3H－TdR掺入DNA技术的正确应用
作者：黄天贵 陈磊 架师鹏
单位：100083北京医科大学生物物理教研室(黄天贵、贺师鹏)，医疗系88级学生(陈磊)
关键词：
中华医学杂志930523 3H标记脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入DNA作为一种简便易行的衡量DNA合成速度及细胞增殖的方法，在生物医学的各个领域得到了广泛应用。3H-TdR掺入技术的理论是基于以下认识：胸腺嘧啶核苷是DNA补救合成途径的前体，可被细胞特异地掺入DNA；其掺入量与细胞合成DNA的速度呈正比，并反映细胞的增殖水平。随着研究的深入，不少作者在应用该技术时发现了意外的结果，故在60至70年代对该技术作了深入细致的探讨，并发现以往的认识并非绝对正确。遗憾的是，至今为数众多的学者仍简单地、不加分析地使用该技术。本文复习有关文献，旨在阐明3H-TdR掺入技术中不尽合理之处，以便更合理地使用。
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一、3H-TdR是否特异地掺入DNA
Marsh及Fox在60年代相继发现人白血病淋巴细胞及小鼠肝癌细胞在给3H-TdR后，在蛋白质及DNA上出现放射性。Bryant给小鼠注射3H-TdR后2小时发现肝脏和胰腺中DNA与蛋白质上的放射性计数比为5∶1，而脾和小肠中二者之比为35～40∶1，并推测蛋白质上的放射性来源于3H-TdR的降解，被降解下来的3H-甲基，通过特异或非特异的甲基化酶的作用而结合于蛋白质上〔1〕。 Goldspink等〔2〕把类似现象归结于以下两个原因：(1)3H-TdR上的3H转移到某些氨基酸上，其后掺入到蛋白质；(2)3H-TdR可非共价地结合在蛋白质上，并指出后者可能是主要机制。
3H-TdR掺入的非特异性程度因组织而异。1978年Twe等〔3〕用薄层色谱的方法对整体动物腹腔注射3H-TdR后不同组织中的不同放射性产物作了比较。结果表明，在一些快分裂组织中、如肿瘤和脾脏，DNA中放射性与总放射性之比分别为57%和82%，而蛋白质、RNA及脂类放射性分别为2.0%、10.5%和20.%；形成对比的是在慢分裂的组织如肝、肾仅有2.0%和2.5%的放射性在DNA中，而蛋白质、DNA的放射性分别为8.5%和10.5%。在肝、肾中，大部分的放射性以胸腺嘧啶核苷的不同代谢产物形式存在，如β-氨基异丁酸(β-AIB)、β-脲基异丁酸(β-UIB)和胸腺嘧啶。1990年Shields等〔4〕用高效液相色谱(HPLC)方法重复了上述工作，得到了类似结果。
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上述发现的意义在于：通常为了方便仅将三氯醋酸(TCA)不溶物直接消化后测放射性，并以此计算3H-TdR的比活度，但酸不溶物中除DNA外存在大分子的蛋白质、RNA等，这样可能过高估计3H-TdR的比活度；另外，3H-TdR与组织蛋白结合，使其实际剂量较设计用量减少，而现已证实DNA中3H的掺入量与3H-TdR剂量呈正比〔3〕。
二、3H-TdR是否会被降解
在利用标记前体的实验中，能否保证标记物在到达细胞之前不被代谢而保持原形，是至关重要的，以溶液形式贮存的3H-TdR可以发生辐射自分解，其产物胸腺嘧啶核苷乙二醇及胸腺嘧啶乙二酏可结合到核酸以外的大分子如蛋白质中，这样放射自显影显示胞浆被标记而胞核未被标记。解决这个问题的唯一方法是将杂质去除，并设立一个对照实验〔5〕，Tew等〔3〕强调使用新鲜3H-TdR。
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核苷磷酸化酶可将体内或细胞内的胸腺嘧啶核苷降解为胸腺嘧啶〔6〕，胸腺嘧啶又被还原为二氢胸腺嘧啶，继而生成β-AIB、β-UIB，最终代谢为CO2、H2O和NH3。代谢物都不能被重新利用而生成DNA，故核苷磷酸化酶对3H-TdR掺入的影响格外引人注意。Marsh报道了由于此酶的存在，慢性髓细胞性白血病(CML)患者淋巴细胞的3H-TdR掺入受抑制。降低培养基内的磷酸盐浓度可抑制核苷磷酸化酶的活性。Rubini发现外源性非标记TdR、 5-FU及MTX可提高狗骨髓细胞对3H-TdR的摄入，其中5-FU可使3H-TdR不被核苷磷酸化酶降解。
根据以上发现，Sims〔7〕改进了单核细胞转化试验的方法，提高了此方法的准确度和灵敏度。
三、掺入DNA的放射性是否与DNA合成速度及细胞增殖正相关
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掺入DNA的放射性正比于DNA合成速度这个结论并非绝对正确。外源性3H-TdR进入细胞可造成胞内TdR水平的涨落，促进或降低细胞对3H-TdR的摄取，但DNA合成速度不受影响。诸多证据表明：3H-TdR掺入取决于细胞内外TdR的水平〔8〕。
应强调的是，3H-TdR通过补救途径掺入DNA，而细胞更多的是通过从头合成途径合成DNA，因此从头合成的水平直接影响到3H-TdR的掺入量。MTX可阻断肿瘤细胞的从头合成，却导致补救合成关键酶胸腺嘧啶核苷激酶活性增加，使3H-TdR掺入增加〔9〕。
3H-TdR进入细胞是个主动运动过程，3H-TdR掺入不仅受细胞内外TdR水平的影响，还受主动运输过程的影响。烷化剂Trenimon等药物可抑制3H-TdR的运输，使细胞摄取TdR减少，而DNA合成不受抑制。
