乙型肝炎病毒X蛋白在原发性肝癌组织的表达
作者：陈良标 王桂林 吴霞 李亚非 曹希贤 MA Feitelson 丛锦文 赵印 孟欣
单位：(北京部队总医院全军肝病研究所，100700)陈良标 王桂林 吴霞 李亚非 曹希贤；(美国费城Fox Chase癌中心)MA Feitelson；(河北开滦矿务局医院)丛锦文 赵印；(北京市右安医院)孟欣
关键词：乙型肝炎病毒；X蛋白；肝细胞瘤；胆管肿瘤
中华医学杂志920409
摘要 应用PAP免疫组化技术和抗乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白抗血清检查34例肝癌患者的癌及非癌肝组织，癌细胞的X蛋白阳性率94.1%，其中27例原发性肝癌伴肝硬化，其肝细胞X蛋白阳性率92.6%，并发现癌周几乎所有肝细胞都显示X蛋白强阳性。58例慢性活动性肝炎肝活检标本X蛋白阳性率17.2%，肝癌及肝硬化组织X蛋白高频率及优势表达，显示它对肝癌发生或肝细胞癌化可能起重要作用。本研究发现19例(59.4%)原发性肝癌患者肝及癌组织间胆管上皮细胞X蛋白阳性，6例合并胆管癌，癌细胞显示X蛋白阳性，因此，胆管癌发生是否与HBV X蛋白存在有关值得探讨。
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乙型肝炎病毒(HBV)感染者发生原发性肝癌(HCC)比非感染者为高，80%～90%的HCC患者肝细胞均有HBV DNA整合，但HBV致癌机理仍不清楚[1～3]。近年来，HBV致癌研究的注意力集中在X基因及其编码的X蛋白上，有关报道[4～9]逐渐增多。我们采用敏感的PAP免疫组化技术，对手术及尸解患者的肝癌组织进行了检查，并与慢性活动性肝炎(CAH)患者肝穿组织检查进行了比较，试图了解X蛋白在HCC形成和发展中的作用。
材料和方法
HCC患者癌组织标本34例，其中手术取材23例，尸解标本11例。经临床物理和生化检查，手术或尸解组织的病理学诊断均为HCC，其中27例伴有肝硬化，6例合并胆管癌。58例CAH患者肝穿组织经病理学诊断证实和血清学检查HBsAg阳性。免疫组化染色按常规PAP方法进行，所用试剂购自北京生物制品研究所。兔抗X蛋白血清(兔抗-X99，X100和XX101多克隆抗血清)为美国费城Fox Chase癌研究中心提供。该血清系用长度分别为100～114、115～131和10～29残基X蛋白合成肽免疫健康正常新西兰家兔而制备出来的。用时根据抗体效价作适当稀释后混合使用。对照试验以正常兔血清取代兔抗X蛋白血清进行。
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结 果
应用PAP技术检查34例HCC，32例X蛋白免疫酶染色阳性，阳性率94.1%(附表)。阳性反应产物为棕黄色颗粒，多见弥漫性分布。癌细胞内X蛋白主要存在于胞核(图1，2)或胞核和胞质同时存在，仅胞质阳性者较少，且多为弱阳性染色(图3)。癌周肝细胞胞质和胞核经常同时显示X蛋白阳性(图1)，仅胞质或胞核阳性者较少。癌组织X蛋白阳性率稍高于癌周组织，但大多数病例癌周组织内X蛋白阳性细胞(肝细胞)数量及它们的染色强度均显著高于癌组织。上述病例中癌组织阳性而癌周组织阴性者3例，癌周组织X蛋白阳性而癌组织阴性者1例，其余均为癌及癌周组织同时阳性。在27例HCC伴有肝硬化标本中，25例肝细胞X蛋白阳性(阳性率92.6%)。肝硬化组织内肝细胞X蛋白主要存在于胞核内(图2)，而紧邻癌组织的肝细胞(图1)或癌组织间残留的几乎所有肝细胞胞质(图4，5)均显示X蛋白强阳性反应，部分或少数胞核阳性。
附表 34例HCC患者癌及癌周组织内X蛋白分布 细胞种类
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阳性例数(%)
胞质
胞核
胞质、胞核
合计
癌细胞
8(23.5)
13(38.2)
11(34.4)
32(94.1)
癌周肝细胞
5(14.7)
6(17.7)
, 百拇医药
16(50.0)
27(84.4)
胆管上皮细胞
0(0.0)
19(59.4)
0(0.0)
19(59.4)
注：34例HCC中2例未见到癌周肝组织及胆管上皮
检查中还发现32例HCC中19例(59.4%)癌组织周围和/或癌周肝组织间胆管上皮细胞显示X蛋白阳性，阳性产物均定位于胞核(图6)，每一胆管X蛋白阳性细胞核数量不一，部分胆管上皮细胞核多数呈阳性反应。34例HCC中6例合并胆管癌，其中4例胆管癌细胞胞核X蛋白阳性。
