现一对新的多态性等位片段(2.2kg/1.9kb)。这些差别可能是人群的差异造成的。在其他X染色体位点的多态性分析中也见到类似的情况[9]。这提醒我们，在将国外的研究成果应用于国内时，要先进行中国人群体的分析。
抗肌萎缩蛋白基因很大(约2300kb)，探针检测位点与致病突变之间有较大的重组率[3]。在我们分析的40多个减数分裂中检出了一个重组，它发生在754和pERT87-8之间。由于中国人中754/PstI位点的杂合率很低(0.139)，加上我们没有分析基因3'端的位点标志，可能有些重组被漏检了。在今后的分析中，应该在基因5'侧选择一个连锁更紧密的DNA探针以取代754，在基因的3'端再检测一个多态性位点，与pERT87-8和P20探针联用，避免因染色体交换而导致诊断错误。
, http://www.100md.com
在有家族史的7个家系中，基因型得到明确诊断者占受检者的75%(19/25)。在临床咨询中我们曾测定3种血清学指标(肌酸磷酸激酶，CPK；乳酸脱氢酶，LDH；肌红蛋白，Mb)，应用计量资料多因素分析中Fisher判别法[10]检测基因携带者。用此方法分析本组家系中有关女性，对正常者的判断结果与RFLP连锁分析一致，并从基因型不能判定的女性中检出了携带者。但它对肯定携带者和缺失型基因携带者的判别出现了假阴性，这说明Fisher判别法也需进一步完善。
除5个缺失型基因携带者外，在其他19个DMD基因携带者中有13人单体型杂合。在这些家系中，70%以上的携带者可用缺失片段检测或RFLP单体型连锁分析进行产前诊断。
参考文献
1 Kunkel LM, et al. Analysis of deletions in DNA from patients with Becker and Duchenne muscular dystrophy. Nature; 1986;322:73.
, 百拇医药
2 Moser H. Duchenne muscular dystrophy:pathogenic aspects and genetic prevention. Hum Genet 1984;66:17.
3 Bakker E, et al. DNA probe analysis for carrier detection and prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy:a standard diagnostic procedure. J Med Genet 1986;23:573.
4 Hofker MH, et al. Isolation of probes detecting restriction fragment length polymorphisms from X chromosome-specific libraries: potential use for diagnosis of Duchenne muscular dystrophy, Hum Genet 1985;70:148.
, 百拇医药
5 Kunkel LM, et al. Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male patient with and X chromosome deletion. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82:4778.
6 Wapenaar MC, et al. A deletion hot spot in the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics 1988;2:101.
7 Huang S, et al. β-thalassemia in chinese:analysis of polymorphic restriction site haplothpes in the β-globin gene cluster. Chin Med J 1985;98:881.
8 Lindi
f M, et al. Linked polymorphic DNA markers in the prediction of X-linked muscular dystrophy Ann Hum Genet 1987;51(Pt 4):317.
