绒毛膜促性腺激素受体单克隆抗体的研究
作者：韩守威 彭芝兰 刘珊玲 曹泽毅 陈曼玲
单位：华西医科大学附属第二医院妇产科 韩守威 彭芝兰 刘珊玲 曹泽毅；华西医科大学生化所激素受体室 陈曼玲
关键词：促性腺激素，绒毛膜；受体，内源性物质；抗体，单克隆；卵巢
中华医学杂志920204 摘要 用纯化嗜麦芽假单胞菌的绒毛膜促性腺激素(CG)受体免疫小鼠，融合得到4株单克隆抗体，其中GE590为IgG1，ED490，DG390和AB890为IgG2b.ED490,DG390和AB890与I125-HCG竞争结合实验表明，它们结合该CG受体的不同位点，GE590随其浓度不断增加，能够抑制I125-HCG与受体的结合，提示这两者有结合CG受体上同一位点的机能。该单克隆抗体与人卵巢组织的结合实验表明，在正常卵巢和卵巢肿瘤组织细胞膜上有不同的HCG受体搞原位点存在。
, http://www.100md.com
目前，有关绒毛膜促性腺激素(CG)受体单克隆搞体的研究尚少。我们以嗜麦芽假单胞菌的CG受体为抗原，成功制备了对该抗原的单克隆抗体，并对其某些特性及与人卵巢组织的结合作了初步观察，现报道如下。
材料和方法
1、材料：嗜麦芽假单胞菌CG受体按陈曼玲报道方法制备[1]。RPMI-1640粉由日本进口，I125-HCG由华西医科大学基础同位素室提供。
2、免疫BALB/C小鼠：细菌受体加完全福氏佐剂。于皮下多点注射6-8周龄雌性小鼠，14天后，按spitz方法作脾内直接注射[2]于融合前3天在尾静脉做加强免疫注射。
3、细胞融合及抗体产生：取免疫小鼠脾细胞与SP/O细胞按Galfre方法融合[3]。选择两次ELISA检测强阳性的细胞，用有限稀释法[4]，反复克隆3-4次，直至抗体阳性率大于96%。筛选并克隆后的杂交瘤细胞与SP2/O细胞诱生小鼠腹水。另收集杂交瘤细胞培养上清液。
, 百拇医药
4、单克隆搞体的鉴定：(1)用ELISA检测杂交瘤细胞腹水及培养上清液抗体滴度。(2)免疫结合试验：在用Tris-HCI溶解CG受体测定管内，加入I125-HCG(非特异性管加过量HCG饱和)，30。C慢振荡2小时，每管滴加同一稀释度的腹水清液。4。C过夜后，加豚鼠抗小鼠IgG。最后各管加入0.42%的v球蛋白和7%的聚乙二醇。离心后测沉淀放射性，并按下例公式计算结合率。
以SP2/O细胞诱生小鼠腹水作对照。(3)免疫抑制试验：细菌CG受体加等量不同稀释滴度腹水上清液。4。C静置6小时后加入I125-HCG。以后反应过程同免疫结合试验。并按下式计算抑制率。
, 百拇医药
(4)单克隆抗体亚类鉴定：用正辛酸-硫酸铵初纯后的腹水液与羊抗鼠标准血清作免疫扩散试验，心肝SP2/O细胞产生腹水作对照，观察结果。
5、单克隆搞体与卵巢细胞膜结合：(1)卵巢组织细胞膜的制备：方法参见文献[5]。最终悬液用Trouster方法测定5'-核苷酸樗酶鉴定膜。(2)结果反应：不同组织卵巢细胞膜万分及125I-HCG在康氏试管内混合。振荡孵育后加入同一稀释度的海里水上清液，以后同免疫结合试验，并计算结合率。
结果
1、单克隆抗体滴度测定：融合得到15株阳性克隆细胞的腹水和培养上清液滴度分别在10-2-10-6和1-10-2范围(表1).
