血小板特异性同种抗原在中国汉族人中的表达
作者：晓东 蒋惠源 李佩霞 储小红 王晓东 阮长耿 吴强 叶德华 陈昌年 蒋国新 曹小泉 徐惠新 程根林 潘志荣
单位：江苏省血液研究所 奚晓东 蒋惠源 李佩霞；苏州医学院血栓与止血研究室* 储小红 王晓东 阮长耿；常州市红十字中心血站 吴强 叶德华 陈昌年 蒋国新；苏州市红十字中心血站 曹小泉 徐惠新 程根林 潘志荣
关键词：
中华医学杂志920213 80年代以来，一些新的血小板特异性同种抗原(简称血小板特异抗原)相继被鉴定。对血小板特异抗原的分子定位和精确结构等也有了进一步的认识[1]，并发现不同人种(群)的血小板特异抗原表达频率不尽相同。本文旨在探讨中国汉族人血小板特异抗原的表达及其病理意义。
一.材料与方法
1.定型抗血清:PLA1由美国东南威斯康星血液中心T.Kunicki博士提供;PLA2由美国明尼苏达大学D.Christie博士提供;Baka和BaKb由T.Kunicki博士及荷兰红十字输血中心R.A.W.M.Kuijpers博士提供,Yuka,YukbNaka由日本血小板血清学参比实验室柴田洋一博士提供;Bra和Brb由日本信州大学附属病院降旗谦一博士提供;Siba由日本京都红十字血液中心佐治博士提供.抗体效价在间接酶联免疫试验中为1:100至1:1000.
, 百拇医药
2.检测对象:苏州及常州地区健康供血员.静脉取血2%EDTA1:9抗凝。
3.测定方法:(1)间接酶联免疫法:经20%氯喹处理的待测血小板加入55孔聚苯乙稀塑料板,每孔2.5×106,置4℃中4-5小时后以1%多聚甲醛固定。洗涤后加入20%小牛血清适当稀释的定型抗血清,0.1ml/孔,37℃温育1小时后洗涤3次.加0.1ml用20%小牛血清稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG,37℃温育1小时后洗涤6次.加底物邻苯二胺(OPD)显色后测定吸光度492nm.本文部分结果采用固相血小板免疫血清学试验(SPISA)测得,但血小板在包被前亦经氯喹处理.(2)单克隆抗体俘获抗原酶联免疫法:抗血小板糖蛋白(GP)II6(SZ-22)和GPIIa(SZ-21)单克隆抗体用0.1mol/L,pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至5ug/ml,加入55孔板(0.1ml/孔),4℃过夜后洗涤3次,加0.1ml0.3%BSA(牛血清白蛋白)37℃2小时.洗涤后加入血小板溶解液(109/ml洗涤待测血小板加Nonidet P-40(NP-40)至终浓度为1%,置4℃1小时,10000r/min离心20分钟取上清,用时以0.3%BSA,0.5%NP-401:5稀释)0.1ml/孔,4℃过夜,0.5%NP-40洗两次后加待测血清,以后加酶联抗体等步骤同间接酶联免疫法。
, 百拇医药
4.判别阈值设定:随机测定一批正常血清,测得吸光度值取
2s作为阈值.同时将该批血清混合作为阴性对照.并将此值作为以后测定时对照血清吸光度值的基准。
二.结果
1.表型鉴定:由于掌握的抗血清量及其效价的不同而致血清用量不一,因此本研究中各种抗血清测定的个体数不同,从141人到1977人不等.各表型频率如附表所示,其中PLA1和YUKb未发现阴性个体。
附表 主要的血小板特异性同种抗原在中国汉族人中的表达
抗原
测定人数
表型频率%
, http://www.100md.com
基因频率
PLA1
1977
>99.99
>0.999
PLA2
1977
<0.15
<0.001
Siba(Koa)
151
19.21
, http://www.100md.com
0.101
Baka
1268
78.54
0.531
Bakb
1268
71.85
0.463
Yuka
1760
<0.17
, 百拇医药
<0.001
Yukb
1760
>99.99
>0.999
Bra
141
17.73
0.084
Brb
141
99.29
, http://www.100md.com
0.907
Naka
669
85.65
0.621
2.基因频率:根据双等位基因共显性遗传模式的假设计算,Siba和Naka因仅能测定一种表型,其基因频率亦在上述假设下依据Hardy-Weinberg定律计算.各基因频率见附表。
3.单克隆抗体俘获抗原酶联免疫法：用我们拥有的抗GPIIb和GPIIa的单克隆抗体对定位于GPIIb和GPIIa的血小板特异抗原PLA1,Baka/b和Yukb的测定结果显示：SZ-21和SZ-22能较好地俘获PLA1抗原但俘获Bak抗原较差，而Yukb，抗原则完全不能检出(附图)。
