骨形成蛋白在种植体与骨结合过程中的作用
作者：邹敬才 肖光裕 唐文杰 郭庆科 杨华斌 伍本德 廖际常 庞 薇
单位：710038西安第四军医大学诏都医院口腔科(邹敬才，肖光裕，唐文杰，郭庆科)；西北有色金属研究院四室(杨华斌，伍本德，廖际常，庞 薇)
关键词：牙植入，骨内；生物相容性材料；骨发育
中华医学杂志930303 摘要 通过光镜、免疫组化骨形成蛋白(BMP)定量分析、X线能谱分析，对BMP在种植体与骨界面结合中的作用进行了探讨。结果显示：外源性BMP与内源性BMP的作用时间点及新骨形成的启动机制有所差异，复合BMP种植体比未复合BMP种植体成骨早、骨早成熟1～2月，加速了界面骨性结合，有重要的临床意义。
人工牙种植常需二次手术，从首次种植到二次手术时间一般需要3～6个月，方能使种植牙与骨产生良好的骨性结合〔1〕。骨形成蛋白(BMP)是80年代初分离出的一种早期有效诱导异位新骨形成的活性蛋白〔2〕，我们把BMP与种植体复合后，通过光镜。ABC免疫组化染色、X线能谱分析对BMP在骨结合(Osseointegration)过程中的作用进行了初步的探讨。
, 百拇医药
材料与方法
一、种植体制备
1.微孔钛种植体：纯钛球形粉烧结成园柱形，长10mm，直径4.5mm，平均孔径143μm，孔隙率约40%。
2.生物陶瓷/微孔钛种植体：采用致密羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)与生物玻璃陶瓷(apatite-wollastonite-containing glass ce-ramic,A-W.GC)混合(重量比1∶1)烧结于微孔钛种植体上，平均涂层厚约130μm，界面剪切强度约10MPa，长10mm，直径4.5mm。
上两种种植体各144个，经三氯乙烯、无水乙醇超声清洗、高压消毒后备用。
二、BMP提取及与种植体的复合
按杨连甲方法〔3〕用1岁小牛长皮质骨提取出较纯的牛骨形成蛋白(bBMP)，活性鉴定有新骨形成。上两种种植体各72个，每个复合bBMP 5mg,经4mmol/L盐酸胍溶解、透析、抽真空、冻干、环氧乙烷消毒后备用。
, 百拇医药
三、种植方法
成年杂种狗48只，体重12～18kg，两性兼有，随机分为4组，每组12只，用2.5%戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉麻醉，在严格无菌手术下用略小于种植体直径(4.4mm)裂钻，在拔牙后的双侧下颌前磨牙区低速钻孔，深约12～14mm。然后把1、BMP/生物陶瓷涂层组；2、生物陶瓷涂层组；3、BMP/微孔钛组；4、微孔钛组。4种植体各植入12只狗双侧下颌前磨牙区，每侧3个，严密缝合创口。术后肌注庆大霉素3天，并在1、2、4、8、12、24周时每组处死2只。标本制备后进行光镜、抗bBMP单克隆抗体(bBMP-McAb)ABC法免疫组化染色。X线能谱分析等检测。
四、主要试剂及仪器
bBMP-McAb由第四军医大学口腔医学院病理科提供，该抗体亚类为小鼠IgG2a，工作浓度为1∶200，ABC试剂盒为美国Vector公司产品，按ABC法一次完成。BMP定量分析采用MPV-3型显微分光光度计(德国)，应用点测量法，光栏0.022×0.008mm,V＝800V，I＝7.5A，f＝25×10，最大吸收波长λmax＝460nm，每张切片在骨界面随机选择25个点，然后进行统计学处理(方差分析)。X线能谱分析采用PSEM-500扫描电镜、EDAX-9100/75能量分散谱仪(德国)进行界面钙磷含量测定。
, 百拇医药
结 果
一、光镜组织学观察
两组复合BMP的种植体在1周时界面可见新骨形成，8周时界面可见完整哈佛氏管，未复合BMP的两组种植体2周时界面有少量新骨形成，完整哈佛氏管在12周后才能见到(图1～4)。
图1 实验组1周时界面有新骨生成HE×33
图2 实验组1周时界面无新骨生成HE×33
, 百拇医药
图3 实验组8周时界面新骨成熟情况HE×66
图4 实验组8周时界面新骨成熟程度HE×33
二、BMP含量定量分析(附表)
三、X线能谱分析
