冬虫夏草对慢性肾功能不全大鼠细胞免疫机能的调节作用*
作者：程庆 陈香美 廖洪军 田劲 蒋工伟
单位：中国人民解放军总医院肾内科Δ
关键词：冬虫夏草；肾功能衰竭，慢性；免疫，细胞
中华医学杂志920108 程庆
陈香美 廖洪军 田劲 蒋工伟
摘要 采用5/6肾切除制备大鼠慢性肾功能不全的模型，尔后用冬虫夏草煎剂进行实验治疗。结果显示冬虫百般草可能降低慢性肾功能不全大鼠的死亡率，改善其贫血状况，降低血尿素氮及肌酐水平，并能增强脾淋巴细胞转化率，促进淋巴细胞产生白细胞介素2(IL2)，增加淋巴细胞对IL2的吸收率。说明冬虫夏草能改善慢性肾功能不全大鼠的细胞免疫功能，延缓慢性肾功能不全的进展。
, http://www.100md.com 慢性肾功能不全(CRF)患者往往伴有严惩的免疫功能缺陷，容易合并结核及各种感染，从而加速CRF的进展。冬虫故里草(Cordyceps Sinensis(Berk)Sacc，简称虫草)作为扶正回本的免疫增强剂已广泛地应用于临床，并取得了一定的疗效[1，2]。为探讨虫草的免疫增强作用机制，我们采用CRF动物模型观察了虫草对细胞免疫功能的影响，旨在为临床上应用虫草调节CR垢细胞免疫功能提供依据。
材料与方法
一、中药制剂
市售四川产虫草生药，先以水浸泡，4ºC过夜，尔后用文火将其深缩成含生药0.5g/ml的水煎剂，4ºC保存备用。
二、CRF动物模型的制备及分组
实验用Wistar雌性大鼠(重约140~150g，由本院实验动物中心提供)，以0.25%硫贲妥钠腹腔注射麻醉后，腹部常规消毒，正中切口暴露双肾，剥离肾包膜，右肾结扎后切除、左肾切除上、下两极(共切除5/6肾)后用明胸部海绵压迫止血，关闭腹腔。饲养1周年随机分为两组：(1)虫草治疗组(CRF+CS)，每日用不1ml早草煎剂灌胃一次；(2)慢性肾功能不全组(CRF组)，每日用1ml生理盐水灌胃一次。另设一组未做手术的正常对照组(Normal)。全部动物于饲养4个月后处死，采血，取脾脏。
, 百拇医药
三、脾细胞悬液的制备
无菌状况下取实验大鼠脾脏于200目网筛上研磨后收集细胞，以NH4CL/Tris液溶血后，生理盐水洗涤细胞3次，悬浮于10%FCS·RPMI1640培养液中计数备用。
四、检测项目
1.各组大鼠均采血以溶血比色法(溶血剂为溴代十六烷)测血红蛋白；以二乙酰一肟法(检测试剂系北京化工厂产品)测定血清尿素氮(BUN)；血清肌酐(Scr)的测定采用碱性苦味酸法。
2.淋巴细胞转化试验：取3×105/孔脾细胞加入96孔细胞培养板中，加培养液至150µl/孔，然后加入植物血凝素(PHA)1µg/孔，5%CO2、37ºC孵育72小时，最后8小时掺入3H-Tdr(中国科学院原子能研究所产品)0.5µCi/孔，收集细胞测定cpm值。
, 百拇医药
3.白细胞介素2(IL2)的诱生及检测：取脾细胞2×106/孔置于24孔培养板中，用培养液添加为1ml，加入PHA4µg/孔，孵育48小后后离心收集上清。将IL2依赖细胞株CTLL2细胞(日本顺天堂大学奥村康教授惠赠)以无血清RPMI 1640培养液洗涤5次，配成浓度为1×105/ml细胞悬液，取悬液100µl及待测标本上清100µl混于96孔培养板中，孵育42小时后加入噻唑蓝(MTT)10µl/孔，继续培养6小时，然后离心去上清，加入二甲基亚砜100µl，混匀放置30分钟，492nm波长比色测定吸光度用以表示IL2的活性。
4.IL2受体量：采用IL2吸收法[3]进行检测，即取脾细胞4×106加入1ml培养液，再加入人工重组IL2标准品(日本塩野義公司产品)100U孵育。每15分钟收集上清IL2活性，与未经细胞吸收吸收的IL2活性进行比较，按下列公式计算IL2的吸收率，吸收率与细胞膜上的IL2受体量呈正比。
, 百拇医药
表1 各组大鼠体重、血红蛋白、血尿素氮及肌酐的变化(
+s)
鼠数
体重
(g)
血红蛋白
(g/dl)
血尿素氮
(mg/dl)
血清肌酐
(mg/dl)
Normal
, 百拇医药
11
274±21
16.2±1.4
24.2±7.6
0.8±0.3
CRF+CS
12
215±35*
15.3±1.3
57.2±6.6*
1.1±0.3
CRF
, 百拇医药
8
241±39*
13.4±0.9*
75.7±1.9*
2.5±0.7*
*与Normal组比较P<0.05
结果
一、各组大鼠存活率的比较