9 沈岩等，中国人St14/Taq IRFLPs及其在甲型血友病基因连锁分析与产前基因诊断中的应用。遗传学报1987；16：235。
10 黄正南主编，医用多因素分析，长沙：湖南科技出版社，1980：53-75。, 百拇医药
单位：(中国医学科学院基础医学研究所医学遗传室，100050)陈凡 黄尚志 方炳良 罗会元；(中国医科大学附属二、三医院基础儿科)潘晓丽 武盈玉
关键词：肌营养障碍；连锁多态现象；杂合体测定
中华医学杂志910614
摘要 应用杜氏肌营养不良(DMD)基因旁侧和内部的探针进行了11个DMD家系的染色体限制酶切片段长度多态性单体型连锁分析。在8个资料完整的家系中，检出2个缺失型DMD基因、一个新生突变；有一条X染色体发生了重组。在25个被测女性中，11人为基因携带者，8人正常，6人基因型未定。在这些家系中，70%以上的携带者可进行产前基因诊断。
杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dyatrophy, DMD)和贝氏肌营养不良(Becker muscular dystrophy,BDM)为X连锁隐性遗传性肌肉疾病，都是抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因缺陷所致[1]。DMD较为常见，大约每3000个男婴中就有1名患儿[2]，其中1/3为新生突变。病儿出生时外表完全正常，2～3岁开始出现骨骼肌无力症状，随着年龄增长，肌肉进行性萎缩日益加剧，12岁前失去行走能力，30岁前终因呼吸衰竭等并发症死亡[2]。目前对此病尚无法治疗，在DMD家系中应用限制酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)单体型连锁分析，检出基因携带者并施行产前基因诊断，是防止这些家族中再出生患儿的唯一途径[3]。我们应用754、pERT87-8和P20探针对中国人DMD家系进行RFLP单体型连锁分析，检出基因携带者，现将结果报道如下。
, 百拇医药
对象与方法
一、对象
11个家系分别来自沈阳和北京，其中10个有家族史(指家族中至少有2个患者)，1个家系无家族史。根据患者的临床症状、体征、血清学测定、肌电图改变指标和家系调查等予以确诊。
分别取患儿、患儿的父母、姐妹及母亲亲属中女性成员(若需要时还取男性亲属)的静脉血，分离DNA进行RFLP分析。
二、方法
1、探针：754(DXS84)位于基因外5'侧，检测PstI位点的多态性[4]；pERT87-8(DXS-164)和P20(DXS269)位于基因内部，分别检测TaqI[5]和MspI[6]位点的多态性。754和P20由E.Bakker教授提供，pERT87-8由L.E.Kunkel教授提供。
, 百拇医药
2、RFLP分析：由EDTA抗凝的静脉血中分离细胞核后提取DNA，经限制酶酶解后按本实验室常规方法进行电泳分离、Southern印迹杂交和放射自显影[7]。
3、携带者检出：在家系中根据RFLP单体型进行连锁分析确定。
结 果
1、RFLP分析：在所分析的样品中，745/PstI位点杂合频率较低，而pERT87-8/TaqI和P20/MspI位点的多态性信息量(polymorphic information contents.,PIC)比较高(表1)。
表1 中国人抗肌萎缩蛋白基因内及侧翼RFLP分析 探针
限制酶
等位片段
, 百拇医药
频率(%)
PIC
符号
长度(kb)
中国人
白人*
754
PstI
P
11.0
92.5
62
0.139
, 百拇医药
P
9.0
7.5
38
pERT87-8
TaqI
T
3.8
63.2
29
0.465
t
2.7+1.1
, 百拇医药
36.8
71
P20
MspI
M1
6.8
64.1
35
0.460
m1
3.5
35.9
65
, 百拇医药
M2
2.2
28.2
0.405
m2
1.9
71.2
*：数据引自文献[6，8]
在P20/MspI的RFLP分析中，发现除文献报道的一对多态性等位片段[(-)：6.8kb/(+)：3.5kb]外，还有一对新的多态性等位片段，长度分别为(-)：2.2kb、(+)：1.9kb。
有2个家系的DMD基因是缺失型，分别缺失了基因内P20(家系1)和pERT87-8(家系2)所在的区域(附图)。
, 百拇医药
2、RFLP单体型分析：11个家系中有8个家系的资料比较完整，能够通过连锁分析确定每条X染色体的单体型。家系3无家族史，分析结果表明，患儿的X染色体来源于外祖父，而外祖父的表型完全正常，因此这是一个新生突变。
家系2中II2的母源染色体在754和pERT87-8之间发生了重组。
3、DMD基因携带者的确定：在有单体型分析资料的8个家系中，除家系3系新生突变尚不能确定患儿之母是否为携带者外，其他所有患者的母亲(13人)都是DMD基因的肯定携带者。对家族中其他25个女性成员，通过单体型连锁分析，检出了携带者11人，正常者8人，有6人尚不能确定基因型(表2)。
表2 8个DMD家系女性成员的基因型分析结果 家系
基因携带者
基因型不能确定者
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正常女性
可进行产前诊断者
不能进行产前诊断者
1
I2△，II4△，II8
III3
2
I2，II6△
II2*，II4，II8
3
II2
, 百拇医药 I2
4
I2△II11△
I2△，III5
II5
5
II2△，II5△，III10
III2△，III5，III7
III3，III11
6
II2△，III4，III5