两组复合BMP种植体的骨界面1周时可见有钙、磷的沉积，4～8周时界面钙磷含量与老骨相近，未复合BMP两组种植体，骨界面钙磷沉积于2周时开始，12周时方与老骨相近。涂层与未涂层微孔钛种植体，早期界面钙、磷的分布有所差异，生物陶瓷涂层组界面钙磷呈“V”形分布，而未涂层组是从骨缘向种植体缘从高至低的单向分布。
讨 论
Osborn和Newsly〔4〕根据材料的生物学特性把骨结合性种植体分为两类：生物惰性(bioinert)和生物活性(bioactive)，Meffert等〔5〕也陈述了相似的观点，提出了“适应性骨结合”(adaptive osseointegration)和“生物性结合”(biointegration)。微孔钛种植体是外形有别于Branemark种植体的另一种骨结合性种植体。球形粉制作的微孔种植体最早是由Hirschhorn等〔6〕报道的，首先应用于人工牙种植是Young〔7〕，采用钛铝钒合金。国内肖光裕等从1983年〔8～10〕起进行微孔钛种植体研究，取得了比较满意的效果。生物陶瓷如HA是一种在成分、结构与人体骨组织中钙盐一致的生物活性材料，把HA与金属种植体复合，涂层于表面，可改变金属种植体的生物相容性及与骨的结合方式，促使种植体与骨早期结合。Ducheyne和Cook等〔11，12〕观察到HA涂层种植体比相应未涂层金属种植体骨生长速度增快。一些研究也表明：HA与骨界面的结合强度，大于HA和骨各自的结合强度。
, 百拇医药
BMP是一种早期高效诱导新骨生成的活性蛋白，当与微孔钛种植体及生物陶瓷涂层微孔钛种植体复合后，光镜可见1周就有新骨形成，8周时界面可见完整的哈佛氏系统，而相应未复合BMP种植体在2周时才有少量新骨形成，12周时界面新骨才基本成熟。骨界面BMP含量定量分析显示：复合BMP的两组种植体1周时BMP含量最高，与相应对照组比较有显著差异性(P<0.01)，与同组其它各期比较也有显著差异性(P<0.01)，未复合BMP的两组种植体BMP含量高峰在2周，与同组其它各期比较有显著差异性(P<0.01)，各组种植体的BMP总含量，复合BMP组略大于未复合BMP组，生物陶瓷涂层组略大于未涂层组，但各组间均无显著性差异(P>0.05)，说明BMP对早期新骨形成影响较大，对晚期新骨形成无显著性影响。X线能谱分析显示：界面钙磷开始沉积时间与BMP高峰期相一致，钙磷沉积含量复合BMP组4～8周时已接近老骨水平，而未复合BMP组在12周才与老骨钙磷水平相近。以上结果表明：(1)外源性BMP与内源性BMP作用时间点及新骨形成的启动机制有所差异，复合BMP种植体是一主动诱导成骨过程，而未复合BMP种植体，骨结合是一在体内多种因素作用下被动的自然修复与新骨形成过程；(2)生物陶瓷涂层与未涂层微孔钛种植体都是BMP的良好载体；(3)BMP与种植体的复合，界面成骨早、新骨成熟早1～2月，加速了种植体骨界面的结合速度，缩短了骨结合时间，有重要的临床意义；(4)生物陶瓷涂层与未涂层的微孔钛种植体两者有相似的生物相容性，均是适宜于临床应用的种植体。
, 百拇医药
附表 四组不同种植体界面BMP含量测定(%，
±s) 组别
1周
2周
4周
8周
12周
BMP/微孔钛组
23±13**
36±18
37±15
37±14
, 百拇医药
38±11
微孔钛组
47±23
26±13*
44±12
44±16
44±16
BMP/陶瓷涂层组
20±11**
33±10
35±8
36±13
, 百拇医药
36±10
生物陶瓷涂层组
46±10
23±8*
39±10
39±16
40±13
注：测定的为透光度，P<0.05 P<0.01
参 考 文 献
1 Branemark PI.Osseointegration and experimental back-ground.J Prosthet Dent,1983,50∶404.
, 百拇医药
2 Urist MR,Lietez A,Mizutani H,et al.A bovine low mo-lecular weight morphogenetic protein (BMP) fraction.Clin Orthop,1982,162∶219.