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注：1为PLA1；2为PLA3；3为Baka;4为Bak6;5为Yuka;6为Yukb;7为对照血清。a.b.c.为同一个体的结果，表型为PLA1，Baka/b,Yukb。其中a为间接法结果；b为单抗SZ-21俘获抗原结果；c为单抗SZ-22俘获抗原结果
附图，单抗俘获抗原法和间接法酶联免疫反应结果比较
三.讨论
由于血小板同种免疫反应除血小板特异抗原参与外,组织相容性抗原(HLA)等共同抗原也常介入。为避免HLA系统对测定的干扰,目前趋于采用氯喹处理法及单抗俘获抗原法[3]。由Newman等[4，5]报道的基因分型法目前已能区分PLA1；PLA2及Baka;Bakb表型，但尚难推广。本组结果显示单抗俘获抗原法能明显减少非特异反应，有利于表型的判别。
, http://www.100md.com
血小板特异抗原的遗传模式均为常染色体显性，其中绝大部分已被证实为双等位基因共显控制。在特定的人种或人群中，一些主要的血小板特异抗原的表达频率及其病理意义不尽相同。本研究中测定的个体均为从供血员中随机选择，应能反映人群特征。我们将本组数据与国外的报道对照后发现中国人PLA，Bak表型频率与白种人有明显差异；而与同为蒙古人种的日本人一致，其中PLA1表型频率高是显著特点，在日本人群(2600人)[6]和我们的调查中均未发现阴性个体。鉴于中国人PLA2和Yuka表达频率极低，因此，在中国人群中该两种抗原系统导致同种免疫病理反应的可能性应分别低于白种人和日本人。
参考文献
1.奚晓东(综述).血小板特异性同种抗原研究的近况.国外医学输血与血液学分册1990;13:356
2.吴国光,等.固相血小板免疫血清学试验的研究和应用.中华血液学杂志1988;9:258
, 百拇医药
3.Metcalf P,Waters AH.Report on the fourth ISBT/ICSH platelet serology workshop (London).Vox Sang 1990;58:170
4.Newman PJ et ,al.The human platelet alloantigens,PLA1andPLA2,are associated with a leucin33/prolin33 amino acid polymorphism in membrane glycoprotein IIIa and are distinguishable by DNA typing .J Chin Invest 1989;83:1778
5.Lyman S,et al.Polymorphism of human platelet mewbrane glycorotein IIb associated with the Baka/Bakb alloantigen system..Blood 1990;75:2343
6.Saji H,et al .New platelet antigen ,Siba,involved in platelet transfusion refractoriness in a Japanese man.Vox Sang 1989;56:283.
*邮政编码 215007, http://www.100md.com
单位：江苏省血液研究所 奚晓东 蒋惠源 李佩霞；苏州医学院血栓与止血研究室* 储小红 王晓东 阮长耿；常州市红十字中心血站 吴强 叶德华 陈昌年 蒋国新；苏州市红十字中心血站 曹小泉 徐惠新 程根林 潘志荣
关键词：
中华医学杂志920213 80年代以来，一些新的血小板特异性同种抗原(简称血小板特异抗原)相继被鉴定。对血小板特异抗原的分子定位和精确结构等也有了进一步的认识[1]，并发现不同人种(群)的血小板特异抗原表达频率不尽相同。本文旨在探讨中国汉族人血小板特异抗原的表达及其病理意义。
一.材料与方法
1.定型抗血清:PLA1由美国东南威斯康星血液中心T.Kunicki博士提供;PLA2由美国明尼苏达大学D.Christie博士提供;Baka和BaKb由T.Kunicki博士及荷兰红十字输血中心R.A.W.M.Kuijpers博士提供,Yuka,YukbNaka由日本血小板血清学参比实验室柴田洋一博士提供;Bra和Brb由日本信州大学附属病院降旗谦一博士提供;Siba由日本京都红十字血液中心佐治博士提供.抗体效价在间接酶联免疫试验中为1:100至1:1000.