表1 HCG受体单克隆抗体滴度
, 百拇医药
单克隆抗体
滴度
腹水上清液
培养上清液
ED490
0.5
10-3
10-1
ED890
0.510-4
10-2
, 百拇医药
AE1190
0.210-3
10-1
DG390
510-4
10-1
CF590
510-5
, 百拇医药
10-1
CE590
1010-5
10-1
BE290
1010-4
10-1
AC890
210-4
, http://www.100md.com
10-1
GD590
1010-6
10-2
AB890
210-5
1
CD590
2.510-6
, http://www.100md.com
210-1
GD690
210-5
210-2
AF690
1010-6
10-1
, 百拇医药
BD890
1010-4
10-1
AD1090
210-5
1
SP2/0
2、单克隆抗体特性：免疫结合试验显示15株单克隆抗体中，ED490、DG390和AB890株能够与细菌CG受体发生特异性结合，其结合率分别为7.9%、10.4%，和8.1%，对照为1.1%以下。免疫抑制试验发现15株中，仅GE590一株随其浓度的增加能一定程度地抑制125I-HCGC与细菌CG受体的结合，使125I-HCG与该受体结合逐渐减少，最大抑制率为48%.其他14株单克隆抗体增加浓度时对125I-HCG与CG受体结合影响不大。
, http://www.100md.com
3、单克隆抗体亚类鉴定：琼脂免疫双扩散试验结果表明，GE590为IgG1，ED490、DG390和AB890为IgG2b。
4、单克隆抗与人卵巢组织细胞膜结合：ED490和GE590与3种不同卵巢组织细胞膜均能发生结合；DG390仅与卵巢粘液性和浆液性囊腺癌组织结合；AB890则主要结合正常卵巢肿瘤组织与卵巢肿瘤组织结合很少。表2 单克隆抗体与不同卵巢组织HCG受体结合率(
)
卵巢组织
n
结合率(%)
ED490
GE590
, 百拇医药
DG390
AB890
正常
4
6.0±3.1
8.0±5.2
0.44±1.0
8.8±8.1
粘液，浆液性腺癌
5
6.0±2.2
12.4±6.7
10.03±8.4
, 百拇医药
4.0±3.2
颗粒细胞瘤
3
7.1±4.8
5.0±4.1
0.91±1.5
2.2±2.1
讨论
1、单克隆抗体对细菌CG受体作用特点：我们以嗜麦芽假单胞的CG受体作为免疫源，用细胞杂交瘤技术制备产生了该受体的单克隆抗体。其中ED490、DG390、AB890和GE590 4株单克隆抗体能与细菌受体发生特异结合。免疫结合试验结果表明，细菌CG受体能同时结合ED490、AB890、DG390、和125I-HCG，提示这类单克隆抗体和HCG可能结合该受体的不同位点，说明两者作用受体抗原决定簇的差异。受体结合抑制试验发现其中一株单克隆抗体GE590，随其浓度的不断增加，引起125I-HCG与CG受体结合逐渐减弱，提示GE590可能与125I-HCG作用于同一受体结合位点或GE590浓度增加可致CG受体空间构象或结构改变。这与Podesta 等观察到的现象相似，由于该CG受体本身特性及制备的单克隆抗体与受体结合结果的非直接性，使得单克隆抗菌素体与CG受体结合或抑制程度均不高。另外，15株单克隆抗体与CG受体结合阳性中，仅供参考株与受体有特民性结合，提示该CG受体还需要进一步纯化。
, 百拇医药
2、单克隆抗体与卵巢组织结合特性：已有研究表明，在人体正常卵巢恶性肿瘤HCG受体含量较正常高2-3倍，提示受体异常可能是肿瘤发生的重要环节。我们用人卵巢组织制备的细胞膜万分与单克隆抗体作结合反应，发现其中ED490和GE590与正常卵巢和卵巢组织细胞膜均能发生结合，DG390仅与卵巢粘液性和浆液性囊腺癌组织结合，AB890则主要结合正常卵巢组织，而与卵巢肿瘤组结合很少，说明在正常卵巢和卵巢肿瘤组织中有不同的HCG受体抗原决定簇存在并且因受体数量及其亲和力的差异，可引起同一种单克隆抗体对不同卵巢组织细胞结合程度上的差别。我们的研究例数较少，还只是初步观察，但已提示用该受体单克隆检测HCG受体抗原不同结构的机能性。
在我们的这项研究工作的基础上，进一步探订人HCG受体单克隆抗体特性及其与许多妇科肿瘤发生发展之间的联系，将为妇科肿瘤新的诊断和治疗提供有价值的实验依据。
参考文献
1、陈曼玲，等.细菌之绒毛膜促性腺激素结合物质之研究。生物化学杂志 1987；3：520.
