牛磺酸抗肝脏缺血再灌注损伤及其机理的实验研究
作者：陈岳祥 王慎传 赵国宁 孙田美 张灵芝 汤健 唐朝枢
单位：710038西安市，第四军医大学唐都医院消化科(陈岳祥，王慎传，赵国宁，孙田美)；北京医科大学心肺内分泌研究室(张灵芝，汤健，唐朝枢)
关键词：氨基酸类，二氨基；肝；血液灌注；脂质过氧化物
中华医学杂志930507 摘要 在原位灌注的大鼠肝脏缺血再灌注(I/R)模型上观察到，再灌注同时给予20mmol/L牛磺酸可明显减轻再灌注对缺氧肝脏的损伤，显著抑制肝组织过氧化脂质的生成，降低线粒体内钙含量，减少细胞内蛋白和酶的漏出。体外实验发现，牛磺酸对大鼠肝细胞质膜用氧自由基发生系统诱导的脂质过氧化(LPO)有明显的抑制效应；能显著地抑制离体肝脏线粒体钙的摄入，促进线粒体内钙的释放；并对大鼠肝脏溶酶体具有直接的稳膜作用。结果表明，牛磺酸可有效防治I/R造成的肝脶伤，其抗损伤作用的机理可能主要与抑制LPO、调节细胞钙稳态和稳定细胞膜的功能有关。
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牛磺酸(Taurine)，又名2-氨基乙烷亚磺酸，是细胞内含量最高的游离氨基酸。过去认为牛磺酸是含硫氨基酸的无功能的终末代谢产物，但近年来研究证明它具有平衡细胞渗透压、维持细胞膜稳定性、调节细胞钙稳态和对抗氧自由基损伤等细胞保护作用〔1〕。本实验在原位灌流的大鼠肝肝缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)模型上，观察牛磺酸对I/R损伤的影响，并在亚细胞及膜水平上对其抗损伤作用的可能机理进行探讨，旨在为临床应用牛磺酸治疗I/R肝脶伤提供实验依据。
材料和方法
一、药品及动物
牛磺酸，酪氨酸，牛血清白蛋白，血红蛋白底物，钌红(Rethenium red)，Tris-ATP,EGTA无为Sigma公司产品；45CaCl2购自Amersham公司；L(+)抗坏血酸和硫酸亚铁分别由东北制药总厂一分厂和北京红星化工厂提供；其它试剂均系国产分析纯。
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雄性Wistar大鼠，体重250～300g，由北京医科大学实验动物部提供。
二、观察指标及实验方法
1.牛磺酸对肝脏I/R损伤的影响：大鼠用20%乌拉坦麻醉(5ml/kg)，肝素抗凝(1000U/kg)。作腹正中切口后，行门静脉插管，进行肝脏原位灌注〔2〕。灌注液为37℃经95% O2-5% CO2平衡的Krebs-Henseleit(K-H)液，其中氯化钙浓度为2mmol/L；灌注压维持0.20kPa恒定。灌注液从下腔静脉逆行插管中流出。预灌注15分钟后停止，旷置肝脏90分钟(保温保湿)。随机分为对照组和牛磺酸组，每组6例，分别用K-H液或含有牛磺酸20mmol/L的K-H液再灌15分钟。另取4只大鼠作为单纯灌流组，持续用K-H液灌注120分钟。
灌注结束后，留取肝静脉流出液测定脂质过氧化终产物(MDA)含量〔3〕、蛋白含量〔4〕和LDH活性〔5〕。取右叶肝脏，称重、烤干后，测定水含量。取中叶肝脏制成组织匀浆，测定MDA含量；应用差速离心法分离肝脏线粒体〔6〕，经硝酸加热消化后，原子吸收分光光度计测定钙含量。
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2.牛磺酸对氧自由基发生系统(GSFR)诱导离体大鼠肝细胞质膜脂过氧化(LPO)生成的影响：取大鼠肝脏，差速离心法制备肝细胞粗制质膜〔7〕。将得到的肝细胞粗质膜沉淀用1.15%KCl缓冲液悬浮，分置于小试管内(4mg.Pr/tube)，加入FeSO4和抗坏血酸(终浓度分别为0.1和0.5mmol/L)以及牛磺酸(终浓度各为5、10、20mmol/L)，每次实验设不含牛磺酸的对照管。将上述各管置于恒温箱振荡，37℃分别孵育5、10、15分钟。孵育后立即加入4℃硫代巴比妥酸液，测定MDA含量〔5〕。4次实验，每次同时作两平行管。