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58例CAH患者肝组织标本中10例(17.2%)肝细胞胞质X蛋白阳性，其中1例伴胞核阳性，阳性染色强度一般较弱，阳性细胞数量较少。部分HCC标本，分别以兔抗X99和X101抗体进行检查，染色结果无差别。所设置的对照试验均显示X蛋白染色阴性。
讨 论
研究表明，80%～90%有HBV感染的HCC患者的肝癌细胞和HBsAg阳性肝癌细胞系均有HBV DNA整合，HCC中HBV X基因整合频率最高，因而认为，X基因整合与HBV致癌关系最为密切[1，2]。 Moriarty等[3]曾报道抗X蛋白抗体主要存在于HCC患者血清中，认为它可能是HCC标志。本组患者标本切片来自几个单位，未做HBV其它标志的免疫组化检查，但一般认为，X蛋白是HBV感染标志之一，并与HBV复制有密切关系[10，11]，故可认为本组大多数肝癌病例与HBV感染有关。Feitelson等研究结果为肝硬化患者肝组织X蛋白阳性率97%，肝癌组织57%和癌周组织80%，故他们认为肝病的发展可能与HBV X蛋白在肝硬化和肝癌组织内的高度持续表达有关。本组34例HCC患者癌组织HBV X蛋白的阳性率高达94.1%，其中27例HCC伴有肝硬化的肝细胞X蛋白阳性率为92.6%，而CAH患者仅17.2%。X蛋白在肝硬化，特别是肝癌组织内的高度表达表明，它可能与HCC发生发展和肝硬化转化为HCC有密切关系。X蛋白在肝癌组织和癌周肝组织内存在的特点值得注意。虽然大多数病例(85.3%)癌组织和癌周组织X蛋白同时显示阳性，而且癌组织阳性率高于癌周组织，但在几乎所有病例中，癌周X蛋白阳性的肝细胞数量和它们的染色强度均显著多于和强于癌组织癌细胞，特别是紧邻癌组织的多数肝细胞胞质和部分细胞核常显示强阳性。癌组织间残留的肝细胞亦常表现胞质X蛋白强阳性和部分胞核阳性。癌细胞内X蛋白主要存在于核内(75%)，胞质有时显示轻度染色，但多为阴性反应。这些特点似乎表明，肝细胞癌变与X基因编码的产物——X蛋白的高度持续表达有关。17.2%CAH患者X蛋白阳性，对这些X蛋白阳性患者转化为肝硬化和/或肝癌的可能性应引起注意和进行研究。
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有研究表明，X基因转化的小鼠细胞系可表达X蛋白，并能在裸鼠体内诱发肝肿瘤[4]。本组19例HCC患者癌组织间和/或癌周肝组织内胆管上皮细胞核存在X蛋白，其中6例合并有胆管癌，有4例X蛋白呈阳性反应。这似乎进一步显示HBV X基因及其编码的X蛋白在致胆管癌中亦可能起重要作用。
HBV等嗜肝DNA病毒含相似基因组，在逆转录复制、基因组成，特别是致癌等方面与逆转录病毒相似[5]。最近研究还表明，X基因具有转激活功能，能激活许多病毒和细胞基因启动子，包括HIV-1，Rouse病毒和SV40等[6～9]。国内学者报告，有X蛋白表达的肝癌周围的肝组织细胞内常有多种癌基因表达同时增强现象[12]，HBV DNA的整合可能改变细胞生长调节基因的表达，从而导致肿瘤[13]。因此HBV X基因及其产物，以及HBV DNA与细胞癌基因关系的深入研究，将可能揭示病毒致癌机理。
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图1 数个癌细胞核(图左)、癌周肝细胞质及部分胞核(图右)显示X蛋白阳性染色 PAP免疫组化染色 ×228(标尺=100μm下图均同)
图2 数个癌细胞核(图左下)和部分癌周肝细胞核(图右)显示X蛋白阳性
图3 部分癌细胞胞质X蛋白阳性
图4 癌周肝细胞胞质(图中)X蛋白强阳性染色
图5 存留肝细胞胞质X蛋白强阳性染色
图6 癌组织间胆管上皮细胞胞核X蛋白阳性
参考文献
1 Robinson WS, et al ,Hepadnaviruses and hepatoce-llular carcinoma(HCC).Caner Detect Prev 1989;14:245.
, 百拇医药
2 Miyaki M, et al. Integration of region X of hepatitis B virus genome in human primary hepatocellular carcinomas propagated in nude mice. J Gen Virol 1986;67:1449.