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以上事实证明：3H-TdR掺入的过程受多种因素影响，如对这些因素不加控制，3H-TdR掺入量并非一定与DNA合成呈正相关。
四、合理应用3H-TdR掺入技术
尽管3H-TdR掺入技术受诸多因素的影响，但因至今尚无更简便可行的测量DNA合成速度及细胞增殖的方法，目前仍被广泛使用。为此有必要对实验设计、具体步骤及结果分析等各个方面不利因素加以考虑，并力求避免。
在整体动物实验中，每个个体血液循环状况的差异、死亡细胞内TdR被其他细胞再利用等因素可能对实验结果带来较大的偏差〔10〕。其次不同种类的动物、不同的组织器官，甚至同一种动物的不同年龄阶段都可能影响3H-TdR掺入。有报道表明新生大鼠肺组用液闪测得的掺入值与用放射自显影得出的指数(LI)不相吻合，而在成熟大鼠二者则相符〔11〕。
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由于3H-TdR可掺入DNA以外的大分子，用TCA不溶物直接测放射性是不足取的，有必要对组织中DNA进行分离提纯。经典的Schimdt-Thanhauser法是值得推荐的。
通常用单位质量DNA的放射性即比活度表示掺入的量，有人提倡用掺入分数(FI)即组织中DNA上的放射性与总放射性之比来表示。Tew等〔3〕认为FI具有如下优点：FI大小与3H-TdR剂量无关，测FI时无需保持的细胞内3H-TdR浓度，无需考虑血液循环对3H-TdR分布的影响，还可降低对3H-TdR剂量精确度的要求。
综上所述，3H-TdR掺入技术存在较多缺陷，原因在于影响掺入的因素很复杂。但通过合理设计，改良实验步骤、全面分析结果，尽可能避免不利因素，在目前没有更简便易行的测量DNA合成及细胞增殖的方法的情况下，使此项技术得到更合理的应用。
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参考文献
1 Bryant BJ.The incorporation of tritiun from thymidine into protien of the mouse.J Cell BIol，1966，29：29.
2 Goldspink DF，Golderg AL.Problems in the use of Me-H thymidine for the measurement of DNA synthesis.Biochim Biophy Acta，1973，299：521.
3 Tew KD，Taylor DM.The relationship of thymidine metabolism to the use of fraction incorporation as a measure of DNA synthesis and tissue proliferation.Eurp J Nucl Med，1978，14：153.
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4 Shields AF，Lim K.Utilization of labeled thymidine in DNA synthesis：study for PET.J Nucl Med，1990，31：279.
5 Mmaurer HR.Potential pitfalls of H-thymidine techniques to measure cell proliferation.Cell Tissue Kinet，1981，14：317.
6 顾天爵主编.生物化学.第3版.北京：人民卫生出版社，1982：282-283。
7 Sims TJ，Page RC.An improved method for assessing the incorporation of labeled precursors into DNA by human mononuclear cells.J Immunol Method，1984，67：255.
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8 Kasahara T，Shiori-Nakane K.Splenic suppressing factor：purification and characterization of a factor supprossing thymidine incorporation into activated lymphocytes.J Immunol，1976，116：1251.
9 Tew KD，Taylar DM.Rhe effect of methotrexate on the up take of de novo and salvage precursors into the DNA of rat tumors and normal tissues.Eur J Cancer，1977，13：279.
10 Shields AF，Coonrod DV，Quadenbush RC，et al.Cellular sources of thymidine nucleotides studies for PET.J Nucl Med，1987，28：1435.
11 Simnett JD，Fisher DM.The relation between cell division rate and H-TdR incorporation in organ culture.J Cell Physiol，1973，81：171.