3 杨连甲，金 岩，孙庆妹，等。骨形成蛋白(BMP)的实验研究，实用口腔医学杂志，1987，3∶73.
4 Osbron JF,Newesly H. Dynamic aspects of the implant-bone interface.Dental implants,materials and systems.Munchen,Wien,Hanser Verlag,1980∶111.
5 Meffert RM,Block MS,Kent JN.What is osseointegration?Int J Periodont Rest Dent ,1987,4∶9.
, http://www.100md.com
6 Hirschhorn JS,Reynolds J.Powder metallurgy fadrica-tion of cobalt alloy surgical implant materials.In KorostoffE(ed):Research in dental and medical materi-als.New York.Plenum,1969∶137.
7 Young FA.Porous titanium tooth roots:clinical evaluation.J Prosthet Dent,1979,41∶561.
8 肖光裕，顾萘书，唐文杰，等。微孔钛在颌骨及牙槽内种植的实验研究。中华口腔医学杂志，1985，20∶357.
9 肖光裕，顾萘书，李俊良，等。微孔钛合金牙根种植的动物实验研究。实用口腔医学杂志，1987，3∶83.
, 百拇医药
10 肖光裕，郭庆科，李俊良，等。微孔钛种植体的实验研究及临床应用。现代口腔医学杂志，1991，5∶19.
11 Ducheyne P,Hench LL,Kagan A,et al.Effect of hydroxyapatite impregnation on skeletal bonding of po-rous coated implants. J Biomed Mater Res,1980,14∶225.
12 Pilliar RM.Porous-surfacld metallic implants for orthopedic applications. J Biomed Mater Res 1987,21∶20.
(收稿：1992-08-03 修回：1992-01-03), http://www.100md.com
单位：710038西安第四军医大学诏都医院口腔科(邹敬才，肖光裕，唐文杰，郭庆科)；西北有色金属研究院四室(杨华斌，伍本德，廖际常，庞 薇)
关键词：牙植入，骨内；生物相容性材料；骨发育
中华医学杂志930303 摘要 通过光镜、免疫组化骨形成蛋白(BMP)定量分析、X线能谱分析，对BMP在种植体与骨界面结合中的作用进行了探讨。结果显示：外源性BMP与内源性BMP的作用时间点及新骨形成的启动机制有所差异，复合BMP种植体比未复合BMP种植体成骨早、骨早成熟1～2月，加速了界面骨性结合，有重要的临床意义。
人工牙种植常需二次手术，从首次种植到二次手术时间一般需要3～6个月，方能使种植牙与骨产生良好的骨性结合〔1〕。骨形成蛋白(BMP)是80年代初分离出的一种早期有效诱导异位新骨形成的活性蛋白〔2〕，我们把BMP与种植体复合后，通过光镜。ABC免疫组化染色、X线能谱分析对BMP在骨结合(Osseointegration)过程中的作用进行了初步的探讨。
, 百拇医药
材料与方法
一、种植体制备
1.微孔钛种植体：纯钛球形粉烧结成园柱形，长10mm，直径4.5mm，平均孔径143μm，孔隙率约40%。
2.生物陶瓷/微孔钛种植体：采用致密羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)与生物玻璃陶瓷(apatite-wollastonite-containing glass ce-ramic,A-W.GC)混合(重量比1∶1)烧结于微孔钛种植体上，平均涂层厚约130μm，界面剪切强度约10MPa，长10mm，直径4.5mm。
上两种种植体各144个，经三氯乙烯、无水乙醇超声清洗、高压消毒后备用。
二、BMP提取及与种植体的复合
按杨连甲方法〔3〕用1岁小牛长皮质骨提取出较纯的牛骨形成蛋白(bBMP)，活性鉴定有新骨形成。上两种种植体各72个，每个复合bBMP 5mg,经4mmol/L盐酸胍溶解、透析、抽真空、冻干、环氧乙烷消毒后备用。