3.牛磺酸对离体大鼠肝脏线粒体钙摄取和释放的影响：断头处死大鼠后摘取肝脏，差速离心分离肝脏线粒体〔6〕。将沉淀悬浮于STE缓冲液(250mmol/L Sucrose,10mmol/L Tris-HCl, 0.25mmol/L EDTA, pH7.4)备用。全部操作在4℃进行。
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对线粒体钙摄取的影响：参照Buss等〔8〕的方法，将分离的线粒体悬液分置于试管中(0.58mg.Pr/tube)，分别加入下列反应液(mmol/L):Tris-ATP9.0，α-酮戊二酸15.0，MgCl2 3.0，KCl 80.0和Tris 30.0。牛磺酸组在反应体系加入牛磺酸，终浓度分别为5、10、20mmol/L，对照组不加牛磺酸。反应容积为0.6ml/tube。上述各管30℃振荡水浴10分钟后，加入10μmol/L45CaCl2[含45Ca2+74kBq(2μCi)]再孵育5分钟后，加6ml冷冲洗液(250mmol/L蔗糖)，在Milipore细胞收集器上经微孔滤膜(0.22μm)抽滤，再反复冲洗2次，滤膜经加入闪烁液，在液闪计数仪上测定45Ca2+的放射活性。
对线粒体钙释放的影响：按上述方法将线粒体蛋白与反应孵育10分钟后，加入10μmol/L 45CaCl2[含45Ca2+74kBq(2μCi)]，继续孵育20分钟，加1mmol/L钌红以终止Ca2+摄入，8分钟后，牛磺酸组分别加入5、10、20mmol/L牛磺酸，对照组以STE缓冲液代替牛磺酸。再孵育8分钟后，各管加10mmol/L NaCl以促使线粒体内Ca2+释放，3分钟后按前述方法冲洗，抽滤后测45Ca2+的放射活性。重复4次实验，每次设两平行管。
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4.牛磺酸对大鼠肝脏溶酶体的稳膜作用：差速离心分离大鼠肝脏溶酶体〔9〕，得到的沉淀用冷蔗糖缓冲液(250mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl,pH7.4)悬浮，分置于小试管内(1mg.Pr/tube)，加入牛磺酸(终浓度分别为5、10、20mmol/L)，并设不含牛磺酸的对照管。将上述各管37℃恒温振荡水浴30分钟，然后于1600g，4℃离心20分钟，取上清液测定组织蛋白酶D(Cath-D)活性，为游离Cath-D，表示30分钟湿浴期间从溶酶体内释放出来的酶活性。用含1% Triton X-100的庶糖缓冲液重新悬浮沉淀，37℃温浴30分钟后，再次离心(条件同前)。取最后的上清液测定Cath-D，为Cath-D，表示第一次温浴后仍留在溶酶体内的酶活性(第二次温浴时Triton溶解溶酶体膜引起Cath-D漏出)。Cath-D活性按Anson方法〔10〕测定。游离和结合Cath-D活性的总和为溶酶体Cath-D总活性。4次实验，每次同时作两平行管。
实验结果以均数±标准误表示，Student′s t检验作统计学处理。
, 百拇医药
结 果
一、牛磺酸对肝脏I/R损伤的影响
对照组肝脏I/R后，肝静脉流出液MDA含量、蛋白含量和LDH活性都显著增加，分别较单纯灌流组增加1.92、2.48和2.48倍(P<0.01)，(表1)。然而牛磺酸治疗，明显降低缺血肝脏再灌流时流出液中MDA含量、蛋白含量和LDH活性，分别为对照组的65.85%(P<0.01)、70.5%(P<0.05)和68.01%(P<0.05)。
表1 实验各组肝脏灌注液MDA含量、蛋白含量和LDH活性 组别
鼠数
水含量(%)
蛋白含量(μgml)
LDH活性(mU/ml)
, 百拇医药
单纯灌注组
4
1.48±0.13
23±4
145±16
对 照 组
6
2.84±0.23
57±7**
360±25**
牛磺酸组
6
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1.87±0.18
40±5△
248±16△
**P <0.01 与单纯灌流组相比较
△P<0.05△△P <0.01，与对照相相比较
