老龄小鼠中枢兴奋性氨基酸递质及N-甲基-D-天冬氨酸受体的变化*
作者：梁发权 吕宝璋
单位：军事医学科学院基础医学研究所Δ
关键词：神经调节剂；受体，神经体液；衰老；记忆
中华医学杂志920110
摘要 本研究证实，老龄小鼠大脑皮质中L-谷氨酸的含量较正常小鼠低18.7%，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的数目明显减少；老龄小鼠海马CA1区突触传递的长时程增强电位(LTP)明显减弱。结果提示，老龄小鼠中枢兴奋性氨基酸-NMDA受体-LTP系统的功能明显降低。这一变化可能与衰老时学习与记忆的减退有一定关系。
兴奋性氨基酸(EAA)是中枢主要的兴奋性神经递质，通过与相应的受体相结合参与中枢神经的信息传递。EAA及其受体，主要是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDN)受体，在学习、记忆、突触可塑性和神经发育过程中起着重要作用[1~3]。突触传递电位的长时程增强(LTP)是学习与记忆过程中神经元活动的客观指标，它反映了突触水平上信息贮存的过程[4]。LTP是通过NMDA受体的介导而产生的[5]。我们观察了老龄小鼠中枢EAA-NMDA受体-LTP这一与学习和记忆密切相关的系统的变化，以探讨衰老时学习和记忆衰退以及神经元可塑性改变的机理。
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材料与方法
一、试剂与实验动物
3H-L-谷氨酸(3H-L-Glu，1.70TBq/mmol)购自英国Amersham公司，NMDA购自Sigma公司。实验动物为昆明种雄性小鼠，由军事医学科学院实验动物中心提供。正常小鼠为2月龄，体重20±2g；老龄小鼠为14个月龄，体重30±4g。
二、小鼠大脑皮质细胞膜蛋白的制备
将小鼠断头处死后，迅速分离大脑皮质，加入10倍体积的0.32 mol/L蔗糖溶液，用内切式匀浆器以200 r/min匀浆30秒。匀浆以1 000×g离心10分钟，取上清，用Soniprep150型超声破碎仪破碎细胞，以34 000×g离心20分钟，弃上清，将沉淀悬浮于人工脑脊液(含葡萄糖、蔗糖、NaCL、KCl、CaCl2、MgCl2和羟甲基氨基甲烷分别为10、280、124、5、1.2、1.2和15.6mmol/L，用2mol/L HCl调至pH8.5)中，立即供实验用。
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三、受体结合饱和实验
取200 µl膜制剂(含膜蛋白1mg)与终浓度分别为2、4、6、8、10和12nmol/L的3H-L-Glu混合，并加入人工脑脊液使其总体积为500µl，此为总结合管；非特异结合管另加终浓度为1mmol/L的非标记NMDA。各管在25ºC水浴中反应30分钟后，经玻璃纤维滤膜抽滤；以冰冷生理盐水冲洗后，将膜片在80ºC烤干，置入盛有5ml闪烁液(0.5%2，5-二苯基噁唑的甲苯溶液)的计数瓶中，用LKB-1215型液闪计数仪测基放射性。
四、脑组织中EAA含量的测定
将小鼠大脑皮质称重后，加入1ml双蒸馏水，匀浆，再加入1ml10%的三氯醋酸，震荡1分钟，以2 000×g离心10分钟；留取上清，用自动氨基酸分析仪检测L-Glu和天冬氨酸(L-Asp)的含量。
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五、突触体对3H-L-Glu的摄取与释放
将大脑皮质匀浆1000×g离心10分钟，取上清，再以34 000×g离心20分钟，弃上清，将沉淀混悬于Krebs液中，即得到突触体制剂。取该制剂200µl(含蛋白1mg)与终浓度为20mmol/L的3H-L-Glu混匀，加Krebs液使总体积为500µl。在25ºC水浴中反应30分钟，按前法抽滤，以测定突触体摄取的3H-L-Glu量。在突触体制剂与3H-L-Glu反应30分钟后，加入终浓度为50 mmol/L的KCl并继续反应10分钟，再按前法测定突触体内3H-L-Glu剩余量。突触体释放3H-L-Glu量为其摄取量与加入高浓度K+后剩余量的差值。
六、LTP测定
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断头处死小鼠后，迅速分离海马，横切成500µm的薄片。将脑片放入一标准液(含NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3、NaHPO4、MgSO4和葡萄糖分别为124、5.0、2.0、22.0、1.25、2.0和10mmol/L)中，通过95%O2和5%CO2的混合气体，在31ºC孵育1小时。然后将脑片转移至记录糟中，在海马CA1区的辐射层插入钨电极(刺激电极)，每10秒组予Schaffer侧通路一个低频刺激(0.5Hz)；另在CA1区的锥体层插入玻璃电极，以记录突触电位的变化。强直刺激由100个电脉冲(100Hz，1秒)组成。
结果
一、老龄小鼠大脑皮质NMDA受体变化
由结合饱和实验所得特异结合的数据，经Scatchard分析求得受体的最大结合容量(Bmax)和平衡解放常数(KD)。由表1可见，10和14月龄小鼠大脑皮质中NMDA受体的Bmax明显低于2月龄者(P<0.01)，但三者的KD值在统计学上无显著差异。表明老龄小鼠大脑皮质中的NMDAE受体数量明显减少，而亲和力无明显变化。