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三、种植方法
成年杂种狗48只，体重12～18kg，两性兼有，随机分为4组，每组12只，用2.5%戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉麻醉，在严格无菌手术下用略小于种植体直径(4.4mm)裂钻，在拔牙后的双侧下颌前磨牙区低速钻孔，深约12～14mm。然后把1、BMP/生物陶瓷涂层组；2、生物陶瓷涂层组；3、BMP/微孔钛组；4、微孔钛组。4种植体各植入12只狗双侧下颌前磨牙区，每侧3个，严密缝合创口。术后肌注庆大霉素3天，并在1、2、4、8、12、24周时每组处死2只。标本制备后进行光镜、抗bBMP单克隆抗体(bBMP-McAb)ABC法免疫组化染色。X线能谱分析等检测。
四、主要试剂及仪器
bBMP-McAb由第四军医大学口腔医学院病理科提供，该抗体亚类为小鼠IgG2a，工作浓度为1∶200，ABC试剂盒为美国Vector公司产品，按ABC法一次完成。BMP定量分析采用MPV-3型显微分光光度计(德国)，应用点测量法，光栏0.022×0.008mm,V＝800V，I＝7.5A，f＝25×10，最大吸收波长λmax＝460nm，每张切片在骨界面随机选择25个点，然后进行统计学处理(方差分析)。X线能谱分析采用PSEM-500扫描电镜、EDAX-9100/75能量分散谱仪(德国)进行界面钙磷含量测定。
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结 果
一、光镜组织学观察
两组复合BMP的种植体在1周时界面可见新骨形成，8周时界面可见完整哈佛氏管，未复合BMP的两组种植体2周时界面有少量新骨形成，完整哈佛氏管在12周后才能见到(图1～4)。
图1 实验组1周时界面有新骨生成HE×33
图2 实验组1周时界面无新骨生成HE×33
, 百拇医药
图3 实验组8周时界面新骨成熟情况HE×66
图4 实验组8周时界面新骨成熟程度HE×33
二、BMP含量定量分析(附表)
三、X线能谱分析
两组复合BMP种植体的骨界面1周时可见有钙、磷的沉积，4～8周时界面钙磷含量与老骨相近，未复合BMP两组种植体，骨界面钙磷沉积于2周时开始，12周时方与老骨相近。涂层与未涂层微孔钛种植体，早期界面钙、磷的分布有所差异，生物陶瓷涂层组界面钙磷呈“V”形分布，而未涂层组是从骨缘向种植体缘从高至低的单向分布。
讨 论
Osborn和Newsly〔4〕根据材料的生物学特性把骨结合性种植体分为两类：生物惰性(bioinert)和生物活性(bioactive)，Meffert等〔5〕也陈述了相似的观点，提出了“适应性骨结合”(adaptive osseointegration)和“生物性结合”(biointegration)。微孔钛种植体是外形有别于Branemark种植体的另一种骨结合性种植体。球形粉制作的微孔种植体最早是由Hirschhorn等〔6〕报道的，首先应用于人工牙种植是Young〔7〕，采用钛铝钒合金。国内肖光裕等从1983年〔8～10〕起进行微孔钛种植体研究，取得了比较满意的效果。生物陶瓷如HA是一种在成分、结构与人体骨组织中钙盐一致的生物活性材料，把HA与金属种植体复合，涂层于表面，可改变金属种植体的生物相容性及与骨的结合方式，促使种植体与骨早期结合。Ducheyne和Cook等〔11，12〕观察到HA涂层种植体比相应未涂层金属种植体骨生长速度增快。一些研究也表明：HA与骨界面的结合强度，大于HA和骨各自的结合强度。
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BMP是一种早期高效诱导新骨生成的活性蛋白，当与微孔钛种植体及生物陶瓷涂层微孔钛种植体复合后，光镜可见1周就有新骨形成，8周时界面可见完整的哈佛氏系统，而相应未复合BMP种植体在2周时才有少量新骨形成，12周时界面新骨才基本成熟。骨界面BMP含量定量分析显示：复合BMP的两组种植体1周时BMP含量最高，与相应对照组比较有显著差异性(P<0.01)，与同组其它各期比较也有显著差异性(P<0.01)，未复合BMP的两组种植体BMP含量高峰在2周，与同组其它各期比较有显著差异性(P<0.01)，各组种植体的BMP总含量，复合BMP组略大于未复合BMP组，生物陶瓷涂层组略大于未涂层组，但各组间均无显著性差异(P>0.05)，说明BMP对早期新骨形成影响较大，对晚期新骨形成无显著性影响。