3 Moriarty AM, et al. Antibodies to peptides detect new hepatitis B antigen: serological correlation with hepatocellular carcinoma. Science 1985;227:429.
4 Koike K, et al. The X gene of hepatitis B virus induced growth stimulation and tumorigenic trans-formation of mouse NIH 3 T 3 cells. Jpn J Cancer Res 1989;80:617.
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5 Will H, et al. Putative reverse transcriptase intermediates of human hepatitis B virus in primary liver carcinomas. Science 1986;231:594.
6 Zahm P, et al. The HBV X-ORF encodes a trans-activator: a potential factor in viral hepatocarcinogenesis. Oncogene 1988;3:169.
7 Seto E, et al. Transactivation by the hepatitis B virus X protein depends on AP-2 and other trans-cription factors. Nature 1990;344:72.
, 百拇医药
8 Siddiqui A, et al. Trans-activation of viral enhan-cers including long terminal repeat of the human immunodeficiency virus by hepatitis B virus X protein. Virology 1989;169:479.
9 Koike K, et al. Oncogenic potential of hepatitis B virus. Mol Biol Med 1989;6:151.
10 Wang WL,et al. HBxAg in the liver from carrier patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Hepatology 1991;14:29.
11 Haruna Y, et al. Expression of X protein and hepatitis B virus replication in chronic hepatitis. Hepatology 1991;13:417.
12 连兆瑞等，人原发性肝细胞癌和癌旁组织ets-2，IgGf-II，C-mgc和N-ras 表达的研究。第二军医大学学报 1990；11：1。
13 Zhou YZ, et al. Structural analysis of a hepatitis B virus genome integrated into chromosome 17p of a human hepatocellular carcinoma. J Virol 1988;62:4224., 百拇医药
单位：(北京部队总医院全军肝病研究所，100700)陈良标 王桂林 吴霞 李亚非 曹希贤；(美国费城Fox Chase癌中心)MA Feitelson；(河北开滦矿务局医院)丛锦文 赵印；(北京市右安医院)孟欣
关键词：乙型肝炎病毒；X蛋白；肝细胞瘤；胆管肿瘤
中华医学杂志920409
摘要 应用PAP免疫组化技术和抗乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白抗血清检查34例肝癌患者的癌及非癌肝组织，癌细胞的X蛋白阳性率94.1%，其中27例原发性肝癌伴肝硬化，其肝细胞X蛋白阳性率92.6%，并发现癌周几乎所有肝细胞都显示X蛋白强阳性。58例慢性活动性肝炎肝活检标本X蛋白阳性率17.2%，肝癌及肝硬化组织X蛋白高频率及优势表达，显示它对肝癌发生或肝细胞癌化可能起重要作用。本研究发现19例(59.4%)原发性肝癌患者肝及癌组织间胆管上皮细胞X蛋白阳性，6例合并胆管癌，癌细胞显示X蛋白阳性，因此，胆管癌发生是否与HBV X蛋白存在有关值得探讨。
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乙型肝炎病毒(HBV)感染者发生原发性肝癌(HCC)比非感染者为高，80%～90%的HCC患者肝细胞均有HBV DNA整合，但HBV致癌机理仍不清楚[1～3]。近年来，HBV致癌研究的注意力集中在X基因及其编码的X蛋白上，有关报道[4～9]逐渐增多。我们采用敏感的PAP免疫组化技术，对手术及尸解患者的肝癌组织进行了检查，并与慢性活动性肝炎(CAH)患者肝穿组织检查进行了比较，试图了解X蛋白在HCC形成和发展中的作用。
材料和方法