缺血肝脏再灌注后(对照组)，其肝组织含水量、MDA含量和线粒体钙含量显著增加，分别较单纯灌注组升高10.92%、60.11%和497.03%(P<0.01)。牛磺酸可减轻再灌注对肝脏的损伤，使肝脏水含量、MDA含量和线粒体钙含量明显减少，分别较对照组降低2.89%、17.60%和79.37%(P<0.01)，(表2)。
表2 实验各组肝脏含水量、MDA含量和线粒体钙含量
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组别
鼠数
水含量(%)
MDA含量(nmol/g.w.w)
钙含量(μmol/mg.Pr)
单纯灌注组
4
72.4±0.3
280±30
9.4±2.1
对 照 组
, http://www.100md.com 6
80.3±0.7
448±18**
56.2±9.3**
牛磺酸组
6
77.9±0.5
369±15△△
11.9±1.9△△
注释同表1
二、对肝细胞质膜LPO的影响
, 百拇医药
当加入GSFR(Fe2+-抗坏血酸)与肝细胞质膜孵化5、10、15分钟后，MDA含量显著增加，分别为3.19±0.04、5.00±0.17和8.76±0.64nmol/mg.Pro。加入20mmol/L牛磺酸同时孵化则明显抑制GSFR引起的LPO，并呈时间依赖关系(分别抑制33.74%、59.63%和68.73%)。
牛磺酸对肝细胞质膜LPO的生成亦呈剂量依赖的抑制效应。牛磺酸为5、10、20mmol/L时，MDA含量分别较对照组减少10.56%、45.08%和59.61%，各组间差异有非常显著意义(P<0.01)。
三、对肝脏线粒体钙摄取和释放的影响
牛磺酸显著抑制线粒体钙摄入和促进线粒体钙释放，呈量-效关系：5、10、20mmol/L牛磺酸时，钙摄取分别抑制4.46%、12.71%和46.65%(P<0.01)；钙释放分别增加24.25%(P<0.05)、52.58%和52.67%(P<0.01)。
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四、对肝脏溶酶体的稳膜作用
离体大鼠肝脏溶酶体37℃孵育30分钟(对照组)，释放的游离Cath-D活性为34.37±1.01U/ml，释放率(游离占总酶活性百分比)为97.47%。加入牛磺酸5、10、20mmol/L同时孵育，游离Cath-D活性则明显下降，分别较对照组减少44.11%、84.20%和89.29%(P<0.01)；Cath-D释放率亦明显降低，分别为56.44%、15.16%和10.41%，较对照组有显著性差异(P<0.01)且呈量效关系。
讨 论
缺血肝脏再灌注后，常发生组织、细胞的严重损伤，对此，临床上尚缺乏有效的防治措施。牛磺酸是体内含量最丰富的、含硫的自由氨基酸，具有抗脂质过氧化损伤、调节细胞钙稳态和稳定细胞膜等生物学功能，是机体自身重要的细胞保护性物质〔1〕。我们以前的工作证实，牛磺酸可有效防治四氯化碳所致的肝损伤，显著降低ALT活性和肝脏MDA及Ca2+〔11〕。本实验在大鼠原位灌流的肝脏I/R模型上发现，再灌注同时给予牛磺酸明显减轻再灌注对缺氧肝脏的损伤，抑制肝组织过氧化脂质的生成；减少肝细胞线粒体钙含量；同时抑制细胞内蛋白和酶(LDH)的漏出。结果表明牛磺酸亦具有抗再灌注损伤的作用。
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牛磺酸保护肝脏的机理尚不十分清楚。已知再灌注引起大量氧自由基的产生、进而发生脂质过氧化，以及引起细胞内Ca2+超载是造成缺血肝脏再灌注损伤的最重要的因素〔2，12〕。本实验中观察到，牛磺酸抑制I/R肝损伤时MDA的生成，降低细胞钙含量。体外实验进一步发现，牛磺酸对大鼠肝细胞质膜用氧自由基发生系统诱导的LPO有明显的抑制效应，并抑制离体肝脏线粒体钙的摄入，促进线粒体内钙的释放。提示牛磺酸可能通过清除氧自由基和抑制细胞内钙聚积而减轻再灌注造成的损伤。本实验还发现，牛磺酸对离体大鼠肝脏溶酶体具有直接的稳膜作用，能有效抑制胞内蛋白和酶的漏出。