正常对照组区12只大鼠，饲养4个月后存活11只，另1只因意外死亡；CRF组18只大鼠中存活8只(44.4%)；CRF+CS组18只中存活12只(66.7%)。
, http://www.100md.com
二、各组大鼠体重、血红蛋白及血清尿素氮、肌酐的变化(表1)
CRF组体重、血红蛋白水平明显低于正常对照，而血清尿素氮、肌酐则明显高于正常对照给(P均<0.05)。CRF+CS组血尿素氮水平虽也高于正常对照组(P<0.05),但低于CRF组(P<0.05)，血红蛋白及血清肌酐值与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
三、淋巴细胞转化试验
CRF组淋巴细胞转休水平(7 535±965cpm)较正常对照组(25 615±5 441cpm)及CRF+CS组(24 886±5 743cpm)均明显降低(P均<0.01),CRF+CS组淋巴细胞转化水平与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
四、大鼠脾细胞产生IL2的水平
将各组大鼠的脾细胞用PHA刺激后，观察其产生IL2的水平，结果如表2所示。在1/2稀释度上清中，CRF组大鼠脾细胞产生IL2的水平明显低于正常对照组及CRF+CS组(P均<0.05)。在1/4稀释上清中，各组IL2活性无明显差别，但以CRF组IL2活性为最低。
, http://www.100md.com
表2 各组大鼠IL2诱生实验结果(±s) 组别
鼠数
IL2活性(吸光度)
1/2稀释度
1/4稀光度
Normal
11
0.168±0.035
0.117±0.028
CRF+CS
12
, 百拇医药
0.168±0.013
0.124±0.051
CRF
8
0.134±0.030*
0.102±0.021
*与Normal及CRF+CS组比较P<0.05表3 各组大鼠脾细胞对IL2吸收率(±s) 组别
鼠数
IL2吸收率(%)
, http://www.100md.com 1/2稀释度
1/4稀光度
Normal
11
33±13
54±12
CRF+CS
12
34±14
45±73
CRF
8
19±7*
, 百拇医药
24±8*
*与Normal及CRF+CS组比较P<0.01
五、脾细胞IL2受体的表达(表3)
CRF组脾细胞膜上IL2受体量较正常对照组及CRF+CS组均明显下降(P均<0.01)，CRF+CS组脾细胞膜上IL2受体量与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
讨论
CRF的细胞免疫功能缺陷越来越受到人们的重视，寻找有效的药物来调节CRF细胞免疫功能是目前研究的重点之一。我们的前期实验已经证实CRF患者的细胞免疫功能改变主要在于T辅助细胞功能受损，淋巴细胞产和IL2的能力下降，以及IL2受体量减少[4]。针对这一免疫缺陷，我们选择具有增强作用的中药冬虫夏草对CRF动物模型进行实验治疗。对果发现虫草可能提高脾细胞产生IL2的水平，增加脾细胞膜IL2受体的含量，增强淋巴细胞的转化率。体外研究曾证实，虫草可能加强T、B淋巴细胞的增殖，促进脾细胞膜上的IL2受体表达，但不能诱导脾细胞产生IL2[5]。我们的实验证实了虫草在体内还能促使脾细胞产生较高水平的IL2，这可能是由于虫草能促使淋巴细胞的分化增殖，从而使T辅助细胞数增多，产生的较多的IL2。另外，有人发现尿毒症患者严重营养不良往往可导致淋巴细胞转化功能下降，循环T细胞数及T辅助细胞数减少，T抑制细胞增多[6]，从而导致机体免疫能力的低下。虫草在中药中属平补阴阳、保肺益肾的滋补药，药物成份分析发现虫草内含有丰富的必需氨基酸。因此，虫草可能从营养角度上改善了细胞免疫功能的缺陷。
, 百拇医药
临床上曾有人试用虫草治疗CRF，发现虫草可改善CRF患者的贫血状况，降低血清尿素氮及肌酐的水平[2]，我们的实验也证实了这一发现。我们认为，这一方面是由于虫草提高了慢性肾功能不全患者的细胞免疫功能，使CRF患者的机体抵抗力增强，免受感染的侵袭，从而有效地保护了残余的肾功能；另一方面可能是由于虫草可能促进肾小管上皮细胞的增生[7]，保护肾小管的功能，从而进一步保护肾小球功能免遭损害，延缓了慢性肾功能不全的进展。
参考文献
1.王玉润.冬虫夏草合剂治疗3例晚期恶性肿瘤.上海中医药杂志 1979;(5):28.
