高能冲击波对体外培养膀胱肿瘤细胞系BIU-87的抑制作用*
作者：郭应禄 周利群 俞莉章 许昕
单位：北京医科大学泌尿外科研究所
关键词：碎石术；膀胱肿瘤；细胞，培养的
中华医学杂志920904.htm 摘要 用高能冲击波(HESW)冲击了体外培养的膀胱肿瘤细胞系BIU-87细胞悬液，碎石机Dornier HM，工作电压15kV，冲击次数分别为0、400、800次，水浴温度35-37℃，频率60次/分。结果如下：细胞存活率及克隆集落率均随冲击次数增加而降低，而细胞倍增时间则随之延长；生长曲线及3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入试验均示冲击后存活肿瘤细胞的生长受暂时性的抑制，一段时间后可恢复其正常生长能力；且冲击800次组第一阶段生长曲线示冲击24小时后曲线呈暂时性下降。表明HESW对体外肿瘤细胞具有细胞毒性作用，包括急性致死作用、慢性致死作用及生长抑制作用，而生长抑制作用是暂时性的；在一定工作电压条件下与冲击次数呈正相关。
, 百拇医药
自1985年以来，国外开始利用体外碎石机开展高能冲击波(HESW)对体外和体内肿瘤细胞作用的研究，发现HESW对肿瘤细胞的生长有抑制作用[1-4]。为明确HESW对肿瘤细胞是否存在细胞毒性作用，探索HESW是否可作为肿瘤治疗的方法，我们用HESW对膀胱肿瘤细胞系BIU-87[5]的影响进行了研究。
材料与方法
1.膀胱肿瘤细胞系BIU-87的标准培养及碎石机工作条件：BIU-87细胞的标准培养详见文献[5]，实验时取指数生长期细胞，消化收集于无菌聚丙稀试管内，每管3ml，胶塞密闭后置碎石机第2焦点上接受冲击，对照管固定于水池壁上，使用Dornier HM3碎石机(德国Dornier公司生产)，工作电压15kV，实验组冲击次数分别为400及800次，水浴温度35-37℃，频率60次/分。
2.胎盘蓝染色法计算细胞存活率：对照与两试验组分别取0.5ml悬液加入无菌试管中，各加入等量0.5%胎盘蓝溶液，5分钟后光镜下记数每百个细胞中活细胞数，每组记两次，取均值。
, 百拇医药
3.液体克隆集落试验：各组依细胞存活率，分别取含300个活细胞的悬液量加入直径4.5cm平皿内，加培养液置3ml，培养7天后在显微镜下记数集落数，计算集落率。每个集落所含细胞数需大于或等于50个。
4.细胞生长曲线：各组分别取含1.0×105活细胞的悬液量加入24孔培养板各孔中，每孔加培养液至1ml后在标准状态下培养。每日每组各取两孔消化收集，记数细胞数，取均值，描记生长曲线。7天后，各组再取含1.0×105活细胞的县液量，复接种于24孔板中培养，描记第二阶段(冲击后8-14天)生长曲线。每组n=5。
5.3H-TdR掺入试验：分别于冲击后第1、3、8、14天，各组分别取含1.0×105活细胞的悬液量，加入24孔板中，每孔加入1ml含3H-TdR的培养液(浓度为1μCi/ml，中国科学院原子能研究所生产)，标准条件下培养24小时后，消化、收集，负压抽滤于醋酸纤维膜上，置闪烁瓶中，烘干后每瓶加入闪烁液7ml，避光静置24小时后送测液闪计数CPM值，每组两孔，取均值。闪烁液含：0.5%PPO，2，5-二苯基恶唑；0.03%POPOP，1，4-22[2'-(5'-苯基恶唑)]；二甲苯溶剂(上海试剂厂生产)；使用LKB Wallac 1209型液闪谱仪(美国Wallac公司生产)。
, http://www.100md.com
本组试验结果均采用方差分析处理。
结 果
1.肿瘤细胞存活率及集落率，冲击后BIU-87细胞存活率及集落率均随冲击波次数增加而降低，对照组与两试验组有显著性差异(P<0.01，附表)
附表 冲击后BIU-87细胞的存活率及集落率(
±S，%)
组别
n
冲击次数
存活率
集落率
, http://www.100md.com 对照组
8
0
97.6±0.8*
90.1±2.0*
实验I组
8
400
69.1±3.7*
32.6±3.7*
实验II组
8
800
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58.4±4.6*
20.8±1.6*
注：各组间比较，* P<0.01
2.细胞生长曲线：冲击后第1-8天，生长曲线显示随冲击次数增加，曲线上升速度明显延缓，各组间每日细胞计数值均有显著性差异(P<0.01)，且实验II组冲击24小时后细胞计数值低于基值。由此曲线测得，BIU-87细胞倍增时间对照组为24小时，实验I组为44小时，实验II组为76小时(图1)。