总之，上述实验证实牛磺酸对I/R造成的肝损伤具有明显的防治效应，而其抗损伤作用的机理可能主要与抑制脂质过氧化、调节细胞钙稳态和稳定细胞膜的功能有关。这些结果提示，牛磺酸作为细胞保护剂，对于防治肝脏I/R损伤，可能具有一定的临床意义和应用前景。
参考文献
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1 刘庆德，唐朝枢.牛磺酸的生物学效应.国外医学生理、病理科学与临床分册，1991.11：6.
2 Metzger J,Srinath P,Dore H,et al.Oxidant stress during reperfusion of ischemic liver.Hepatology,1988,8:580.
3 Asakawa T,Matshusita S.Thiobarbituric acids test for detecting lipid peroxides.Lipid,1979,14:401.
4 Bradford MM.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Annl Biochem,1976,72:248.
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5 Worbleski E,Ladue GS.Lactate dehydrogenase activity in blood.Proc Soc Exp Med,1955,90:210.
6 Allshire AP,Heffrom JJA.Uptake,retention and efflux of calcium by mitochondrial proeparations from skeletal muscule.Arch Biochem Biophys,1984,228:353.
7 Liu MS,Ghosh S.Changes in β-adrenergic receptors in dog livers during endotoxin shock.Am J Physiol,1983,244:R718.
8 Buss WC,Savage DD,Stepanek J,et al.Effect of calcium channel antagonists on calcium uptake and release by isolated rat cardiac mitochondria.Eur J Pharmaco,1988,152:247.
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9 Curits MT,Lefer AM.Protective action of nalotone in hemorrhagic shock.Am J Physiol,1980,239:H416.
10 Anson ML.Estimation of cathepsin with hemolgobin and partial purification of cathepsin.J Gen Physiol,1937,20:565.
11 陈岳祥，王慎传，赵国宁，等.牛磺酸对CCl4所致大鼠肝损伤的保护作用.第四军医大学学报，1992，13：184.
12 苏静怡，唐朝枢.缺血再灌注损伤的普遍性及其临床意义.北京医科大学学报，1990，22：149
(收稿：1992-05-28 修回：1993-02-27), http://www.100md.com
单位：710038西安市，第四军医大学唐都医院消化科(陈岳祥，王慎传，赵国宁，孙田美)；北京医科大学心肺内分泌研究室(张灵芝，汤健，唐朝枢)
关键词：氨基酸类，二氨基；肝；血液灌注；脂质过氧化物
中华医学杂志930507 摘要 在原位灌注的大鼠肝脏缺血再灌注(I/R)模型上观察到，再灌注同时给予20mmol/L牛磺酸可明显减轻再灌注对缺氧肝脏的损伤，显著抑制肝组织过氧化脂质的生成，降低线粒体内钙含量，减少细胞内蛋白和酶的漏出。体外实验发现，牛磺酸对大鼠肝细胞质膜用氧自由基发生系统诱导的脂质过氧化(LPO)有明显的抑制效应；能显著地抑制离体肝脏线粒体钙的摄入，促进线粒体内钙的释放；并对大鼠肝脏溶酶体具有直接的稳膜作用。结果表明，牛磺酸可有效防治I/R造成的肝脶伤，其抗损伤作用的机理可能主要与抑制LPO、调节细胞钙稳态和稳定细胞膜的功能有关。
