肿瘤集落细胞的双层软琼脂法培养及药敏测定
作者：孙曾一 唐惟瑜 许立功 文跃进
单位：(上海医科大学附属肿瘤医院)孙曾一 唐惟瑜 许立功；(现在南京医学院第一附属医院，210024)文跃进
关键词：
中华医学杂志910621
应用双层软琼脂技术对多种不同类型的人体肿瘤新鲜标本进行人体肿瘤细胞集落形成测定(HTCA)试验，并观察这些肿瘤对临床常用抗癌药的体外敏感性。
一、材料和方法：
1、材料：57份肿瘤标本取自57例病人，包括实体瘤及恶性胸腹水。其中36例未治。16例已治，5例治疗情况不明。培养液：RPMI1640(GIBCO)中含15%小牛血清，2U/ml胰岛素，0.3mmol/L抗坏血酸等；McCoy's 5A(GIBCO)中含15%小牛血清、0.22mg/ml丙酮酸钠、4μg/ml L-丝氨酸等。药物：阿霉素(ADM)、更生霉素(D-ACT)、5氟尿嘧啶(5FU)、丝裂霉素(MMC)、甲氨喋呤(MTX)，顺氯氨铂(PDD)及长春新硷(VCR)均为药用产品。
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2、方法：(1)制备单细胞悬液：标本切成0.5～1cm块浸入RPMI1640中，采用单纯机械法[1]，并用台盼兰进行活细胞计数。平均活细胞为60%。(2)双层软琼脂法细胞培养：以McCoy's5 A为基本培养液参照Salmon-Hamburger法[2]，并稍加改进。经预试验选择50万/皿个细胞为基本接种浓度，培养约10天后取出，平皿直接在倒置显微镜下计数集落。(3)培养前后肿瘤细胞的鉴定：32份标本作培养前后的细胞涂片，行HE染色，形态观察，7份标本采用免疫组化ABC标记法鉴定[3]，5份标本用电镜技术鉴定。(4)体外药敏试验：采用细胞培养前与药物作用1小时的方法[2]，以各药的人血药浓度与时间乘积值(C×T)的十分之一和百分之一为实验用药终浓度[4]。结果取3皿平均数，凡集落抑制率≥50%的为体外敏感[1]。
二、结果
, 百拇医药 1、57份不同类型人体肿瘤新鲜细胞在HTCA中的生长：35份(61%)标本集落数≥30个/皿，5份(9%)集落数范围在10～29皿,总集落培养成功率为70%.3份(5%)标本的集落数< 10个/皿；11份(19%)标本无集落生长；3份(5%)标本污染，后者均系胃癌手术标本。在40份成功的体外培养中，各标本集落数有差异总范围在10～554个/皿，相应的集落效率
范围在0.002～0.11%，中位集落效率为0.0314%。培养前后的细胞经常规光镜、免疫组化及电镜观察证实两者基本一致，均为恶性肿瘤细胞。
2、HTCA在体外药敏中的应用：有32份标本的HTCA体外药敏结果可评价。其中5份淋巴瘤和5份肺腺癌标本于试验前均未经化疗前者对其临床首选药ADM、MTX和VCR等显示出较高的体外敏感频度，后者则对试验所用药大多表现出抗药性。5份胃腺癌中，1例曾于1年前应用MMC、MTX和5FU巩固化疗，其淋巴结转移灶体外对MMC和5FU仍敏感。余均系未治，但对胃癌常用药ADM、MMC和PDD显示较高的体外敏感频度。6份乳腺癌标本中，5份于试验前曾用MTX和5FU化疗无效，体外实验除1份对5FU敏感，1份对MTX敏感，余均显示抗药性。另1份于试验前曾用MTX和5FU有效，体外也均敏感。其他如肠癌、黑色素瘤等因例数较少，故不赘述。
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三、讨论
本组结果显示多种不同肿瘤集落细胞的总阳性生长率为70%，集落效率范围在0.002～0.11%，与文献[1，5]报道相按时完成。曾有试验研究去除非恶性细胞及坏死细胞以纯化肿瘤细胞悬液及应用巨噬细胞及生长因子等，仅使肿瘤集落生长率略为提高[6]。提示集落效率较低可能与细胞群中肿瘤集落形成细胞的比例很低有关。
本组中，已治的肿瘤标本对抗癌药的体外不敏感性与临床相同，阴性预测符合率较高，对于防止临床盲目用药，并减少由此而产生的抗药性具有重要价值。至于试验中个别肿瘤标本对曾用而无效的药物显示体外敏感，可能与肿瘤异质性的影响及确切反映人体状况的药物剂量较难明确有关。如能进一步开展联合用药敏感性测定的相关性研究，则可使其更具实用性。
参考文献
1 Von Hoff DD, et al. Prospective clinical trial of a human tumor cloning system Cancer Res 1983;43:1926.
, 百拇医药
2 Hamburger AW, et al. The Salmon-Hamburger "stem" cell assay In Dendy PP. Hill BT (eds). Human tumor drug sensitivity testing in vitro London: Academic Press, 1983;113-119.
3 Hsu SM: Use of avidin-biotin-peroxidase complex(ABC)in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem 1981;29:577.
4 Alberts DS, et al. Tabular summary of pharmaco-kinetic parameters relevant to in vitro drug assay. IN: Salmon SE(ed). Cloning of human tumor stem cells. New York: Alan R Liss Inc, 1980;351-359.