冲击后天数
图1 冲击后8天内细胞生长曲线(每组n=5)
冲击后第8-14天，生长曲线显示各组曲线上升速度基本相同，各组细胞计数值无明显差异(P<0.05，图2)
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冲击后天数
图2 冲击后8-14天细胞生长曲线(每组n=5)
3.3H-TdR掺入后液闪记数值CPM的变化(图3)：
图3 冲击后3H-TdR掺入液闪计数值CPM的变化(每组n=8)
不同组间比较，冲击后第1-3天，三组间CPM值有显著性差异，随冲击次数增加而明显降低(P<0.01)；而第8-14天，各组间CPM值则无显著性差异(P>0.05)，说明BIU-87细胞于冲击8天后已恢复正常生长能力。同组间比较，对照组CPM值间差异无显著性，说明BIU-87细胞具有恒定的生长能力；但两试验组于冲击后第1、3、8天，CPM值随时间延长而逐渐增加，差异有显著性(P<0.01)，而第8及14天两天，同组CPM值间差异无显著性(P>0.05)，说明BIU-87细胞已逐渐恢复并保持恒定的生长能力。
, http://www.100md.com
讨 论
目前多数学者认为，HESW对体外肿瘤细胞的生长有抑制作用，其作用与能量和次数成正相关，但是暂时性的[1-4，6-9]；且不同细胞对HESW的敏感性不同[6，9]，但许多问题尚无结论。
我们以膀胱肿瘤细胞系BIU-87为研究对象，以胎盘蓝染色法检测了BIU-87细胞接受冲击后的存活率，结果发现，在一定工作电压条件下，细胞存活率随冲击次数增加而降低，说明HESW具有直接杀死肿瘤细胞的作用，即急性致死作用。对冲击后肿瘤细胞的生长能力通过多项指标的研究，得到的结果表明：细胞集落率于冲击后随冲击次数增加而降低，而细胞倍增时间则随之延长；冲击后1-8天生长曲线显示，两试验组曲线上升速度较对照组明显延缓，尤以实验II组为著；而冲击后8-14日生长曲线则显示各组上升速度相同，统计学分析无差异。说明HESW对冲击后存活肿瘤细胞的生长存在抑制作用，但仅是暂时性的。由实验II组第一阶段细胞生长曲线可见，冲击24小时后，其细胞计数值低于基值，曲线出现暂时性的下降，说明冲击后存活的肿瘤细胞中部分未能恢复正常生长能力而死亡，这表明HESW对肿瘤细胞尚具有慢性致死作用。这些与Russo等[1]及Randazzo等[6]的结论相一致。我们应用3H-TdR掺入试验对冲击后肿瘤细胞的生长能力进行了追踪性观察，结果更进一步证实了冲击后存活的肿瘤细胞在短时间内，生长受到暂时性的抑制，随着时间的延长，可逐渐恢复其原有的生长能力。
, http://www.100md.com
本组结果亦间接证明了不同细胞对HESW的敏感性不同。BIU-87细胞在工作电压15kV，冲击800次时，存活率为58.4%；而肾肿瘤细胞(RCC)及正常人胚胎肾细胞(NHEK)在18kV，冲击800次时，存活率仍在90%左右[6]；人黑色素瘤细胞SK-Mel-28在18kV，仅冲击200次时，存活率只有69%。此差异可能是由于不同细胞其细胞骨架不同所造成的。Randazzo等[6]及Kohri等[9]曾报道，肿瘤细胞对HESW的敏感性比正常组织细胞要高，即肿瘤细胞更易为HESW所杀伤，推测这种差异可能是由于肿瘤细胞分裂旺盛，细胞结构异常如肿瘤细胞的膜厚、核大、细胞间粘附能力差等所致。这为今后将HESW过渡到临床治疗肿瘤提供了一种理论上的依据，有可能在不影响或较少损害正常组织情况下有效地杀伤肿瘤组织。
HESW对肿瘤细胞的作用机制尚不明确，有学者认为是一种机械损害，可作用于细胞膜、胞浆内细胞器及核染色质上[8]；亦有学者[10]证实冲击波可在碎石机第2焦点处产生微气泡，而微气泡的电离效应产生自由基氧化物杀伤肿瘤细胞。有关其作用机制，是否促进体内肿瘤的转移，与化疗、放疗及低温等联合应用的效果等问题尚待进一步研究和探讨。
, 百拇医药
参 考 文 献
1.Russo P, et al. The in vitro effect of high energy shock waves on human prostate cancer cell line PC-3. Cancer Res 1985; 26 : 267.