X线能谱分析显示：界面钙磷开始沉积时间与BMP高峰期相一致，钙磷沉积含量复合BMP组4～8周时已接近老骨水平，而未复合BMP组在12周才与老骨钙磷水平相近。以上结果表明：(1)外源性BMP与内源性BMP作用时间点及新骨形成的启动机制有所差异，复合BMP种植体是一主动诱导成骨过程，而未复合BMP种植体，骨结合是一在体内多种因素作用下被动的自然修复与新骨形成过程；(2)生物陶瓷涂层与未涂层微孔钛种植体都是BMP的良好载体；(3)BMP与种植体的复合，界面成骨早、新骨成熟早1～2月，加速了种植体骨界面的结合速度，缩短了骨结合时间，有重要的临床意义；(4)生物陶瓷涂层与未涂层的微孔钛种植体两者有相似的生物相容性，均是适宜于临床应用的种植体。
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附表 四组不同种植体界面BMP含量测定(%，
±s) 组别1周
2周
4周
8周
12周
BMP/微孔钛组
23±13**
36±18
37±15
37±14
, 百拇医药
38±11
微孔钛组
47±23
26±13*
44±12
44±16
44±16
BMP/陶瓷涂层组
20±11**
33±10
35±8
36±13
, 百拇医药
36±10
生物陶瓷涂层组
46±10
23±8*
39±10
39±16
40±13
注：测定的为透光度，P<0.05 P<0.01
参 考 文 献
1 Branemark PI.Osseointegration and experimental back-ground.J Prosthet Dent,1983,50∶404.
, 百拇医药
2 Urist MR,Lietez A,Mizutani H,et al.A bovine low mo-lecular weight morphogenetic protein (BMP) fraction.Clin Orthop,1982,162∶219.
3 杨连甲，金 岩，孙庆妹，等。骨形成蛋白(BMP)的实验研究，实用口腔医学杂志，1987，3∶73.
4 Osbron JF,Newesly H. Dynamic aspects of the implant-bone interface.Dental implants,materials and systems.Munchen,Wien,Hanser Verlag,1980∶111.
5 Meffert RM,Block MS,Kent JN.What is osseointegration?Int J Periodont Rest Dent ,1987,4∶9.
, http://www.100md.com
6 Hirschhorn JS,Reynolds J.Powder metallurgy fadrica-tion of cobalt alloy surgical implant materials.In KorostoffE(ed):Research in dental and medical materi-als.New York.Plenum,1969∶137.
7 Young FA.Porous titanium tooth roots:clinical evaluation.J Prosthet Dent,1979,41∶561.
8 肖光裕，顾萘书，唐文杰，等。微孔钛在颌骨及牙槽内种植的实验研究。中华口腔医学杂志，1985，20∶357.
9 肖光裕，顾萘书，李俊良，等。微孔钛合金牙根种植的动物实验研究。实用口腔医学杂志，1987，3∶83.
, 百拇医药
10 肖光裕，郭庆科，李俊良，等。微孔钛种植体的实验研究及临床应用。现代口腔医学杂志，1991，5∶19.
11 Ducheyne P,Hench LL,Kagan A,et al.Effect of hydroxyapatite impregnation on skeletal bonding of po-rous coated implants. J Biomed Mater Res,1980,14∶225.
12 Pilliar RM.Porous-surfacld metallic implants for orthopedic applications. J Biomed Mater Res 1987,21∶20.
(收稿：1992-08-03 修回：1992-01-03), http://www.100md.com