, 百拇医药
2、Spitz M,et al.Intrasplenic primary immunization for the production of monoclonal antibodies.J Imnunmol Med 1984;70:39
3、Galfre G,et al .Antibodies to major hisocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.Nature 1977;266:550
4、Lefkovitz I,et al.Limiting dilution analysis.In:Lefkovits I,Pernis B ,eds.Immunological Methods.Vol 1.New York:Academic Press,1979:335-370
5、陈曼玲，等.人的正常卵巢及卵巢癌绒毛膜促性腺激素受体的研究。华西医科大学学报。1989；20：369
, 百拇医药
6、Trouster O,et al.Isolation of liver plasma membrance:use of ncleotoed pyrophosphatase and phospodiesterase 1 as marker enzymes.J Cell Biol 1970;40:64
7、Podesta EG,et al.Receptor aggregation induced by antilutropin receptor antibody and biological response in rat testis leydig cells.Proc Natl Acad Sci USA 1983;80:3986
8 、Kammerman S,et al .Gonadotropic hormone binding to human ovarian tumors.Human Pathology 1981;12:886
成都,邮政编码610041, 百拇医药
单位：华西医科大学附属第二医院妇产科 韩守威 彭芝兰 刘珊玲 曹泽毅；华西医科大学生化所激素受体室 陈曼玲
关键词：促性腺激素，绒毛膜；受体，内源性物质；抗体，单克隆；卵巢
中华医学杂志920204 摘要 用纯化嗜麦芽假单胞菌的绒毛膜促性腺激素(CG)受体免疫小鼠，融合得到4株单克隆抗体，其中GE590为IgG1，ED490，DG390和AB890为IgG2b.ED490,DG390和AB890与I125-HCG竞争结合实验表明，它们结合该CG受体的不同位点，GE590随其浓度不断增加，能够抑制I125-HCG与受体的结合，提示这两者有结合CG受体上同一位点的机能。该单克隆抗体与人卵巢组织的结合实验表明，在正常卵巢和卵巢肿瘤组织细胞膜上有不同的HCG受体搞原位点存在。
, http://www.100md.com
目前，有关绒毛膜促性腺激素(CG)受体单克隆搞体的研究尚少。我们以嗜麦芽假单胞菌的CG受体为抗原，成功制备了对该抗原的单克隆抗体，并对其某些特性及与人卵巢组织的结合作了初步观察，现报道如下。
材料和方法
1、材料：嗜麦芽假单胞菌CG受体按陈曼玲报道方法制备[1]。RPMI-1640粉由日本进口，I125-HCG由华西医科大学基础同位素室提供。
2、免疫BALB/C小鼠：细菌受体加完全福氏佐剂。于皮下多点注射6-8周龄雌性小鼠，14天后，按spitz方法作脾内直接注射[2]于融合前3天在尾静脉做加强免疫注射。
3、细胞融合及抗体产生：取免疫小鼠脾细胞与SP/O细胞按Galfre方法融合[3]。选择两次ELISA检测强阳性的细胞，用有限稀释法[4]，反复克隆3-4次，直至抗体阳性率大于96%。筛选并克隆后的杂交瘤细胞与SP2/O细胞诱生小鼠腹水。另收集杂交瘤细胞培养上清液。
, 百拇医药