(收稿：1992-07-25 修回：1993-02-14), http://www.100md.com
单位：100083北京医科大学生物物理教研室(黄天贵、贺师鹏)，医疗系88级学生(陈磊)
关键词：
中华医学杂志930523 3H标记脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入DNA作为一种简便易行的衡量DNA合成速度及细胞增殖的方法，在生物医学的各个领域得到了广泛应用。3H-TdR掺入技术的理论是基于以下认识：胸腺嘧啶核苷是DNA补救合成途径的前体，可被细胞特异地掺入DNA；其掺入量与细胞合成DNA的速度呈正比，并反映细胞的增殖水平。随着研究的深入，不少作者在应用该技术时发现了意外的结果，故在60至70年代对该技术作了深入细致的探讨，并发现以往的认识并非绝对正确。遗憾的是，至今为数众多的学者仍简单地、不加分析地使用该技术。本文复习有关文献，旨在阐明3H-TdR掺入技术中不尽合理之处，以便更合理地使用。
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一、3H-TdR是否特异地掺入DNA
Marsh及Fox在60年代相继发现人白血病淋巴细胞及小鼠肝癌细胞在给3H-TdR后，在蛋白质及DNA上出现放射性。Bryant给小鼠注射3H-TdR后2小时发现肝脏和胰腺中DNA与蛋白质上的放射性计数比为5∶1，而脾和小肠中二者之比为35～40∶1，并推测蛋白质上的放射性来源于3H-TdR的降解，被降解下来的3H-甲基，通过特异或非特异的甲基化酶的作用而结合于蛋白质上〔1〕。 Goldspink等〔2〕把类似现象归结于以下两个原因：(1)3H-TdR上的3H转移到某些氨基酸上，其后掺入到蛋白质；(2)3H-TdR可非共价地结合在蛋白质上，并指出后者可能是主要机制。
3H-TdR掺入的非特异性程度因组织而异。1978年Twe等〔3〕用薄层色谱的方法对整体动物腹腔注射3H-TdR后不同组织中的不同放射性产物作了比较。结果表明，在一些快分裂组织中、如肿瘤和脾脏，DNA中放射性与总放射性之比分别为57%和82%，而蛋白质、RNA及脂类放射性分别为2.0%、10.5%和20.%；形成对比的是在慢分裂的组织如肝、肾仅有2.0%和2.5%的放射性在DNA中，而蛋白质、DNA的放射性分别为8.5%和10.5%。在肝、肾中，大部分的放射性以胸腺嘧啶核苷的不同代谢产物形式存在，如β-氨基异丁酸(β-AIB)、β-脲基异丁酸(β-UIB)和胸腺嘧啶。1990年Shields等〔4〕用高效液相色谱(HPLC)方法重复了上述工作，得到了类似结果。
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上述发现的意义在于：通常为了方便仅将三氯醋酸(TCA)不溶物直接消化后测放射性，并以此计算3H-TdR的比活度，但酸不溶物中除DNA外存在大分子的蛋白质、RNA等，这样可能过高估计3H-TdR的比活度；另外，3H-TdR与组织蛋白结合，使其实际剂量较设计用量减少，而现已证实DNA中3H的掺入量与3H-TdR剂量呈正比〔3〕。
二、3H-TdR是否会被降解
在利用标记前体的实验中，能否保证标记物在到达细胞之前不被代谢而保持原形，是至关重要的，以溶液形式贮存的3H-TdR可以发生辐射自分解，其产物胸腺嘧啶核苷乙二醇及胸腺嘧啶乙二酏可结合到核酸以外的大分子如蛋白质中，这样放射自显影显示胞浆被标记而胞核未被标记。解决这个问题的唯一方法是将杂质去除，并设立一个对照实验〔5〕，Tew等〔3〕强调使用新鲜3H-TdR。
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核苷磷酸化酶可将体内或细胞内的胸腺嘧啶核苷降解为胸腺嘧啶〔6〕，胸腺嘧啶又被还原为二氢胸腺嘧啶，继而生成β-AIB、β-UIB，最终代谢为CO2、H2O和NH3。代谢物都不能被重新利用而生成DNA，故核苷磷酸化酶对3H-TdR掺入的影响格外引人注意。Marsh报道了由于此酶的存在，慢性髓细胞性白血病(CML)患者淋巴细胞的3H-TdR掺入受抑制。降低培养基内的磷酸盐浓度可抑制核苷磷酸化酶的活性。Rubini发现外源性非标记TdR、 5-FU及MTX可提高狗骨髓细胞对3H-TdR的摄入，其中5-FU可使3H-TdR不被核苷磷酸化酶降解。
根据以上发现，Sims〔7〕改进了单核细胞转化试验的方法，提高了此方法的准确度和灵敏度。
三、掺入DNA的放射性是否与DNA合成速度及细胞增殖正相关
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掺入DNA的放射性正比于DNA合成速度这个结论并非绝对正确。外源性3H-TdR进入细胞可造成胞内TdR水平的涨落，促进或降低细胞对3H-TdR的摄取，但DNA合成速度不受影响。诸多证据表明：3H-TdR掺入取决于细胞内外TdR的水平〔8〕。
应强调的是，3H-TdR通过补救途径掺入DNA，而细胞更多的是通过从头合成途径合成DNA，因此从头合成的水平直接影响到3H-TdR的掺入量。MTX可阻断肿瘤细胞的从头合成，却导致补救合成关键酶胸腺嘧啶核苷激酶活性增加，使3H-TdR掺入增加〔9〕。
3H-TdR进入细胞是个主动运动过程，3H-TdR掺入不仅受细胞内外TdR水平的影响，还受主动运输过程的影响。烷化剂Trenimon等药物可抑制3H-TdR的运输，使细胞摄取TdR减少，而DNA合成不受抑制。