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表1 不同月龄小鼠大脑皮质NMDA受体数量和亲和力的变化(
±s) 月龄
鼠数
Bmax(fmol/mg蛋白)
KD(nmol/L)
2
12
2 351±613
40±29
10
9
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1 238±322*
28±14
14
13
573±207*
22±10
*与2月龄比较P<0.01
二、老龄小鼠大脑皮质EAA含量的变化
脑中EAA主要是L-Glu和L-Asp。老龄小鼠大脑皮质中L-Glu的含量明显低于2月龄者，但L-Asp含量无明显改变(表2)
表2 老龄小鼠大脑皮质EAA含量变化(±s) 组别
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鼠数
L-Glu(µg/g组织)
L-Asp(µg/g组织)
正常组
12
7.1±1.7
2.8±0.4
老龄组
12
5.8±0.9*
2.9±0.6
*与正常组比较P<0.05
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三、老龄小鼠大脑皮质突触体对3H-L-Glu摄取和释放的情况
2月龄和14月小鼠大脑皮质突触体摄3H-L-Glu分别为3 885±345和4 060±689fmol/mg蛋白质；所释放的3H-L-Glu量分别为2 721±191和3 008±605fol/mg蛋白质。两组数据在统计学上均无显著性差异(P>0.05)。提示上述突触后受体数量的变化与突触前该受体天然配基的调节作用无关。
四、老龄小鼠海马CA1区LTP的变化
由附图和表3可见老龄小鼠海马CA1区突触群峰电位(PS)低于正常小鼠；给强直刺激后，PS上升的幅度小，振幅和斜率均明显低于正常。老龄小鼠LTP持续时间短(<90分钟，正常小鼠>90分钟)；引发LTP所需强直刺激次数多在2次以上(正常小鼠多为1次)。表明老龄小鼠中枢突触传递的LTP明显减弱。
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表3 老龄小鼠海马CA1区LTP斜率和振幅的变化(±s) 组别
鼠数
斜率(mV/ms)
振幅(mV)
强直前
强直后
强直前
强前后
正常组
8
4.5±1.7
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12±3.9
1.7±0.7
4.9±2.7
老龄组
6
3.2±1.1
5.9±2.7**
0.8±0.3**
2.9±1.0*
老龄组与正常比较*P<0.05**P<0.01
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A和B分别表示正常和老龄小鼠的LTPT1和T2分别表示第1次和第2次强直刺激
附图 正常和老龄小鼠海马CA1区LTP的比较
讨论
学习与记忆是一个复杂的高级神经活动。早在1893年就有人提出学习可能涉及神经元之间连接强度的变化。其后，有人进上步提出记忆可能与突触传递效率的持续变化有前。1973年Bliss和Lomo发现，当用短串高频电刺激海马的兴奋性传入纤维时，海马的突触传递电位可在数秒内增强，该效应可持续数小时至数周。这一现象被称为突触传递电位的长时程增强，即LTP。LTP被认为是记忆的一种方式[6]，是突触可塑性的一个模式，因此将产生传递效率持续变化的突触称之为可塑性突触[7]。LTP不仅可见于脑内与形成记忆早期阶段有关的海马和杏仁核等结构，且亦见于贮存记忆的大脑皮层[6]。如前所述，LTP的产生是由EAA及NMOA受体介导的，其机理可概括如下：当神经元的膜电位接近静息电位时，与NMDA受体偶联的离子通道被Mg2+所阻断；在EAA与NMDA受体结合后，Mg2+的上述阻断作用逐渐被解除，此时Ca2+(伴有Na+)则可通过此通道向细胞内内流，在钙调蛋白作用下，始终细胞内一系列生理生化反应，最终产生LTP[7，8]。关于EAA-
, 百拇医药
NMDA受体-LTP系统学与学习和记忆的关系已有大量报道。例如，动物实验表明，向脑室内导入NMDA受体拮抗剂AP5，或向杏仁核中注射微量AP5，在阻止LTP产生的同时，可见丧失对空间或部位的学习能力，也不再能保持条件性惊恐反应和抑制回避的能力[6，9]。可见NMDA受体和由它介导的LTP生成，在学习和记忆的形成与保持中起着重要作用。
本研究证实，老龄小鼠大脑皮质中L-Glu含量和NMDA受体数量均明显减少，其海马CA1区中的LTP明显减弱，提示EAA-NMDA受体-LTP系统的功能明显减退。这些变化可能与衰老时的一些表现，诸如学习和记忆衰退以及突触可塑性的改变等有一定关系。
参考文献
1.Collingridge GL, Singer W. Excitatory aminacid receptor and synaptic plasticyty. Trends Pharo macol Sci 1990; 11:290.