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2.检测对象:苏州及常州地区健康供血员.静脉取血2%EDTA1:9抗凝。
3.测定方法:(1)间接酶联免疫法:经20%氯喹处理的待测血小板加入55孔聚苯乙稀塑料板,每孔2.5×106,置4℃中4-5小时后以1%多聚甲醛固定。洗涤后加入20%小牛血清适当稀释的定型抗血清,0.1ml/孔,37℃温育1小时后洗涤3次.加0.1ml用20%小牛血清稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG,37℃温育1小时后洗涤6次.加底物邻苯二胺(OPD)显色后测定吸光度492nm.本文部分结果采用固相血小板免疫血清学试验(SPISA)测得,但血小板在包被前亦经氯喹处理.(2)单克隆抗体俘获抗原酶联免疫法:抗血小板糖蛋白(GP)II6(SZ-22)和GPIIa(SZ-21)单克隆抗体用0.1mol/L,pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至5ug/ml,加入55孔板(0.1ml/孔),4℃过夜后洗涤3次,加0.1ml0.3%BSA(牛血清白蛋白)37℃2小时.洗涤后加入血小板溶解液(109/ml洗涤待测血小板加Nonidet P-40(NP-40)至终浓度为1%,置4℃1小时,10000r/min离心20分钟取上清,用时以0.3%BSA,0.5%NP-401:5稀释)0.1ml/孔,4℃过夜,0.5%NP-40洗两次后加待测血清,以后加酶联抗体等步骤同间接酶联免疫法。
, 百拇医药
4.判别阈值设定:随机测定一批正常血清,测得吸光度值取
2s作为阈值.同时将该批血清混合作为阴性对照.并将此值作为以后测定时对照血清吸光度值的基准。二.结果
1.表型鉴定:由于掌握的抗血清量及其效价的不同而致血清用量不一,因此本研究中各种抗血清测定的个体数不同,从141人到1977人不等.各表型频率如附表所示,其中PLA1和YUKb未发现阴性个体。
附表 主要的血小板特异性同种抗原在中国汉族人中的表达
抗原
测定人数
表型频率%
, http://www.100md.com
基因频率
PLA1
1977
>99.99
>0.999
PLA2
1977
<0.15
<0.001
Siba(Koa)
151
19.21
, http://www.100md.com
0.101
Baka
1268
78.54
0.531
Bakb
1268
71.85
0.463
Yuka
1760
<0.17
, 百拇医药
<0.001
Yukb
1760
>99.99
>0.999
Bra
141
17.73
0.084
Brb
141
99.29
, http://www.100md.com
0.907
Naka
669
85.65
0.621
2.基因频率:根据双等位基因共显性遗传模式的假设计算,Siba和Naka因仅能测定一种表型,其基因频率亦在上述假设下依据Hardy-Weinberg定律计算.各基因频率见附表。
3.单克隆抗体俘获抗原酶联免疫法：用我们拥有的抗GPIIb和GPIIa的单克隆抗体对定位于GPIIb和GPIIa的血小板特异抗原PLA1,Baka/b和Yukb的测定结果显示：SZ-21和SZ-22能较好地俘获PLA1抗原但俘获Bak抗原较差，而Yukb，抗原则完全不能检出(附图)。
, http://www.100md.com
注：1为PLA1；2为PLA3；3为Baka;4为Bak6;5为Yuka;6为Yukb;7为对照血清。a.b.c.为同一个体的结果，表型为PLA1，Baka/b,Yukb。其中a为间接法结果；b为单抗SZ-21俘获抗原结果；c为单抗SZ-22俘获抗原结果
附图，单抗俘获抗原法和间接法酶联免疫反应结果比较
三.讨论
由于血小板同种免疫反应除血小板特异抗原参与外,组织相容性抗原(HLA)等共同抗原也常介入。为避免HLA系统对测定的干扰,目前趋于采用氯喹处理法及单抗俘获抗原法[3]。由Newman等[4，5]报道的基因分型法目前已能区分PLA1；PLA2及Baka;Bakb表型，但尚难推广。本组结果显示单抗俘获抗原法能明显减少非特异反应，有利于表型的判别。
, http://www.100md.com
血小板特异抗原的遗传模式均为常染色体显性，其中绝大部分已被证实为双等位基因共显控制。在特定的人种或人群中，一些主要的血小板特异抗原的表达频率及其病理意义不尽相同。本研究中测定的个体均为从供血员中随机选择，应能反映人群特征。我们将本组数据与国外的报道对照后发现中国人PLA，Bak表型频率与白种人有明显差异；而与同为蒙古人种的日本人一致，其中PLA1表型频率高是显著特点，在日本人群(2600人)[6]和我们的调查中均未发现阴性个体。鉴于中国人PLA2和Yuka表达频率极低，因此，在中国人群中该两种抗原系统导致同种免疫病理反应的可能性应分别低于白种人和日本人。
参考文献
1.奚晓东(综述).血小板特异性同种抗原研究的近况.国外医学输血与血液学分册1990;13:356
2.吴国光,等.固相血小板免疫血清学试验的研究和应用.中华血液学杂志1988;9:258
, 百拇医药
3.Metcalf P,Waters AH.Report on the fourth ISBT/ICSH platelet serology workshop (London).Vox Sang 1990;58:170
4.Newman PJ et ,al.The human platelet alloantigens,PLA1andPLA2,are associated with a leucin33/prolin33 amino acid polymorphism in membrane glycoprotein IIIa and are distinguishable by DNA typing .J Chin Invest 1989;83:1778
5.Lyman S,et al.Polymorphism of human platelet mewbrane glycorotein IIb associated with the Baka/Bakb alloantigen system..Blood 1990;75:2343
6.Saji H,et al .New platelet antigen ,Siba,involved in platelet transfusion refractoriness in a Japanese man.Vox Sang 1989;56:283.
*邮政编码 215007, http://www.100md.com