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牛磺酸(Taurine)，又名2-氨基乙烷亚磺酸，是细胞内含量最高的游离氨基酸。过去认为牛磺酸是含硫氨基酸的无功能的终末代谢产物，但近年来研究证明它具有平衡细胞渗透压、维持细胞膜稳定性、调节细胞钙稳态和对抗氧自由基损伤等细胞保护作用〔1〕。本实验在原位灌流的大鼠肝肝缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)模型上，观察牛磺酸对I/R损伤的影响，并在亚细胞及膜水平上对其抗损伤作用的可能机理进行探讨，旨在为临床应用牛磺酸治疗I/R肝脶伤提供实验依据。
材料和方法
一、药品及动物
牛磺酸，酪氨酸，牛血清白蛋白，血红蛋白底物，钌红(Rethenium red)，Tris-ATP,EGTA无为Sigma公司产品；45CaCl2购自Amersham公司；L(+)抗坏血酸和硫酸亚铁分别由东北制药总厂一分厂和北京红星化工厂提供；其它试剂均系国产分析纯。
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雄性Wistar大鼠，体重250～300g，由北京医科大学实验动物部提供。
二、观察指标及实验方法
1.牛磺酸对肝脏I/R损伤的影响：大鼠用20%乌拉坦麻醉(5ml/kg)，肝素抗凝(1000U/kg)。作腹正中切口后，行门静脉插管，进行肝脏原位灌注〔2〕。灌注液为37℃经95% O2-5% CO2平衡的Krebs-Henseleit(K-H)液，其中氯化钙浓度为2mmol/L；灌注压维持0.20kPa恒定。灌注液从下腔静脉逆行插管中流出。预灌注15分钟后停止，旷置肝脏90分钟(保温保湿)。随机分为对照组和牛磺酸组，每组6例，分别用K-H液或含有牛磺酸20mmol/L的K-H液再灌15分钟。另取4只大鼠作为单纯灌流组，持续用K-H液灌注120分钟。
灌注结束后，留取肝静脉流出液测定脂质过氧化终产物(MDA)含量〔3〕、蛋白含量〔4〕和LDH活性〔5〕。取右叶肝脏，称重、烤干后，测定水含量。取中叶肝脏制成组织匀浆，测定MDA含量；应用差速离心法分离肝脏线粒体〔6〕，经硝酸加热消化后，原子吸收分光光度计测定钙含量。
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2.牛磺酸对氧自由基发生系统(GSFR)诱导离体大鼠肝细胞质膜脂过氧化(LPO)生成的影响：取大鼠肝脏，差速离心法制备肝细胞粗制质膜〔7〕。将得到的肝细胞粗质膜沉淀用1.15%KCl缓冲液悬浮，分置于小试管内(4mg.Pr/tube)，加入FeSO4和抗坏血酸(终浓度分别为0.1和0.5mmol/L)以及牛磺酸(终浓度各为5、10、20mmol/L)，每次实验设不含牛磺酸的对照管。将上述各管置于恒温箱振荡，37℃分别孵育5、10、15分钟。孵育后立即加入4℃硫代巴比妥酸液，测定MDA含量〔5〕。4次实验，每次同时作两平行管。
3.牛磺酸对离体大鼠肝脏线粒体钙摄取和释放的影响：断头处死大鼠后摘取肝脏，差速离心分离肝脏线粒体〔6〕。将沉淀悬浮于STE缓冲液(250mmol/L Sucrose,10mmol/L Tris-HCl, 0.25mmol/L EDTA, pH7.4)备用。全部操作在4℃进行。
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对线粒体钙摄取的影响：参照Buss等〔8〕的方法，将分离的线粒体悬液分置于试管中(0.58mg.Pr/tube)，分别加入下列反应液(mmol/L):Tris-ATP9.0，α-酮戊二酸15.0，MgCl2 3.0，KCl 80.0和Tris 30.0。牛磺酸组在反应体系加入牛磺酸，终浓度分别为5、10、20mmol/L，对照组不加牛磺酸。反应容积为0.6ml/tube。上述各管30℃振荡水浴10分钟后，加入10μmol/L45CaCl2[含45Ca2+74kBq(2μCi)]再孵育5分钟后，加6ml冷冲洗液(250mmol/L蔗糖)，在Milipore细胞收集器上经微孔滤膜(0.22μm)抽滤，再反复冲洗2次，滤膜经加入闪烁液，在液闪计数仪上测定45Ca2+的放射活性。