2.陈以平,等.冬虫夏草为主治疗慢性肾功能衰竭28例初步观察.上海中医药杂志 1984;(2):11.3.
3.匡彦德,等.IL-2吸收试验检测CTLL2细胞和ConA活化小鼠脾细胞的IL-2受体.上海医科大学学报
, 百拇医药
1988;15:259.
4.程庆,等.终末期肾病透析患者外周血淋巴细胞产生IL-2能力的观察.解放军医学杂志 1990;15:257.
5.匡彦德,等.冬虫夏草免疫增强作用机理的研究.上海免疫学杂志 1989;9:6.
6.Dowd PS,et al. The influence of undernutrition on immunity. Clin Sci Mol Med 1984; 66:241.
7.田劲,等.冬虫夏草、大黄及5/6肾切除后血清对大鼠肾小管上皮细胞生长的影响.中西医结合杂志 1991; 11:547.
(1991年5月25日收稿 同年10月7日修回), 百拇医药
单位：中国人民解放军总医院肾内科Δ
关键词：冬虫夏草；肾功能衰竭，慢性；免疫，细胞
中华医学杂志920108 程庆
陈香美 廖洪军 田劲 蒋工伟摘要 采用5/6肾切除制备大鼠慢性肾功能不全的模型，尔后用冬虫夏草煎剂进行实验治疗。结果显示冬虫百般草可能降低慢性肾功能不全大鼠的死亡率，改善其贫血状况，降低血尿素氮及肌酐水平，并能增强脾淋巴细胞转化率，促进淋巴细胞产生白细胞介素2(IL2)，增加淋巴细胞对IL2的吸收率。说明冬虫夏草能改善慢性肾功能不全大鼠的细胞免疫功能，延缓慢性肾功能不全的进展。
, http://www.100md.com 慢性肾功能不全(CRF)患者往往伴有严惩的免疫功能缺陷，容易合并结核及各种感染，从而加速CRF的进展。冬虫故里草(Cordyceps Sinensis(Berk)Sacc，简称虫草)作为扶正回本的免疫增强剂已广泛地应用于临床，并取得了一定的疗效[1，2]。为探讨虫草的免疫增强作用机制，我们采用CRF动物模型观察了虫草对细胞免疫功能的影响，旨在为临床上应用虫草调节CR垢细胞免疫功能提供依据。
材料与方法
一、中药制剂
市售四川产虫草生药，先以水浸泡，4ºC过夜，尔后用文火将其深缩成含生药0.5g/ml的水煎剂，4ºC保存备用。
二、CRF动物模型的制备及分组
实验用Wistar雌性大鼠(重约140~150g，由本院实验动物中心提供)，以0.25%硫贲妥钠腹腔注射麻醉后，腹部常规消毒，正中切口暴露双肾，剥离肾包膜，右肾结扎后切除、左肾切除上、下两极(共切除5/6肾)后用明胸部海绵压迫止血，关闭腹腔。饲养1周年随机分为两组：(1)虫草治疗组(CRF+CS)，每日用不1ml早草煎剂灌胃一次；(2)慢性肾功能不全组(CRF组)，每日用1ml生理盐水灌胃一次。另设一组未做手术的正常对照组(Normal)。全部动物于饲养4个月后处死，采血，取脾脏。
, 百拇医药
三、脾细胞悬液的制备
无菌状况下取实验大鼠脾脏于200目网筛上研磨后收集细胞，以NH4CL/Tris液溶血后，生理盐水洗涤细胞3次，悬浮于10%FCS·RPMI1640培养液中计数备用。
四、检测项目
1.各组大鼠均采血以溶血比色法(溶血剂为溴代十六烷)测血红蛋白；以二乙酰一肟法(检测试剂系北京化工厂产品)测定血清尿素氮(BUN)；血清肌酐(Scr)的测定采用碱性苦味酸法。
2.淋巴细胞转化试验：取3×105/孔脾细胞加入96孔细胞培养板中，加培养液至150µl/孔，然后加入植物血凝素(PHA)1µg/孔，5%CO2、37ºC孵育72小时，最后8小时掺入3H-Tdr(中国科学院原子能研究所产品)0.5µCi/孔，收集细胞测定cpm值。