4、单克隆搞体的鉴定：(1)用ELISA检测杂交瘤细胞腹水及培养上清液抗体滴度。(2)免疫结合试验：在用Tris-HCI溶解CG受体测定管内，加入I125-HCG(非特异性管加过量HCG饱和)，30。C慢振荡2小时，每管滴加同一稀释度的腹水清液。4。C过夜后，加豚鼠抗小鼠IgG。最后各管加入0.42%的v球蛋白和7%的聚乙二醇。离心后测沉淀放射性，并按下例公式计算结合率。
以SP2/O细胞诱生小鼠腹水作对照。(3)免疫抑制试验：细菌CG受体加等量不同稀释滴度腹水上清液。4。C静置6小时后加入I125-HCG。以后反应过程同免疫结合试验。并按下式计算抑制率。
, 百拇医药
(4)单克隆抗体亚类鉴定：用正辛酸-硫酸铵初纯后的腹水液与羊抗鼠标准血清作免疫扩散试验，心肝SP2/O细胞产生腹水作对照，观察结果。
5、单克隆搞体与卵巢细胞膜结合：(1)卵巢组织细胞膜的制备：方法参见文献[5]。最终悬液用Trouster方法测定5'-核苷酸樗酶鉴定膜。(2)结果反应：不同组织卵巢细胞膜万分及125I-HCG在康氏试管内混合。振荡孵育后加入同一稀释度的海里水上清液，以后同免疫结合试验，并计算结合率。
结果
1、单克隆抗体滴度测定：融合得到15株阳性克隆细胞的腹水和培养上清液滴度分别在10-2-10-6和1-10-2范围(表1).
表1 HCG受体单克隆抗体滴度
, 百拇医药
单克隆抗体
滴度
腹水上清液
培养上清液
ED490
0.5
10-310-1
ED890
0.5
10-410-2
, 百拇医药
AE1190
0.2
10-310-1
DG390
5
10-410-1
CF590
5
10-5, 百拇医药
10-1
CE590
10
10-510-1
BE290
10
10-410-1
AC890
2
10-4, http://www.100md.com
10-1
GD590
10
10-610-2
AB890
2
10-51
CD590
2.5
10-6, http://www.100md.com
2
10-1GD690
2
10-52
10-2AF690
10
10-610-1
, 百拇医药
BD890
10
10-410-1
AD1090
2
10-51
SP2/0
2、单克隆抗体特性：免疫结合试验显示15株单克隆抗体中，ED490、DG390和AB890株能够与细菌CG受体发生特异性结合，其结合率分别为7.9%、10.4%，和8.1%，对照为1.1%以下。免疫抑制试验发现15株中，仅GE590一株随其浓度的增加能一定程度地抑制125I-HCGC与细菌CG受体的结合，使125I-HCG与该受体结合逐渐减少，最大抑制率为48%.其他14株单克隆抗体增加浓度时对125I-HCG与CG受体结合影响不大。
, http://www.100md.com
3、单克隆抗体亚类鉴定：琼脂免疫双扩散试验结果表明，GE590为IgG1，ED490、DG390和AB890为IgG2b。
4、单克隆抗与人卵巢组织细胞膜结合：ED490和GE590与3种不同卵巢组织细胞膜均能发生结合；DG390仅与卵巢粘液性和浆液性囊腺癌组织结合；AB890则主要结合正常卵巢肿瘤组织与卵巢肿瘤组织结合很少。表2 单克隆抗体与不同卵巢组织HCG受体结合率(
)卵巢组织
n
结合率(%)
ED490
GE590
, 百拇医药
DG390
AB890
正常
4
6.0±3.1
8.0±5.2
0.44±1.0
8.8±8.1
粘液，浆液性腺癌
5
6.0±2.2
12.4±6.7
10.03±8.4
, 百拇医药
4.0±3.2
颗粒细胞瘤
3
7.1±4.8
5.0±4.1
0.91±1.5
2.2±2.1
讨论