对线粒体钙释放的影响：按上述方法将线粒体蛋白与反应孵育10分钟后，加入10μmol/L 45CaCl2[含45Ca2+74kBq(2μCi)]，继续孵育20分钟，加1mmol/L钌红以终止Ca2+摄入，8分钟后，牛磺酸组分别加入5、10、20mmol/L牛磺酸，对照组以STE缓冲液代替牛磺酸。再孵育8分钟后，各管加10mmol/L NaCl以促使线粒体内Ca2+释放，3分钟后按前述方法冲洗，抽滤后测45Ca2+的放射活性。重复4次实验，每次设两平行管。
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4.牛磺酸对大鼠肝脏溶酶体的稳膜作用：差速离心分离大鼠肝脏溶酶体〔9〕，得到的沉淀用冷蔗糖缓冲液(250mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl,pH7.4)悬浮，分置于小试管内(1mg.Pr/tube)，加入牛磺酸(终浓度分别为5、10、20mmol/L)，并设不含牛磺酸的对照管。将上述各管37℃恒温振荡水浴30分钟，然后于1600g，4℃离心20分钟，取上清液测定组织蛋白酶D(Cath-D)活性，为游离Cath-D，表示30分钟湿浴期间从溶酶体内释放出来的酶活性。用含1% Triton X-100的庶糖缓冲液重新悬浮沉淀，37℃温浴30分钟后，再次离心(条件同前)。取最后的上清液测定Cath-D，为Cath-D，表示第一次温浴后仍留在溶酶体内的酶活性(第二次温浴时Triton溶解溶酶体膜引起Cath-D漏出)。Cath-D活性按Anson方法〔10〕测定。游离和结合Cath-D活性的总和为溶酶体Cath-D总活性。4次实验，每次同时作两平行管。
实验结果以均数±标准误表示，Student′s t检验作统计学处理。
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结 果
一、牛磺酸对肝脏I/R损伤的影响
对照组肝脏I/R后，肝静脉流出液MDA含量、蛋白含量和LDH活性都显著增加，分别较单纯灌流组增加1.92、2.48和2.48倍(P<0.01)，(表1)。然而牛磺酸治疗，明显降低缺血肝脏再灌流时流出液中MDA含量、蛋白含量和LDH活性，分别为对照组的65.85%(P<0.01)、70.5%(P<0.05)和68.01%(P<0.05)。
表1 实验各组肝脏灌注液MDA含量、蛋白含量和LDH活性 组别
鼠数
水含量(%)
蛋白含量(μgml)
LDH活性(mU/ml)
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单纯灌注组
4
1.48±0.13
23±4
145±16
对 照 组
6
2.84±0.23
57±7**
360±25**
牛磺酸组
6
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1.87±0.18
40±5△
248±16△
**P <0.01 与单纯灌流组相比较
△P<0.05△△P <0.01，与对照相相比较
缺血肝脏再灌注后(对照组)，其肝组织含水量、MDA含量和线粒体钙含量显著增加，分别较单纯灌注组升高10.92%、60.11%和497.03%(P<0.01)。牛磺酸可减轻再灌注对肝脏的损伤，使肝脏水含量、MDA含量和线粒体钙含量明显减少，分别较对照组降低2.89%、17.60%和79.37%(P<0.01)，(表2)。
表2 实验各组肝脏含水量、MDA含量和线粒体钙含量
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组别
鼠数
水含量(%)
MDA含量(nmol/g.w.w)