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以上事实证明：3H-TdR掺入的过程受多种因素影响，如对这些因素不加控制，3H-TdR掺入量并非一定与DNA合成呈正相关。
四、合理应用3H-TdR掺入技术
尽管3H-TdR掺入技术受诸多因素的影响，但因至今尚无更简便可行的测量DNA合成速度及细胞增殖的方法，目前仍被广泛使用。为此有必要对实验设计、具体步骤及结果分析等各个方面不利因素加以考虑，并力求避免。
在整体动物实验中，每个个体血液循环状况的差异、死亡细胞内TdR被其他细胞再利用等因素可能对实验结果带来较大的偏差〔10〕。其次不同种类的动物、不同的组织器官，甚至同一种动物的不同年龄阶段都可能影响3H-TdR掺入。有报道表明新生大鼠肺组用液闪测得的掺入值与用放射自显影得出的指数(LI)不相吻合，而在成熟大鼠二者则相符〔11〕。
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由于3H-TdR可掺入DNA以外的大分子，用TCA不溶物直接测放射性是不足取的，有必要对组织中DNA进行分离提纯。经典的Schimdt-Thanhauser法是值得推荐的。
通常用单位质量DNA的放射性即比活度表示掺入的量，有人提倡用掺入分数(FI)即组织中DNA上的放射性与总放射性之比来表示。Tew等〔3〕认为FI具有如下优点：FI大小与3H-TdR剂量无关，测FI时无需保持的细胞内3H-TdR浓度，无需考虑血液循环对3H-TdR分布的影响，还可降低对3H-TdR剂量精确度的要求。
综上所述，3H-TdR掺入技术存在较多缺陷，原因在于影响掺入的因素很复杂。但通过合理设计，改良实验步骤、全面分析结果，尽可能避免不利因素，在目前没有更简便易行的测量DNA合成及细胞增殖的方法的情况下，使此项技术得到更合理的应用。
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参考文献
1 Bryant BJ.The incorporation of tritiun from thymidine into protien of the mouse.J Cell BIol，1966，29：29.
2 Goldspink DF，Golderg AL.Problems in the use of Me-H thymidine for the measurement of DNA synthesis.Biochim Biophy Acta，1973，299：521.
3 Tew KD，Taylor DM.The relationship of thymidine metabolism to the use of fraction incorporation as a measure of DNA synthesis and tissue proliferation.Eurp J Nucl Med，1978，14：153.
, http://www.100md.com
4 Shields AF，Lim K.Utilization of labeled thymidine in DNA synthesis：study for PET.J Nucl Med，1990，31：279.
5 Mmaurer HR.Potential pitfalls of H-thymidine techniques to measure cell proliferation.Cell Tissue Kinet，1981，14：317.
6 顾天爵主编.生物化学.第3版.北京：人民卫生出版社，1982：282-283。
7 Sims TJ，Page RC.An improved method for assessing the incorporation of labeled precursors into DNA by human mononuclear cells.J Immunol Method，1984，67：255.
, http://www.100md.com
8 Kasahara T，Shiori-Nakane K.Splenic suppressing factor：purification and characterization of a factor supprossing thymidine incorporation into activated lymphocytes.J Immunol，1976，116：1251.
9 Tew KD，Taylar DM.Rhe effect of methotrexate on the up take of de novo and salvage precursors into the DNA of rat tumors and normal tissues.Eur J Cancer，1977，13：279.
10 Shields AF，Coonrod DV，Quadenbush RC，et al.Cellular sources of thymidine nucleotides studies for PET.J Nucl Med，1987，28：1435.
11 Simnett JD，Fisher DM.The relation between cell division rate and H-TdR incorporation in organ culture.J Cell Physiol，1973，81：171.
(收稿：1992-07-25 修回：1993-02-14), http://www.100md.com