, 百拇医药
2.McCabe BJ, Horn G. Learning and memory: regional changes in NMDAreceptors in the chick brain after imprinting. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:2849.
3.Lipton SA. Kater SB. Neurotransmitter regulation of neuronal outgrowth, plasticity and survival Trend Neuro Sci 1989; 12:265.
4.Teyler TJ. Discenna P Long-term potentiation as a candrdate mnemonic device Brain Res 1984; 319:15.
5.Collingridge GL. Davies SN. NMDA receptor and long-term potentiation in the hippcampus In: Watkins GC. Collingridge GL. eds NMDA receptors. New Youk Academic Press 1990; 123-135.
, 百拇医药
6.Izquierdo I. Role of NMDA receptors in memoruy. Tiends Pharmacol Sct 1991; 12:128.
7.Malinow R, et al Persistent protein kinase activity unterling-term potentration Nature 1988; 335:820.
8.Izumi Y. et al. Requirement of extracellular Ca2+ after tetanus for indrction of long-term potentiation in gunea pig hippocampal slices. Neurosci Lett 1987; 77:176.
9.Morris RG. et al. Selective impairment of learning and blocdade of long-term potentiation by an n-methyl-D-aspartate receptor antagonist, AP5. Nature 1986; 319:774.
(1991年3月12日收稿 同年7月25日修回), http://www.100md.com
单位：军事医学科学院基础医学研究所Δ
关键词：神经调节剂；受体，神经体液；衰老；记忆
中华医学杂志920110
摘要 本研究证实，老龄小鼠大脑皮质中L-谷氨酸的含量较正常小鼠低18.7%，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的数目明显减少；老龄小鼠海马CA1区突触传递的长时程增强电位(LTP)明显减弱。结果提示，老龄小鼠中枢兴奋性氨基酸-NMDA受体-LTP系统的功能明显降低。这一变化可能与衰老时学习与记忆的减退有一定关系。
兴奋性氨基酸(EAA)是中枢主要的兴奋性神经递质，通过与相应的受体相结合参与中枢神经的信息传递。EAA及其受体，主要是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDN)受体，在学习、记忆、突触可塑性和神经发育过程中起着重要作用[1~3]。突触传递电位的长时程增强(LTP)是学习与记忆过程中神经元活动的客观指标，它反映了突触水平上信息贮存的过程[4]。LTP是通过NMDA受体的介导而产生的[5]。我们观察了老龄小鼠中枢EAA-NMDA受体-LTP这一与学习和记忆密切相关的系统的变化，以探讨衰老时学习和记忆衰退以及神经元可塑性改变的机理。
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材料与方法
一、试剂与实验动物
3H-L-谷氨酸(3H-L-Glu，1.70TBq/mmol)购自英国Amersham公司，NMDA购自Sigma公司。实验动物为昆明种雄性小鼠，由军事医学科学院实验动物中心提供。正常小鼠为2月龄，体重20±2g；老龄小鼠为14个月龄，体重30±4g。
二、小鼠大脑皮质细胞膜蛋白的制备
将小鼠断头处死后，迅速分离大脑皮质，加入10倍体积的0.32 mol/L蔗糖溶液，用内切式匀浆器以200 r/min匀浆30秒。匀浆以1 000×g离心10分钟，取上清，用Soniprep150型超声破碎仪破碎细胞，以34 000×g离心20分钟，弃上清，将沉淀悬浮于人工脑脊液(含葡萄糖、蔗糖、NaCL、KCl、CaCl2、MgCl2和羟甲基氨基甲烷分别为10、280、124、5、1.2、1.2和15.6mmol/L，用2mol/L HCl调至pH8.5)中，立即供实验用。
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三、受体结合饱和实验