2.Russo P, et al. The effect of extracorporeal shock waves on dunning R-3327 AT-3 prostatic carcinomoa. J Urol 1985; 133 : 124A.
3.Russo P. et al. High energy shock waves surppress tumor growth in vitro and in vivo. J Urol 1986; 135 : 626.
, http://www.100md.com
4.Russo P. et al. Histopothologic and ultrastructural correlates of trmor growth suppression by high energy shock waves. J Urol 1987; 137 : 338.
5.俞莉章等.人体膀胱移形细胞癌细胞系BIU-87的建立及其生物学特性.中华泌尿外科杂志 1989; 10 : 131.
6.Randazzo RF, et al. The in vitro and in vivo effects of extracorporeal shock waves on malignant cells. Urol Res 1988; 16 : 419.
7.Oosterhof GO, et al. The in vitro effect of dldctromaganetically generated shock waves (Lithostar) on the Dunning R 3327 PAT-2 rat prostatic caner cellline. A potentiating effect on the in vitro cytotoxicity of vinblastin. Urol Res 1989; 17 : 13.
, http://www.100md.com
8.Laudone VP, et al. Cytotoxicity of high energy shock waves: methodologic considerations. J Urol 1989; 141 : 965.
9.Kohri K, et al. Effect of high energy shock waves on tumor cells, Urol Res 1990; 18 : 101.
10.Morgan TR, et al. Free radical production by high energy shock waves-comparison with ionizing irradiation. J Urol 1988; 139 : 186.
(1992年3月13日收稿 同年6月2日修回), http://www.100md.com
单位：北京医科大学泌尿外科研究所
关键词：碎石术；膀胱肿瘤；细胞，培养的
中华医学杂志920904.htm 摘要 用高能冲击波(HESW)冲击了体外培养的膀胱肿瘤细胞系BIU-87细胞悬液，碎石机Dornier HM，工作电压15kV，冲击次数分别为0、400、800次，水浴温度35-37℃，频率60次/分。结果如下：细胞存活率及克隆集落率均随冲击次数增加而降低，而细胞倍增时间则随之延长；生长曲线及3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入试验均示冲击后存活肿瘤细胞的生长受暂时性的抑制，一段时间后可恢复其正常生长能力；且冲击800次组第一阶段生长曲线示冲击24小时后曲线呈暂时性下降。表明HESW对体外肿瘤细胞具有细胞毒性作用，包括急性致死作用、慢性致死作用及生长抑制作用，而生长抑制作用是暂时性的；在一定工作电压条件下与冲击次数呈正相关。
, 百拇医药
自1985年以来，国外开始利用体外碎石机开展高能冲击波(HESW)对体外和体内肿瘤细胞作用的研究，发现HESW对肿瘤细胞的生长有抑制作用[1-4]。为明确HESW对肿瘤细胞是否存在细胞毒性作用，探索HESW是否可作为肿瘤治疗的方法，我们用HESW对膀胱肿瘤细胞系BIU-87[5]的影响进行了研究。
材料与方法
1.膀胱肿瘤细胞系BIU-87的标准培养及碎石机工作条件：BIU-87细胞的标准培养详见文献[5]，实验时取指数生长期细胞，消化收集于无菌聚丙稀试管内，每管3ml，胶塞密闭后置碎石机第2焦点上接受冲击，对照管固定于水池壁上，使用Dornier HM3碎石机(德国Dornier公司生产)，工作电压15kV，实验组冲击次数分别为400及800次，水浴温度35-37℃，频率60次/分。
2.胎盘蓝染色法计算细胞存活率：对照与两试验组分别取0.5ml悬液加入无菌试管中，各加入等量0.5%胎盘蓝溶液，5分钟后光镜下记数每百个细胞中活细胞数，每组记两次，取均值。