, 百拇医药
3.白细胞介素2(IL2)的诱生及检测：取脾细胞2×106/孔置于24孔培养板中，用培养液添加为1ml，加入PHA4µg/孔，孵育48小后后离心收集上清。将IL2依赖细胞株CTLL2细胞(日本顺天堂大学奥村康教授惠赠)以无血清RPMI 1640培养液洗涤5次，配成浓度为1×105/ml细胞悬液，取悬液100µl及待测标本上清100µl混于96孔培养板中，孵育42小时后加入噻唑蓝(MTT)10µl/孔，继续培养6小时，然后离心去上清，加入二甲基亚砜100µl，混匀放置30分钟，492nm波长比色测定吸光度用以表示IL2的活性。
4.IL2受体量：采用IL2吸收法[3]进行检测，即取脾细胞4×106加入1ml培养液，再加入人工重组IL2标准品(日本塩野義公司产品)100U孵育。每15分钟收集上清IL2活性，与未经细胞吸收吸收的IL2活性进行比较，按下列公式计算IL2的吸收率，吸收率与细胞膜上的IL2受体量呈正比。
, 百拇医药
表1 各组大鼠体重、血红蛋白、血尿素氮及肌酐的变化(
+s)鼠数
体重
(g)
血红蛋白
(g/dl)
血尿素氮
(mg/dl)
血清肌酐
(mg/dl)
Normal
, 百拇医药
11
274±21
16.2±1.4
24.2±7.6
0.8±0.3
CRF+CS
12
215±35*
15.3±1.3
57.2±6.6*
1.1±0.3
CRF
, 百拇医药
8
241±39*
13.4±0.9*
75.7±1.9*
2.5±0.7*
*与Normal组比较P<0.05
结果
一、各组大鼠存活率的比较
正常对照组区12只大鼠，饲养4个月后存活11只，另1只因意外死亡；CRF组18只大鼠中存活8只(44.4%)；CRF+CS组18只中存活12只(66.7%)。
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二、各组大鼠体重、血红蛋白及血清尿素氮、肌酐的变化(表1)
CRF组体重、血红蛋白水平明显低于正常对照，而血清尿素氮、肌酐则明显高于正常对照给(P均<0.05)。CRF+CS组血尿素氮水平虽也高于正常对照组(P<0.05),但低于CRF组(P<0.05)，血红蛋白及血清肌酐值与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
三、淋巴细胞转化试验
CRF组淋巴细胞转休水平(7 535±965cpm)较正常对照组(25 615±5 441cpm)及CRF+CS组(24 886±5 743cpm)均明显降低(P均<0.01),CRF+CS组淋巴细胞转化水平与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
四、大鼠脾细胞产生IL2的水平
将各组大鼠的脾细胞用PHA刺激后，观察其产生IL2的水平，结果如表2所示。在1/2稀释度上清中，CRF组大鼠脾细胞产生IL2的水平明显低于正常对照组及CRF+CS组(P均<0.05)。在1/4稀释上清中，各组IL2活性无明显差别，但以CRF组IL2活性为最低。
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表2 各组大鼠IL2诱生实验结果(
±s) 组别鼠数
IL2活性(吸光度)
1/2稀释度
1/4稀光度
Normal
11
0.168±0.035
0.117±0.028
CRF+CS
12
, 百拇医药
0.168±0.013
0.124±0.051
