硬脂酸、苹婆酸对体外培养大鼠肝癌细胞生长的抑制作用
作者：黄晓峰 苏慧慈 补永安
单位：(第四军医大学组织胚胎学教研室，710032)
关键词：
中华医学杂志920416
我们以大鼠正常成纤维细胞作对照，测定了硬脂酸、苹婆酸对培养大鼠肝癌细胞生长的抑制作用。现报道如下。
一、材料与方法
1、主要试剂及配制：(1)硬脂酸：Sigma公司产品。临用前用无水乙醇配制成浓度为4mg/ml的储存液，然后在培养基中进一步稀释，使最终乙醇浓度不超过0.5%。(2)苹婆酸：Sigma公司产品。临用前用培养液配成8mmol/L的储存液，在培养基中进一步稀释到所需浓度。(3)四甲基偶氮唑盐(MTT)：Sigma公司产品，用PBS配成5mg/ml的储存液，经0.45μm滤膜滤过后于4℃避光保存。临用时用预温培养液稀释为2mg/ml的工作液。
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2、细胞系和细胞培养：FSK-7902细胞系是我室建立的分化程度较低的肝癌细胞株[1]。正常成纤维细胞来自胚胎肺组织。细胞培养和传代按文献[1]方法进行。两组细胞均不需胰蛋白酶消化。
3、细胞生长抑制的测定：(1)MTT试验：按Mosmann[2]法进行。将传代后呈指数生长的细胞，制成单细胞悬液，以每孔100μl，1.5×105个细胞的密度种植于96孔板，周边各孔不加细胞作空白对照，生存对照组仅加细胞和培养液，设硬脂酸、苹婆酸及硬脂酸+苹婆酸3个组。培养板在37℃，5%CO2，95%湿度的CO2孵箱中培养24小时后，各孔分别加入硬脂酸、苹婆酸或培养液，使其达到实验设计要求。生存对照孔仅加100μl含1%乙醇的培养液。继续培养7天后，每孔加入MTT工作液50μl。继续培养4小时后，吸出孔内液体。每孔加入二甲亚砜150μl，振荡5分钟，以空白对照孔调零后，在DG3022型酶联免疫检测仪570nm处读取各孔光密度。细胞生长抑制率=(1-A/B)×100%，A表示处理组各孔平均光密度，B为生存对照组各孔平均光密度。每种处理设4孔，实验重复3次。(2)细胞计数：按MTT试验显示明显抑制作用的3组设置处理组，对照组仅加细胞和培养液。每一处理设置12瓶，于处理后第2、4、6天加入硬脂酸、苹婆酸或它们的混合物，每一处理及对照各取4瓶，吹打后在血球计数盘上计数，重复4次取其均值。
, 百拇医药
4、统计学处理：用配对t检验。
二、结果
1、MTT试验：见表1。另外，同样浓度的硬脂酸、苹婆酸及其两者组合，对培养大鼠正常成纤维细胞无明显抑制作用，P>0.05。
表1 MTT试验结果(
) 处理及浓度
光密度
抑制率(%)
硬脂酸(μg/ml)
40
0.24±0.01
, http://www.100md.com 35.1*
20
0.17±0.06
54.1**
10
0.12±0.01
67.6***
5
0.21±0.06
43.2*
2.5
0.21±0.06
, 百拇医药
43.2*
苹婆酸(μmol/L)
400
0.18±0.06
51.4**
200
0.19±0.12
48.6*
100
0.21±0.08
43.2*
, 百拇医药
50
0.22±0.16
40.5*
40
0.23±0.13
37.8*
20
0.30±0.07
18.9*
硬脂酸+苹婆酸
20+400
0.08±0.02
, http://www.100md.com
78.3***△
20+200
0.13±0.07
64.9***
20+100
0.14±0.04
62.2**
10+400
0.07±0.03
81.1***△
10+200
, 百拇医药
0.13±0.06
64.9***
10+100
0.15±0.03
69.5***
对照(细胞+培养液)
0.37±0.02
注：与对照相比，* P>0.05，**P<0.05，*** P<0.01；
△与单用硬脂酸(20μg/ml)或单用苹婆酸(400μmol/L)相比，P<0.05；△△与单用苹婆酸(400μmol/L)相比，P<0.05
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2、细胞计数：见表2。
表2 细胞计数结果(，×104/ml) 处理及浓度
0天
第2天
第4天
第6天
硬脂酸(μg/ml)
20
1.67±0.12
2.19±0.24*
, 百拇医药
4.06±0.24***
7.75±0.29***
10
1.67±0.12
2.81±0.24*
3.63±0.32***
8.81±0.24***
苹婆酸(μmol/L)
400
1.67±0.12
, 百拇医药
2.00±0.20**
7.63±0.32***
11.56±0.43***
硬脂酸+苹婆酸
20+400
1.67±0.12
2.06±0.24**
3.81±0.24***△
3.88±0.32***△，△△
10+400
, 百拇医药
1.67±0.12
2.88±0.32*
3.44±0.24***△