取200 µl膜制剂(含膜蛋白1mg)与终浓度分别为2、4、6、8、10和12nmol/L的3H-L-Glu混合，并加入人工脑脊液使其总体积为500µl，此为总结合管；非特异结合管另加终浓度为1mmol/L的非标记NMDA。各管在25ºC水浴中反应30分钟后，经玻璃纤维滤膜抽滤；以冰冷生理盐水冲洗后，将膜片在80ºC烤干，置入盛有5ml闪烁液(0.5%2，5-二苯基噁唑的甲苯溶液)的计数瓶中，用LKB-1215型液闪计数仪测基放射性。
四、脑组织中EAA含量的测定
将小鼠大脑皮质称重后，加入1ml双蒸馏水，匀浆，再加入1ml10%的三氯醋酸，震荡1分钟，以2 000×g离心10分钟；留取上清，用自动氨基酸分析仪检测L-Glu和天冬氨酸(L-Asp)的含量。
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五、突触体对3H-L-Glu的摄取与释放
将大脑皮质匀浆1000×g离心10分钟，取上清，再以34 000×g离心20分钟，弃上清，将沉淀混悬于Krebs液中，即得到突触体制剂。取该制剂200µl(含蛋白1mg)与终浓度为20mmol/L的3H-L-Glu混匀，加Krebs液使总体积为500µl。在25ºC水浴中反应30分钟，按前法抽滤，以测定突触体摄取的3H-L-Glu量。在突触体制剂与3H-L-Glu反应30分钟后，加入终浓度为50 mmol/L的KCl并继续反应10分钟，再按前法测定突触体内3H-L-Glu剩余量。突触体释放3H-L-Glu量为其摄取量与加入高浓度K+后剩余量的差值。
六、LTP测定
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断头处死小鼠后，迅速分离海马，横切成500µm的薄片。将脑片放入一标准液(含NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3、NaHPO4、MgSO4和葡萄糖分别为124、5.0、2.0、22.0、1.25、2.0和10mmol/L)中，通过95%O2和5%CO2的混合气体，在31ºC孵育1小时。然后将脑片转移至记录糟中，在海马CA1区的辐射层插入钨电极(刺激电极)，每10秒组予Schaffer侧通路一个低频刺激(0.5Hz)；另在CA1区的锥体层插入玻璃电极，以记录突触电位的变化。强直刺激由100个电脉冲(100Hz，1秒)组成。
结果
一、老龄小鼠大脑皮质NMDA受体变化
由结合饱和实验所得特异结合的数据，经Scatchard分析求得受体的最大结合容量(Bmax)和平衡解放常数(KD)。由表1可见，10和14月龄小鼠大脑皮质中NMDA受体的Bmax明显低于2月龄者(P<0.01)，但三者的KD值在统计学上无显著差异。表明老龄小鼠大脑皮质中的NMDAE受体数量明显减少，而亲和力无明显变化。
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表1 不同月龄小鼠大脑皮质NMDA受体数量和亲和力的变化(
±s) 月龄鼠数
Bmax(fmol/mg蛋白)
KD(nmol/L)
2
12
2 351±613
40±29
10
9
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1 238±322*
28±14
14
13
573±207*
22±10
*与2月龄比较P<0.01
二、老龄小鼠大脑皮质EAA含量的变化
脑中EAA主要是L-Glu和L-Asp。老龄小鼠大脑皮质中L-Glu的含量明显低于2月龄者，但L-Asp含量无明显改变(表2)
表2 老龄小鼠大脑皮质EAA含量变化(
±s) 组别, http://www.100md.com
鼠数
L-Glu(µg/g组织)
L-Asp(µg/g组织)
正常组
12
7.1±1.7
2.8±0.4
老龄组
12
5.8±0.9*
2.9±0.6
*与正常组比较P<0.05
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三、老龄小鼠大脑皮质突触体对3H-L-Glu摄取和释放的情况
2月龄和14月小鼠大脑皮质突触体摄3H-L-Glu分别为3 885±345和4 060±689fmol/mg蛋白质；所释放的3H-L-Glu量分别为2 721±191和3 008±605fol/mg蛋白质。两组数据在统计学上均无显著性差异(P>0.05)。提示上述突触后受体数量的变化与突触前该受体天然配基的调节作用无关。
四、老龄小鼠海马CA1区LTP的变化
由附图和表3可见老龄小鼠海马CA1区突触群峰电位(PS)低于正常小鼠；给强直刺激后，PS上升的幅度小，振幅和斜率均明显低于正常。老龄小鼠LTP持续时间短(<90分钟，正常小鼠>90分钟)；引发LTP所需强直刺激次数多在2次以上(正常小鼠多为1次)。表明老龄小鼠中枢突触传递的LTP明显减弱。
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表3 老龄小鼠海马CA1区LTP斜率和振幅的变化(
±s) 组别鼠数
斜率(mV/ms)
振幅(mV)
强直前
强直后
强直前
强前后
正常组
8
4.5±1.7
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12±3.9
1.7±0.7
4.9±2.7
老龄组
6