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3.液体克隆集落试验：各组依细胞存活率，分别取含300个活细胞的悬液量加入直径4.5cm平皿内，加培养液置3ml，培养7天后在显微镜下记数集落数，计算集落率。每个集落所含细胞数需大于或等于50个。
4.细胞生长曲线：各组分别取含1.0×105活细胞的悬液量加入24孔培养板各孔中，每孔加培养液至1ml后在标准状态下培养。每日每组各取两孔消化收集，记数细胞数，取均值，描记生长曲线。7天后，各组再取含1.0×105活细胞的县液量，复接种于24孔板中培养，描记第二阶段(冲击后8-14天)生长曲线。每组n=5。
5.3H-TdR掺入试验：分别于冲击后第1、3、8、14天，各组分别取含1.0×105活细胞的悬液量，加入24孔板中，每孔加入1ml含3H-TdR的培养液(浓度为1μCi/ml，中国科学院原子能研究所生产)，标准条件下培养24小时后，消化、收集，负压抽滤于醋酸纤维膜上，置闪烁瓶中，烘干后每瓶加入闪烁液7ml，避光静置24小时后送测液闪计数CPM值，每组两孔，取均值。闪烁液含：0.5%PPO，2，5-二苯基恶唑；0.03%POPOP，1，4-22[2'-(5'-苯基恶唑)]；二甲苯溶剂(上海试剂厂生产)；使用LKB Wallac 1209型液闪谱仪(美国Wallac公司生产)。
, http://www.100md.com
本组试验结果均采用方差分析处理。
结 果
1.肿瘤细胞存活率及集落率，冲击后BIU-87细胞存活率及集落率均随冲击波次数增加而降低，对照组与两试验组有显著性差异(P<0.01，附表)
附表 冲击后BIU-87细胞的存活率及集落率(
±S，%)组别
n
冲击次数
存活率
集落率
, http://www.100md.com 对照组
8
0
97.6±0.8*
90.1±2.0*
实验I组
8
400
69.1±3.7*
32.6±3.7*
实验II组
8
800
, 百拇医药
58.4±4.6*
20.8±1.6*
注：各组间比较，* P<0.01
2.细胞生长曲线：冲击后第1-8天，生长曲线显示随冲击次数增加，曲线上升速度明显延缓，各组间每日细胞计数值均有显著性差异(P<0.01)，且实验II组冲击24小时后细胞计数值低于基值。由此曲线测得，BIU-87细胞倍增时间对照组为24小时，实验I组为44小时，实验II组为76小时(图1)。
冲击后天数
图1 冲击后8天内细胞生长曲线(每组n=5)
冲击后第8-14天，生长曲线显示各组曲线上升速度基本相同，各组细胞计数值无明显差异(P<0.05，图2)
, http://www.100md.com
冲击后天数
图2 冲击后8-14天细胞生长曲线(每组n=5)
3.3H-TdR掺入后液闪记数值CPM的变化(图3)：
图3 冲击后3H-TdR掺入液闪计数值CPM的变化(每组n=8)
不同组间比较，冲击后第1-3天，三组间CPM值有显著性差异，随冲击次数增加而明显降低(P<0.01)；而第8-14天，各组间CPM值则无显著性差异(P>0.05)，说明BIU-87细胞于冲击8天后已恢复正常生长能力。同组间比较，对照组CPM值间差异无显著性，说明BIU-87细胞具有恒定的生长能力；但两试验组于冲击后第1、3、8天，CPM值随时间延长而逐渐增加，差异有显著性(P<0.01)，而第8及14天两天，同组CPM值间差异无显著性(P>0.05)，说明BIU-87细胞已逐渐恢复并保持恒定的生长能力。
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讨 论
目前多数学者认为，HESW对体外肿瘤细胞的生长有抑制作用，其作用与能量和次数成正相关，但是暂时性的[1-4，6-9]；且不同细胞对HESW的敏感性不同[6，9]，但许多问题尚无结论。
我们以膀胱肿瘤细胞系BIU-87为研究对象，以胎盘蓝染色法检测了BIU-87细胞接受冲击后的存活率，结果发现，在一定工作电压条件下，细胞存活率随冲击次数增加而降低，说明HESW具有直接杀死肿瘤细胞的作用，即急性致死作用。对冲击后肿瘤细胞的生长能力通过多项指标的研究，得到的结果表明：细胞集落率于冲击后随冲击次数增加而降低，而细胞倍增时间则随之延长；冲击后1-8天生长曲线显示，两试验组曲线上升速度较对照组明显延缓，尤以实验II组为著；而冲击后8-14日生长曲线则显示各组上升速度相同，统计学分析无差异。说明HESW对冲击后存活肿瘤细胞的生长存在抑制作用，但仅是暂时性的。由实验II组第一阶段细胞生长曲线可见，冲击24小时后，其细胞计数值低于基值，曲线出现暂时性的下降，说明冲击后存活的肿瘤细胞中部分未能恢复正常生长能力而死亡，这表明HESW对肿瘤细胞尚具有慢性致死作用。这些与Russo等[1]及Randazzo等[6]的结论相一致。我们应用3H-TdR掺入试验对冲击后肿瘤细胞的生长能力进行了追踪性观察，结果更进一步证实了冲击后存活的肿瘤细胞在短时间内，生长受到暂时性的抑制，随着时间的延长，可逐渐恢复其原有的生长能力。