5 Hamburger AW, salmon SE, Primary bioassay of human tumor stem cells. Science 1977;197:461.
6 Salmon SE, Human tumor clonogenic assays growth conditions and application Cancer Genet Cytogenet 1986;19:21., http://www.100md.com
单位：(上海医科大学附属肿瘤医院)孙曾一 唐惟瑜 许立功；(现在南京医学院第一附属医院，210024)文跃进
关键词：
中华医学杂志910621
应用双层软琼脂技术对多种不同类型的人体肿瘤新鲜标本进行人体肿瘤细胞集落形成测定(HTCA)试验，并观察这些肿瘤对临床常用抗癌药的体外敏感性。
一、材料和方法：
1、材料：57份肿瘤标本取自57例病人，包括实体瘤及恶性胸腹水。其中36例未治。16例已治，5例治疗情况不明。培养液：RPMI1640(GIBCO)中含15%小牛血清，2U/ml胰岛素，0.3mmol/L抗坏血酸等；McCoy's 5A(GIBCO)中含15%小牛血清、0.22mg/ml丙酮酸钠、4μg/ml L-丝氨酸等。药物：阿霉素(ADM)、更生霉素(D-ACT)、5氟尿嘧啶(5FU)、丝裂霉素(MMC)、甲氨喋呤(MTX)，顺氯氨铂(PDD)及长春新硷(VCR)均为药用产品。
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2、方法：(1)制备单细胞悬液：标本切成0.5～1cm块浸入RPMI1640中，采用单纯机械法[1]，并用台盼兰进行活细胞计数。平均活细胞为60%。(2)双层软琼脂法细胞培养：以McCoy's5 A为基本培养液参照Salmon-Hamburger法[2]，并稍加改进。经预试验选择50万/皿个细胞为基本接种浓度，培养约10天后取出，平皿直接在倒置显微镜下计数集落。(3)培养前后肿瘤细胞的鉴定：32份标本作培养前后的细胞涂片，行HE染色，形态观察，7份标本采用免疫组化ABC标记法鉴定[3]，5份标本用电镜技术鉴定。(4)体外药敏试验：采用细胞培养前与药物作用1小时的方法[2]，以各药的人血药浓度与时间乘积值(C×T)的十分之一和百分之一为实验用药终浓度[4]。结果取3皿平均数，凡集落抑制率≥50%的为体外敏感[1]。
二、结果
, 百拇医药 1、57份不同类型人体肿瘤新鲜细胞在HTCA中的生长：35份(61%)标本集落数≥30个/皿，5份(9%)集落数范围在10～29皿,总集落培养成功率为70%.3份(5%)标本的集落数< 10个/皿；11份(19%)标本无集落生长；3份(5%)标本污染，后者均系胃癌手术标本。在40份成功的体外培养中，各标本集落数有差异总范围在10～554个/皿，相应的集落效率
范围在0.002～0.11%，中位集落效率为0.0314%。培养前后的细胞经常规光镜、免疫组化及电镜观察证实两者基本一致，均为恶性肿瘤细胞。2、HTCA在体外药敏中的应用：有32份标本的HTCA体外药敏结果可评价。其中5份淋巴瘤和5份肺腺癌标本于试验前均未经化疗前者对其临床首选药ADM、MTX和VCR等显示出较高的体外敏感频度，后者则对试验所用药大多表现出抗药性。5份胃腺癌中，1例曾于1年前应用MMC、MTX和5FU巩固化疗，其淋巴结转移灶体外对MMC和5FU仍敏感。余均系未治，但对胃癌常用药ADM、MMC和PDD显示较高的体外敏感频度。6份乳腺癌标本中，5份于试验前曾用MTX和5FU化疗无效，体外实验除1份对5FU敏感，1份对MTX敏感，余均显示抗药性。另1份于试验前曾用MTX和5FU有效，体外也均敏感。其他如肠癌、黑色素瘤等因例数较少，故不赘述。
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三、讨论
本组结果显示多种不同肿瘤集落细胞的总阳性生长率为70%，集落效率范围在0.002～0.11%，与文献[1，5]报道相按时完成。曾有试验研究去除非恶性细胞及坏死细胞以纯化肿瘤细胞悬液及应用巨噬细胞及生长因子等，仅使肿瘤集落生长率略为提高[6]。提示集落效率较低可能与细胞群中肿瘤集落形成细胞的比例很低有关。
本组中，已治的肿瘤标本对抗癌药的体外不敏感性与临床相同，阴性预测符合率较高，对于防止临床盲目用药，并减少由此而产生的抗药性具有重要价值。至于试验中个别肿瘤标本对曾用而无效的药物显示体外敏感，可能与肿瘤异质性的影响及确切反映人体状况的药物剂量较难明确有关。如能进一步开展联合用药敏感性测定的相关性研究，则可使其更具实用性。
参考文献
1 Von Hoff DD, et al. Prospective clinical trial of a human tumor cloning system Cancer Res 1983;43:1926.
, 百拇医药
2 Hamburger AW, et al. The Salmon-Hamburger "stem" cell assay In Dendy PP. Hill BT (eds). Human tumor drug sensitivity testing in vitro London: Academic Press, 1983;113-119.
3 Hsu SM: Use of avidin-biotin-peroxidase complex(ABC)in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem 1981;29:577.
4 Alberts DS, et al. Tabular summary of pharmaco-kinetic parameters relevant to in vitro drug assay. IN: Salmon SE(ed). Cloning of human tumor stem cells. New York: Alan R Liss Inc, 1980;351-359.
5 Hamburger AW, salmon SE, Primary bioassay of human tumor stem cells. Science 1977;197:461.
6 Salmon SE, Human tumor clonogenic assays growth conditions and application Cancer Genet Cytogenet 1986;19:21., http://www.100md.com