钙含量(μmol/mg.Pr)
单纯灌注组
4
72.4±0.3
280±30
9.4±2.1
对 照 组
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80.3±0.7
448±18**
56.2±9.3**
牛磺酸组
6
77.9±0.5
369±15△△
11.9±1.9△△
注释同表1
二、对肝细胞质膜LPO的影响
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当加入GSFR(Fe2+-抗坏血酸)与肝细胞质膜孵化5、10、15分钟后，MDA含量显著增加，分别为3.19±0.04、5.00±0.17和8.76±0.64nmol/mg.Pro。加入20mmol/L牛磺酸同时孵化则明显抑制GSFR引起的LPO，并呈时间依赖关系(分别抑制33.74%、59.63%和68.73%)。
牛磺酸对肝细胞质膜LPO的生成亦呈剂量依赖的抑制效应。牛磺酸为5、10、20mmol/L时，MDA含量分别较对照组减少10.56%、45.08%和59.61%，各组间差异有非常显著意义(P<0.01)。
三、对肝脏线粒体钙摄取和释放的影响
牛磺酸显著抑制线粒体钙摄入和促进线粒体钙释放，呈量-效关系：5、10、20mmol/L牛磺酸时，钙摄取分别抑制4.46%、12.71%和46.65%(P<0.01)；钙释放分别增加24.25%(P<0.05)、52.58%和52.67%(P<0.01)。
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四、对肝脏溶酶体的稳膜作用
离体大鼠肝脏溶酶体37℃孵育30分钟(对照组)，释放的游离Cath-D活性为34.37±1.01U/ml，释放率(游离占总酶活性百分比)为97.47%。加入牛磺酸5、10、20mmol/L同时孵育，游离Cath-D活性则明显下降，分别较对照组减少44.11%、84.20%和89.29%(P<0.01)；Cath-D释放率亦明显降低，分别为56.44%、15.16%和10.41%，较对照组有显著性差异(P<0.01)且呈量效关系。
讨 论
缺血肝脏再灌注后，常发生组织、细胞的严重损伤，对此，临床上尚缺乏有效的防治措施。牛磺酸是体内含量最丰富的、含硫的自由氨基酸，具有抗脂质过氧化损伤、调节细胞钙稳态和稳定细胞膜等生物学功能，是机体自身重要的细胞保护性物质〔1〕。我们以前的工作证实，牛磺酸可有效防治四氯化碳所致的肝损伤，显著降低ALT活性和肝脏MDA及Ca2+〔11〕。本实验在大鼠原位灌流的肝脏I/R模型上发现，再灌注同时给予牛磺酸明显减轻再灌注对缺氧肝脏的损伤，抑制肝组织过氧化脂质的生成；减少肝细胞线粒体钙含量；同时抑制细胞内蛋白和酶(LDH)的漏出。结果表明牛磺酸亦具有抗再灌注损伤的作用。
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牛磺酸保护肝脏的机理尚不十分清楚。已知再灌注引起大量氧自由基的产生、进而发生脂质过氧化，以及引起细胞内Ca2+超载是造成缺血肝脏再灌注损伤的最重要的因素〔2，12〕。本实验中观察到，牛磺酸抑制I/R肝损伤时MDA的生成，降低细胞钙含量。体外实验进一步发现，牛磺酸对大鼠肝细胞质膜用氧自由基发生系统诱导的LPO有明显的抑制效应，并抑制离体肝脏线粒体钙的摄入，促进线粒体内钙的释放。提示牛磺酸可能通过清除氧自由基和抑制细胞内钙聚积而减轻再灌注造成的损伤。本实验还发现，牛磺酸对离体大鼠肝脏溶酶体具有直接的稳膜作用，能有效抑制胞内蛋白和酶的漏出。
总之，上述实验证实牛磺酸对I/R造成的肝损伤具有明显的防治效应，而其抗损伤作用的机理可能主要与抑制脂质过氧化、调节细胞钙稳态和稳定细胞膜的功能有关。这些结果提示，牛磺酸作为细胞保护剂，对于防治肝脏I/R损伤，可能具有一定的临床意义和应用前景。
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(收稿：1992-05-28 修回：1993-02-27), http://www.100md.com