4.38±0.60***△，△△
对照(细胞+培养液)
1.67±0.12
3.06±0.43
10.38±0.32
24.88±0.99
注：与对照组相比，* P>0.05，** P<0.01，*** P<0.001；
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△ 与苹婆酸组相比，P<0.001；△△ 与硬脂酸组相比，P<0.001
三、讨论
本实验显示硬脂酸在20μg/ml和10μg/ml时，对培养的大鼠肝癌细胞生长有明显抑制作用。这与国外学者的报道相同[3，4]。本实验结果还证明苹婆酸在400μmol/L时，对癌细胞生长有显著抑制作用。硬脂酸可非特异性掺入细胞膜磷脂，增加膜磷脂中硬脂酸含量。苹婆酸则抑制△-9-去饱和酶的活性，减少膜脂中油酸形成。两者通过不同途径使膜磷脂中硬脂酸和油酸比率增加，促使膜脂构成向正常转化，从而导致膜刚性增强，细胞代谢降低，增殖受到抑制。当两者联合应用时，通过不同途径而出现协同效应。
参考文献
1 龚民族，大白鼠肝癌细胞株FSK-7901、FSK-7902的建立和特点，解剖学报，1981；12：299。
, 百拇医药
2 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: assessment of radiosensitivity. J Immunol Method 1983;65:55.
3 Wicha MS, et al. Effects of unsaturated fatty acids on the growth of normal and neoplastic mammary epithelial cells. Cancer Res 1979;39:426.
4 Rose DP, Connolly LM. Effects of fatty acids and inhibitors of eicosanoid synthesis on the growth of a human breast cancer cell line in culture. Cancer Res 1990;50:7139., 百拇医药
单位：(第四军医大学组织胚胎学教研室，710032)
关键词：
中华医学杂志920416
我们以大鼠正常成纤维细胞作对照，测定了硬脂酸、苹婆酸对培养大鼠肝癌细胞生长的抑制作用。现报道如下。
一、材料与方法
1、主要试剂及配制：(1)硬脂酸：Sigma公司产品。临用前用无水乙醇配制成浓度为4mg/ml的储存液，然后在培养基中进一步稀释，使最终乙醇浓度不超过0.5%。(2)苹婆酸：Sigma公司产品。临用前用培养液配成8mmol/L的储存液，在培养基中进一步稀释到所需浓度。(3)四甲基偶氮唑盐(MTT)：Sigma公司产品，用PBS配成5mg/ml的储存液，经0.45μm滤膜滤过后于4℃避光保存。临用时用预温培养液稀释为2mg/ml的工作液。
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2、细胞系和细胞培养：FSK-7902细胞系是我室建立的分化程度较低的肝癌细胞株[1]。正常成纤维细胞来自胚胎肺组织。细胞培养和传代按文献[1]方法进行。两组细胞均不需胰蛋白酶消化。
3、细胞生长抑制的测定：(1)MTT试验：按Mosmann[2]法进行。将传代后呈指数生长的细胞，制成单细胞悬液，以每孔100μl，1.5×105个细胞的密度种植于96孔板，周边各孔不加细胞作空白对照，生存对照组仅加细胞和培养液，设硬脂酸、苹婆酸及硬脂酸+苹婆酸3个组。培养板在37℃，5%CO2，95%湿度的CO2孵箱中培养24小时后，各孔分别加入硬脂酸、苹婆酸或培养液，使其达到实验设计要求。生存对照孔仅加100μl含1%乙醇的培养液。继续培养7天后，每孔加入MTT工作液50μl。继续培养4小时后，吸出孔内液体。每孔加入二甲亚砜150μl，振荡5分钟，以空白对照孔调零后，在DG3022型酶联免疫检测仪570nm处读取各孔光密度。细胞生长抑制率=(1-A/B)×100%，A表示处理组各孔平均光密度，B为生存对照组各孔平均光密度。每种处理设4孔，实验重复3次。(2)细胞计数：按MTT试验显示明显抑制作用的3组设置处理组，对照组仅加细胞和培养液。每一处理设置12瓶，于处理后第2、4、6天加入硬脂酸、苹婆酸或它们的混合物，每一处理及对照各取4瓶，吹打后在血球计数盘上计数，重复4次取其均值。
, 百拇医药
4、统计学处理：用配对t检验。
二、结果
1、MTT试验：见表1。另外，同样浓度的硬脂酸、苹婆酸及其两者组合，对培养大鼠正常成纤维细胞无明显抑制作用，P>0.05。
表1 MTT试验结果(
) 处理及浓度光密度
抑制率(%)
硬脂酸(μg/ml)
40
0.24±0.01
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20
0.17±0.06
54.1**
10