1、单克隆抗体对细菌CG受体作用特点：我们以嗜麦芽假单胞的CG受体作为免疫源，用细胞杂交瘤技术制备产生了该受体的单克隆抗体。其中ED490、DG390、AB890和GE590 4株单克隆抗体能与细菌受体发生特异结合。免疫结合试验结果表明，细菌CG受体能同时结合ED490、AB890、DG390、和125I-HCG，提示这类单克隆抗体和HCG可能结合该受体的不同位点，说明两者作用受体抗原决定簇的差异。受体结合抑制试验发现其中一株单克隆抗体GE590，随其浓度的不断增加，引起125I-HCG与CG受体结合逐渐减弱，提示GE590可能与125I-HCG作用于同一受体结合位点或GE590浓度增加可致CG受体空间构象或结构改变。这与Podesta 等观察到的现象相似，由于该CG受体本身特性及制备的单克隆抗体与受体结合结果的非直接性，使得单克隆抗菌素体与CG受体结合或抑制程度均不高。另外，15株单克隆抗体与CG受体结合阳性中，仅供参考株与受体有特民性结合，提示该CG受体还需要进一步纯化。
, 百拇医药
2、单克隆抗体与卵巢组织结合特性：已有研究表明，在人体正常卵巢恶性肿瘤HCG受体含量较正常高2-3倍，提示受体异常可能是肿瘤发生的重要环节。我们用人卵巢组织制备的细胞膜万分与单克隆抗体作结合反应，发现其中ED490和GE590与正常卵巢和卵巢组织细胞膜均能发生结合，DG390仅与卵巢粘液性和浆液性囊腺癌组织结合，AB890则主要结合正常卵巢组织，而与卵巢肿瘤组结合很少，说明在正常卵巢和卵巢肿瘤组织中有不同的HCG受体抗原决定簇存在并且因受体数量及其亲和力的差异，可引起同一种单克隆抗体对不同卵巢组织细胞结合程度上的差别。我们的研究例数较少，还只是初步观察，但已提示用该受体单克隆检测HCG受体抗原不同结构的机能性。
在我们的这项研究工作的基础上，进一步探订人HCG受体单克隆抗体特性及其与许多妇科肿瘤发生发展之间的联系，将为妇科肿瘤新的诊断和治疗提供有价值的实验依据。
参考文献
1、陈曼玲，等.细菌之绒毛膜促性腺激素结合物质之研究。生物化学杂志 1987；3：520.
, 百拇医药
2、Spitz M,et al.Intrasplenic primary immunization for the production of monoclonal antibodies.J Imnunmol Med 1984;70:39
3、Galfre G,et al .Antibodies to major hisocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.Nature 1977;266:550
4、Lefkovitz I,et al.Limiting dilution analysis.In:Lefkovits I,Pernis B ,eds.Immunological Methods.Vol 1.New York:Academic Press,1979:335-370
5、陈曼玲，等.人的正常卵巢及卵巢癌绒毛膜促性腺激素受体的研究。华西医科大学学报。1989；20：369
, 百拇医药
6、Trouster O,et al.Isolation of liver plasma membrance:use of ncleotoed pyrophosphatase and phospodiesterase 1 as marker enzymes.J Cell Biol 1970;40:64
7、Podesta EG,et al.Receptor aggregation induced by antilutropin receptor antibody and biological response in rat testis leydig cells.Proc Natl Acad Sci USA 1983;80:3986
8 、Kammerman S,et al .Gonadotropic hormone binding to human ovarian tumors.Human Pathology 1981;12:886
成都,邮政编码610041, 百拇医药