3.2±1.1
5.9±2.7**
0.8±0.3**
2.9±1.0*
老龄组与正常比较*P<0.05**P<0.01
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A和B分别表示正常和老龄小鼠的LTPT1和T2分别表示第1次和第2次强直刺激
附图 正常和老龄小鼠海马CA1区LTP的比较
讨论
学习与记忆是一个复杂的高级神经活动。早在1893年就有人提出学习可能涉及神经元之间连接强度的变化。其后，有人进上步提出记忆可能与突触传递效率的持续变化有前。1973年Bliss和Lomo发现，当用短串高频电刺激海马的兴奋性传入纤维时，海马的突触传递电位可在数秒内增强，该效应可持续数小时至数周。这一现象被称为突触传递电位的长时程增强，即LTP。LTP被认为是记忆的一种方式[6]，是突触可塑性的一个模式，因此将产生传递效率持续变化的突触称之为可塑性突触[7]。LTP不仅可见于脑内与形成记忆早期阶段有关的海马和杏仁核等结构，且亦见于贮存记忆的大脑皮层[6]。如前所述，LTP的产生是由EAA及NMOA受体介导的，其机理可概括如下：当神经元的膜电位接近静息电位时，与NMDA受体偶联的离子通道被Mg2+所阻断；在EAA与NMDA受体结合后，Mg2+的上述阻断作用逐渐被解除，此时Ca2+(伴有Na+)则可通过此通道向细胞内内流，在钙调蛋白作用下，始终细胞内一系列生理生化反应，最终产生LTP[7，8]。关于EAA-
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NMDA受体-LTP系统学与学习和记忆的关系已有大量报道。例如，动物实验表明，向脑室内导入NMDA受体拮抗剂AP5，或向杏仁核中注射微量AP5，在阻止LTP产生的同时，可见丧失对空间或部位的学习能力，也不再能保持条件性惊恐反应和抑制回避的能力[6，9]。可见NMDA受体和由它介导的LTP生成，在学习和记忆的形成与保持中起着重要作用。
本研究证实，老龄小鼠大脑皮质中L-Glu含量和NMDA受体数量均明显减少，其海马CA1区中的LTP明显减弱，提示EAA-NMDA受体-LTP系统的功能明显减退。这些变化可能与衰老时的一些表现，诸如学习和记忆衰退以及突触可塑性的改变等有一定关系。
参考文献
1.Collingridge GL, Singer W. Excitatory aminacid receptor and synaptic plasticyty. Trends Pharo macol Sci 1990; 11:290.
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2.McCabe BJ, Horn G. Learning and memory: regional changes in NMDAreceptors in the chick brain after imprinting. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:2849.
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4.Teyler TJ. Discenna P Long-term potentiation as a candrdate mnemonic device Brain Res 1984; 319:15.
5.Collingridge GL. Davies SN. NMDA receptor and long-term potentiation in the hippcampus In: Watkins GC. Collingridge GL. eds NMDA receptors. New Youk Academic Press 1990; 123-135.
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6.Izquierdo I. Role of NMDA receptors in memoruy. Tiends Pharmacol Sct 1991; 12:128.
7.Malinow R, et al Persistent protein kinase activity unterling-term potentration Nature 1988; 335:820.
8.Izumi Y. et al. Requirement of extracellular Ca2+ after tetanus for indrction of long-term potentiation in gunea pig hippocampal slices. Neurosci Lett 1987; 77:176.
9.Morris RG. et al. Selective impairment of learning and blocdade of long-term potentiation by an n-methyl-D-aspartate receptor antagonist, AP5. Nature 1986; 319:774.
(1991年3月12日收稿 同年7月25日修回), http://www.100md.com