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本组结果亦间接证明了不同细胞对HESW的敏感性不同。BIU-87细胞在工作电压15kV，冲击800次时，存活率为58.4%；而肾肿瘤细胞(RCC)及正常人胚胎肾细胞(NHEK)在18kV，冲击800次时，存活率仍在90%左右[6]；人黑色素瘤细胞SK-Mel-28在18kV，仅冲击200次时，存活率只有69%。此差异可能是由于不同细胞其细胞骨架不同所造成的。Randazzo等[6]及Kohri等[9]曾报道，肿瘤细胞对HESW的敏感性比正常组织细胞要高，即肿瘤细胞更易为HESW所杀伤，推测这种差异可能是由于肿瘤细胞分裂旺盛，细胞结构异常如肿瘤细胞的膜厚、核大、细胞间粘附能力差等所致。这为今后将HESW过渡到临床治疗肿瘤提供了一种理论上的依据，有可能在不影响或较少损害正常组织情况下有效地杀伤肿瘤组织。
HESW对肿瘤细胞的作用机制尚不明确，有学者认为是一种机械损害，可作用于细胞膜、胞浆内细胞器及核染色质上[8]；亦有学者[10]证实冲击波可在碎石机第2焦点处产生微气泡，而微气泡的电离效应产生自由基氧化物杀伤肿瘤细胞。有关其作用机制，是否促进体内肿瘤的转移，与化疗、放疗及低温等联合应用的效果等问题尚待进一步研究和探讨。
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参 考 文 献
1.Russo P, et al. The in vitro effect of high energy shock waves on human prostate cancer cell line PC-3. Cancer Res 1985; 26 : 267.
2.Russo P, et al. The effect of extracorporeal shock waves on dunning R-3327 AT-3 prostatic carcinomoa. J Urol 1985; 133 : 124A.
3.Russo P. et al. High energy shock waves surppress tumor growth in vitro and in vivo. J Urol 1986; 135 : 626.
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4.Russo P. et al. Histopothologic and ultrastructural correlates of trmor growth suppression by high energy shock waves. J Urol 1987; 137 : 338.
5.俞莉章等.人体膀胱移形细胞癌细胞系BIU-87的建立及其生物学特性.中华泌尿外科杂志 1989; 10 : 131.
6.Randazzo RF, et al. The in vitro and in vivo effects of extracorporeal shock waves on malignant cells. Urol Res 1988; 16 : 419.
7.Oosterhof GO, et al. The in vitro effect of dldctromaganetically generated shock waves (Lithostar) on the Dunning R 3327 PAT-2 rat prostatic caner cellline. A potentiating effect on the in vitro cytotoxicity of vinblastin. Urol Res 1989; 17 : 13.
, http://www.100md.com
8.Laudone VP, et al. Cytotoxicity of high energy shock waves: methodologic considerations. J Urol 1989; 141 : 965.
9.Kohri K, et al. Effect of high energy shock waves on tumor cells, Urol Res 1990; 18 : 101.
10.Morgan TR, et al. Free radical production by high energy shock waves-comparison with ionizing irradiation. J Urol 1988; 139 : 186.
(1992年3月13日收稿 同年6月2日修回), http://www.100md.com