HCC患者癌组织标本34例，其中手术取材23例，尸解标本11例。经临床物理和生化检查，手术或尸解组织的病理学诊断均为HCC，其中27例伴有肝硬化，6例合并胆管癌。58例CAH患者肝穿组织经病理学诊断证实和血清学检查HBsAg阳性。免疫组化染色按常规PAP方法进行，所用试剂购自北京生物制品研究所。兔抗X蛋白血清(兔抗-X99，X100和XX101多克隆抗血清)为美国费城Fox Chase癌研究中心提供。该血清系用长度分别为100～114、115～131和10～29残基X蛋白合成肽免疫健康正常新西兰家兔而制备出来的。用时根据抗体效价作适当稀释后混合使用。对照试验以正常兔血清取代兔抗X蛋白血清进行。
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结 果
应用PAP技术检查34例HCC，32例X蛋白免疫酶染色阳性，阳性率94.1%(附表)。阳性反应产物为棕黄色颗粒，多见弥漫性分布。癌细胞内X蛋白主要存在于胞核(图1，2)或胞核和胞质同时存在，仅胞质阳性者较少，且多为弱阳性染色(图3)。癌周肝细胞胞质和胞核经常同时显示X蛋白阳性(图1)，仅胞质或胞核阳性者较少。癌组织X蛋白阳性率稍高于癌周组织，但大多数病例癌周组织内X蛋白阳性细胞(肝细胞)数量及它们的染色强度均显著高于癌组织。上述病例中癌组织阳性而癌周组织阴性者3例，癌周组织X蛋白阳性而癌组织阴性者1例，其余均为癌及癌周组织同时阳性。在27例HCC伴有肝硬化标本中，25例肝细胞X蛋白阳性(阳性率92.6%)。肝硬化组织内肝细胞X蛋白主要存在于胞核内(图2)，而紧邻癌组织的肝细胞(图1)或癌组织间残留的几乎所有肝细胞胞质(图4，5)均显示X蛋白强阳性反应，部分或少数胞核阳性。
附表 34例HCC患者癌及癌周组织内X蛋白分布 细胞种类
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阳性例数(%)
胞质
胞核
胞质、胞核
合计
癌细胞
8(23.5)
13(38.2)
11(34.4)
32(94.1)
癌周肝细胞
5(14.7)
6(17.7)
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16(50.0)
27(84.4)
胆管上皮细胞
0(0.0)
19(59.4)
0(0.0)
19(59.4)
注：34例HCC中2例未见到癌周肝组织及胆管上皮
检查中还发现32例HCC中19例(59.4%)癌组织周围和/或癌周肝组织间胆管上皮细胞显示X蛋白阳性，阳性产物均定位于胞核(图6)，每一胆管X蛋白阳性细胞核数量不一，部分胆管上皮细胞核多数呈阳性反应。34例HCC中6例合并胆管癌，其中4例胆管癌细胞胞核X蛋白阳性。
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58例CAH患者肝组织标本中10例(17.2%)肝细胞胞质X蛋白阳性，其中1例伴胞核阳性，阳性染色强度一般较弱，阳性细胞数量较少。部分HCC标本，分别以兔抗X99和X101抗体进行检查，染色结果无差别。所设置的对照试验均显示X蛋白染色阴性。
讨 论
研究表明，80%～90%有HBV感染的HCC患者的肝癌细胞和HBsAg阳性肝癌细胞系均有HBV DNA整合，HCC中HBV X基因整合频率最高，因而认为，X基因整合与HBV致癌关系最为密切[1，2]。 Moriarty等[3]曾报道抗X蛋白抗体主要存在于HCC患者血清中，认为它可能是HCC标志。本组患者标本切片来自几个单位，未做HBV其它标志的免疫组化检查，但一般认为，X蛋白是HBV感染标志之一，并与HBV复制有密切关系[10，11]，故可认为本组大多数肝癌病例与HBV感染有关。Feitelson等研究结果为肝硬化患者肝组织X蛋白阳性率97%，肝癌组织57%和癌周组织80%，故他们认为肝病的发展可能与HBV X蛋白在肝硬化和肝癌组织内的高度持续表达有关。本组34例HCC患者癌组织HBV X蛋白的阳性率高达94.1%，其中27例HCC伴有肝硬化的肝细胞X蛋白阳性率为92.6%，而CAH患者仅17.2%。X蛋白在肝硬化，特别是肝癌组织内的高度表达表明，它可能与HCC发生发展和肝硬化转化为HCC有密切关系。X蛋白在肝癌组织和癌周肝组织内存在的特点值得注意。虽然大多数病例(85.3%)癌组织和癌周组织X蛋白同时显示阳性，而且癌组织阳性率高于癌周组织，但在几乎所有病例中，癌周X蛋白阳性的肝细胞数量和它们的染色强度均显著多于和强于癌组织癌细胞，特别是紧邻癌组织的多数肝细胞胞质和部分细胞核常显示强阳性。癌组织间残留的肝细胞亦常表现胞质X蛋白强阳性和部分胞核阳性。癌细胞内X蛋白主要存在于核内(75%)，胞质有时显示轻度染色，但多为阴性反应。这些特点似乎表明，肝细胞癌变与X基因编码的产物——X蛋白的高度持续表达有关。17.2%CAH患者X蛋白阳性，对这些X蛋白阳性患者转化为肝硬化和/或肝癌的可能性应引起注意和进行研究。
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有研究表明，X基因转化的小鼠细胞系可表达X蛋白，并能在裸鼠体内诱发肝肿瘤[4]。本组19例HCC患者癌组织间和/或癌周肝组织内胆管上皮细胞核存在X蛋白，其中6例合并有胆管癌，有4例X蛋白呈阳性反应。这似乎进一步显示HBV X基因及其编码的X蛋白在致胆管癌中亦可能起重要作用。