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II4△
II7，III6，III7，III9，III10
7
II3△
8
I2△，II2△，II3，III1，III3
注：家系1、2为缺失型，家系3为新生突变；△ 肯定携带者，* 发生重组的个
1～3为姨；4为外祖母；5为外祖父；6为母；7，8为患者
, 百拇医药
附图 一个pERT87-8位点缺失家系的放射自显影图
讨 论
参照Bakkere等[3]的分析程序，选了754、pERT87-8和P20 3个探针和相应的限制性内切酶进行了DMD家系的RFLP单体型分析。从29个无关个体(男18，女11)近40条X染色体的RFLP分析结果，发现中国人在所有这些位点上的频率都与国外文献报道的不同(表1)。尤其是P20/MspI位点的差别更大，除了文献报道的那对等位片段(6.8kb/3.5kb)出现频率不同外，中国人中还出现一对新的多态性等位片段(2.2kg/1.9kb)。这些差别可能是人群的差异造成的。在其他X染色体位点的多态性分析中也见到类似的情况[9]。这提醒我们，在将国外的研究成果应用于国内时，要先进行中国人群体的分析。
抗肌萎缩蛋白基因很大(约2300kb)，探针检测位点与致病突变之间有较大的重组率[3]。在我们分析的40多个减数分裂中检出了一个重组，它发生在754和pERT87-8之间。由于中国人中754/PstI位点的杂合率很低(0.139)，加上我们没有分析基因3'端的位点标志，可能有些重组被漏检了。在今后的分析中，应该在基因5'侧选择一个连锁更紧密的DNA探针以取代754，在基因的3'端再检测一个多态性位点，与pERT87-8和P20探针联用，避免因染色体交换而导致诊断错误。
, http://www.100md.com
在有家族史的7个家系中，基因型得到明确诊断者占受检者的75%(19/25)。在临床咨询中我们曾测定3种血清学指标(肌酸磷酸激酶，CPK；乳酸脱氢酶，LDH；肌红蛋白，Mb)，应用计量资料多因素分析中Fisher判别法[10]检测基因携带者。用此方法分析本组家系中有关女性，对正常者的判断结果与RFLP连锁分析一致，并从基因型不能判定的女性中检出了携带者。但它对肯定携带者和缺失型基因携带者的判别出现了假阴性，这说明Fisher判别法也需进一步完善。
除5个缺失型基因携带者外，在其他19个DMD基因携带者中有13人单体型杂合。在这些家系中，70%以上的携带者可用缺失片段检测或RFLP单体型连锁分析进行产前诊断。
参考文献
1 Kunkel LM, et al. Analysis of deletions in DNA from patients with Becker and Duchenne muscular dystrophy. Nature; 1986;322:73.
, 百拇医药
2 Moser H. Duchenne muscular dystrophy:pathogenic aspects and genetic prevention. Hum Genet 1984;66:17.
3 Bakker E, et al. DNA probe analysis for carrier detection and prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy:a standard diagnostic procedure. J Med Genet 1986;23:573.
4 Hofker MH, et al. Isolation of probes detecting restriction fragment length polymorphisms from X chromosome-specific libraries: potential use for diagnosis of Duchenne muscular dystrophy, Hum Genet 1985;70:148.
, 百拇医药
5 Kunkel LM, et al. Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male patient with and X chromosome deletion. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82:4778.
6 Wapenaar MC, et al. A deletion hot spot in the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics 1988;2:101.
7 Huang S, et al. β-thalassemia in chinese:analysis of polymorphic restriction site haplothpes in the β-globin gene cluster. Chin Med J 1985;98:881.
8 Lindi
f M, et al. Linked polymorphic DNA markers in the prediction of X-linked muscular dystrophy Ann Hum Genet 1987;51(Pt 4):317.9 沈岩等，中国人St14/Taq IRFLPs及其在甲型血友病基因连锁分析与产前基因诊断中的应用。遗传学报1987；16：235。
10 黄正南主编，医用多因素分析，长沙：湖南科技出版社，1980：53-75。, 百拇医药