CRF
8
0.134±0.030*
0.102±0.021
*与Normal及CRF+CS组比较P<0.05表3 各组大鼠脾细胞对IL2吸收率(
±s) 组别鼠数
IL2吸收率(%)
, http://www.100md.com 1/2稀释度
1/4稀光度
Normal
11
33±13
54±12
CRF+CS
12
34±14
45±73
CRF
8
19±7*
, 百拇医药
24±8*
*与Normal及CRF+CS组比较P<0.01
五、脾细胞IL2受体的表达(表3)
CRF组脾细胞膜上IL2受体量较正常对照组及CRF+CS组均明显下降(P均<0.01)，CRF+CS组脾细胞膜上IL2受体量与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
讨论
CRF的细胞免疫功能缺陷越来越受到人们的重视，寻找有效的药物来调节CRF细胞免疫功能是目前研究的重点之一。我们的前期实验已经证实CRF患者的细胞免疫功能改变主要在于T辅助细胞功能受损，淋巴细胞产和IL2的能力下降，以及IL2受体量减少[4]。针对这一免疫缺陷，我们选择具有增强作用的中药冬虫夏草对CRF动物模型进行实验治疗。对果发现虫草可能提高脾细胞产生IL2的水平，增加脾细胞膜IL2受体的含量，增强淋巴细胞的转化率。体外研究曾证实，虫草可能加强T、B淋巴细胞的增殖，促进脾细胞膜上的IL2受体表达，但不能诱导脾细胞产生IL2[5]。我们的实验证实了虫草在体内还能促使脾细胞产生较高水平的IL2，这可能是由于虫草能促使淋巴细胞的分化增殖，从而使T辅助细胞数增多，产生的较多的IL2。另外，有人发现尿毒症患者严重营养不良往往可导致淋巴细胞转化功能下降，循环T细胞数及T辅助细胞数减少，T抑制细胞增多[6]，从而导致机体免疫能力的低下。虫草在中药中属平补阴阳、保肺益肾的滋补药，药物成份分析发现虫草内含有丰富的必需氨基酸。因此，虫草可能从营养角度上改善了细胞免疫功能的缺陷。
, 百拇医药
临床上曾有人试用虫草治疗CRF，发现虫草可改善CRF患者的贫血状况，降低血清尿素氮及肌酐的水平[2]，我们的实验也证实了这一发现。我们认为，这一方面是由于虫草提高了慢性肾功能不全患者的细胞免疫功能，使CRF患者的机体抵抗力增强，免受感染的侵袭，从而有效地保护了残余的肾功能；另一方面可能是由于虫草可能促进肾小管上皮细胞的增生[7]，保护肾小管的功能，从而进一步保护肾小球功能免遭损害，延缓了慢性肾功能不全的进展。
参考文献
1.王玉润.冬虫夏草合剂治疗3例晚期恶性肿瘤.上海中医药杂志 1979;(5):28.
2.陈以平,等.冬虫夏草为主治疗慢性肾功能衰竭28例初步观察.上海中医药杂志 1984;(2):11.3.
3.匡彦德,等.IL-2吸收试验检测CTLL2细胞和ConA活化小鼠脾细胞的IL-2受体.上海医科大学学报
, 百拇医药
1988;15:259.
4.程庆
,等.终末期肾病透析患者外周血淋巴细胞产生IL-2能力的观察.解放军医学杂志 1990;15:257.5.匡彦德,等.冬虫夏草免疫增强作用机理的研究.上海免疫学杂志 1989;9:6.
6.Dowd PS,et al. The influence of undernutrition on immunity. Clin Sci Mol Med 1984; 66:241.
7.田劲,等.冬虫夏草、大黄及5/6肾切除后血清对大鼠肾小管上皮细胞生长的影响.中西医结合杂志 1991; 11:547.
(1991年5月25日收稿 同年10月7日修回), 百拇医药