HBV等嗜肝DNA病毒含相似基因组，在逆转录复制、基因组成，特别是致癌等方面与逆转录病毒相似[5]。最近研究还表明，X基因具有转激活功能，能激活许多病毒和细胞基因启动子，包括HIV-1，Rouse病毒和SV40等[6～9]。国内学者报告，有X蛋白表达的肝癌周围的肝组织细胞内常有多种癌基因表达同时增强现象[12]，HBV DNA的整合可能改变细胞生长调节基因的表达，从而导致肿瘤[13]。因此HBV X基因及其产物，以及HBV DNA与细胞癌基因关系的深入研究，将可能揭示病毒致癌机理。
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图1 数个癌细胞核(图左)、癌周肝细胞质及部分胞核(图右)显示X蛋白阳性染色 PAP免疫组化染色 ×228(标尺=100μm下图均同)
图2 数个癌细胞核(图左下)和部分癌周肝细胞核(图右)显示X蛋白阳性
图3 部分癌细胞胞质X蛋白阳性
图4 癌周肝细胞胞质(图中)X蛋白强阳性染色
图5 存留肝细胞胞质X蛋白强阳性染色
图6 癌组织间胆管上皮细胞胞核X蛋白阳性
参考文献
1 Robinson WS, et al ,Hepadnaviruses and hepatoce-llular carcinoma(HCC).Caner Detect Prev 1989;14:245.
, 百拇医药
2 Miyaki M, et al. Integration of region X of hepatitis B virus genome in human primary hepatocellular carcinomas propagated in nude mice. J Gen Virol 1986;67:1449.
3 Moriarty AM, et al. Antibodies to peptides detect new hepatitis B antigen: serological correlation with hepatocellular carcinoma. Science 1985;227:429.
4 Koike K, et al. The X gene of hepatitis B virus induced growth stimulation and tumorigenic trans-formation of mouse NIH 3 T 3 cells. Jpn J Cancer Res 1989;80:617.
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5 Will H, et al. Putative reverse transcriptase intermediates of human hepatitis B virus in primary liver carcinomas. Science 1986;231:594.
6 Zahm P, et al. The HBV X-ORF encodes a trans-activator: a potential factor in viral hepatocarcinogenesis. Oncogene 1988;3:169.
7 Seto E, et al. Transactivation by the hepatitis B virus X protein depends on AP-2 and other trans-cription factors. Nature 1990;344:72.
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8 Siddiqui A, et al. Trans-activation of viral enhan-cers including long terminal repeat of the human immunodeficiency virus by hepatitis B virus X protein. Virology 1989;169:479.
9 Koike K, et al. Oncogenic potential of hepatitis B virus. Mol Biol Med 1989;6:151.
10 Wang WL,et al. HBxAg in the liver from carrier patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Hepatology 1991;14:29.
11 Haruna Y, et al. Expression of X protein and hepatitis B virus replication in chronic hepatitis. Hepatology 1991;13:417.
12 连兆瑞等，人原发性肝细胞癌和癌旁组织ets-2，IgGf-II，C-mgc和N-ras 表达的研究。第二军医大学学报 1990；11：1。
13 Zhou YZ, et al. Structural analysis of a hepatitis B virus genome integrated into chromosome 17p of a human hepatocellular carcinoma. J Virol 1988;62:4224., 百拇医药