0.12±0.01
67.6***
5
0.21±0.06
43.2*
2.5
0.21±0.06
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43.2*
苹婆酸(μmol/L)
400
0.18±0.06
51.4**
200
0.19±0.12
48.6*
100
0.21±0.08
43.2*
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50
0.22±0.16
40.5*
40
0.23±0.13
37.8*
20
0.30±0.07
18.9*
硬脂酸+苹婆酸
20+400
0.08±0.02
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78.3***△
20+200
0.13±0.07
64.9***
20+100
0.14±0.04
62.2**
10+400
0.07±0.03
81.1***△
10+200
, 百拇医药
0.13±0.06
64.9***
10+100
0.15±0.03
69.5***
对照(细胞+培养液)
0.37±0.02
注：与对照相比，* P>0.05，**P<0.05，*** P<0.01；
△与单用硬脂酸(20μg/ml)或单用苹婆酸(400μmol/L)相比，P<0.05；△△与单用苹婆酸(400μmol/L)相比，P<0.05
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2、细胞计数：见表2。
表2 细胞计数结果(
，×104/ml) 处理及浓度0天
第2天
第4天
第6天
硬脂酸(μg/ml)
20
1.67±0.12
2.19±0.24*
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4.06±0.24***
7.75±0.29***
10
1.67±0.12
2.81±0.24*
3.63±0.32***
8.81±0.24***
苹婆酸(μmol/L)
400
1.67±0.12
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2.00±0.20**
7.63±0.32***
11.56±0.43***
硬脂酸+苹婆酸
20+400
1.67±0.12
2.06±0.24**
3.81±0.24***△
3.88±0.32***△，△△
10+400
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1.67±0.12
2.88±0.32*
3.44±0.24***△
4.38±0.60***△，△△
对照(细胞+培养液)
1.67±0.12
3.06±0.43
10.38±0.32
24.88±0.99
注：与对照组相比，* P>0.05，** P<0.01，*** P<0.001；
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△ 与苹婆酸组相比，P<0.001；△△ 与硬脂酸组相比，P<0.001
三、讨论
本实验显示硬脂酸在20μg/ml和10μg/ml时，对培养的大鼠肝癌细胞生长有明显抑制作用。这与国外学者的报道相同[3，4]。本实验结果还证明苹婆酸在400μmol/L时，对癌细胞生长有显著抑制作用。硬脂酸可非特异性掺入细胞膜磷脂，增加膜磷脂中硬脂酸含量。苹婆酸则抑制△-9-去饱和酶的活性，减少膜脂中油酸形成。两者通过不同途径使膜磷脂中硬脂酸和油酸比率增加，促使膜脂构成向正常转化，从而导致膜刚性增强，细胞代谢降低，增殖受到抑制。当两者联合应用时，通过不同途径而出现协同效应。
参考文献
1 龚民族，大白鼠肝癌细胞株FSK-7901、FSK-7902的建立和特点，解剖学报，1981；12：299。
, 百拇医药
2 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: assessment of radiosensitivity. J Immunol Method 1983;65:55.
3 Wicha MS, et al. Effects of unsaturated fatty acids on the growth of normal and neoplastic mammary epithelial cells. Cancer Res 1979;39:426.
4 Rose DP, Connolly LM. Effects of fatty acids and inhibitors of eicosanoid synthesis on the growth of a human breast cancer cell line in culture. Cancer Res 1990;50:7139., 百拇医药