流行性出血热病毒抗原在细胞外液的形态及分布
作者：剂彦仿 杨守京 晏培松 李 青
单位：710032 西安第四军医大学病理教研室
关键词：出血热，流行性；体液；抗原，病毒
中华医学杂志930607 摘要 用流行性出血热病毒抗G2及N蛋白单克隆抗体，对20例流行性出血热患者尸检组织中病毒抗原等进行免疫组化检测。细胞外液包括血、淋巴液、水肿液、肾小管内液(尿)、肺、支气管内液(痰)、曲细精管内液(精液)以及胃、肠、胰、甲状腺等分泌物中均可见到弥漫性G2及N抗原物质。部分病例尚可见到着色较深的精颗粒状N抗原。细胞外抗原与相邻细胞内抗原形态一致，说明病毒在细胞内复制产生抗原并排出细胞，或因细胞崩解而释放。表明弥漫性可溶性抗原多已形成复合物。这可能与病毒经人体后其致病性有所降解有关。病毒抗原随细胞外液大量排出体外。
自1986年来，国内学者分别从流行性出血热患者血、尿及脑脊液中用间接免疫荧光法及反向血凝法检测出流行性出血热病毒及抗原〔1～3〕。我们从20例尸检标本中用免疫组织化学法观察到患者细胞外液中有弥漫性及颗粒性两种抗原阳性物质，现就其染色、形态、来源、性质及意义报道如下。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、材料
1.标本：20例尸检材料系本教研室1961～1988年收集的典型病例，基本上皆具有流行性出血热的典型病变，临床同理均诊断为流行性出血热，标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，切片5μm厚，脱蜡后行免疫组化染色。重点观察细胞内外抗原的异同，并用5例年龄、性别相似，死于其他病因者的相应组织块如肾、肝、肺、脑、心、甲状腺及肾上腺为对照。为了证明颗粒性抗原性物质的性质，取23例骨髓穿刺标本PLP固定，电镜观察。
2.抗体：第一抗体有抗G2蛋白单克隆抗体(MAb)LV48A，抗N蛋白MAb抗体133、A35、A25(来自预防医学科学院病毒研究所)及未定性抗体12种。抗人IgG、IgM购自上海生物制品所。抗补体：C1q(第三军医大学免疫室)、鼠PAP(武汉生物制品研究所)。桥抗：羊抗兔，兔抗鼠及其金5nm标抗体均由本室制备。
, 百拇医药
二、染色方法
主要用显示尸检组织中流行性出血热病毒抗原的新的更加敏感的免疫组织化学方法〔4〕，一为多重量PAP法，即在双PAP的基础上再加桥抗及PAP，直至出现阳性为止(有时达8PAP)；二是用多重PAP加ABC法，即用生物素化的桥抗，多重PAP后，一次使用ABC，可使PAP与ABC结合起来(至4PAP+4ABC)。不同抗体均用连续切片以利于相互对照，并于每张切片上用无关抗体、PBS进行替代及空白对照，另用其它疾病尸检片及出血热病毒感染阳性Vero-E6细胞抗原片进行同样染色对照。骨髓用De waele包埋前染色进行〔5〕。
结 果
一、血液
各种组织血管及血窦的血液中可见两种抗原阳性物质：(1)弥漫性抗原阳性物质，是溶解于血浆的抗原，在切片上呈褐黄色弥漫性DAB反应(图1)。纤维蛋白也呈阳性反应。G2蛋白染色，所有病例的细胞内外均抗原阳性，N蛋白染色13例阳性。(2)颗粒状抗原阳性物质，20例中有7例的血浆表现为染色较深，圆形或空泡状颗粒，主要是N抗原部分病例阳性，直径1～5μm。有的颗粒抗原尚在结构模糊的退变细胞之中。G2抗原染色，少数完整或破碎的红细胞呈阳性反应(图1)。中性粒细胞包涵体N抗原阳性，见图2。
, 百拇医药
图1 血浆内弥漫性抗原阳性物质(1)及颗粒性抗原物质(2),G2抗体LV48A+8PAP×400
图2 中性粒细胞中的包涵体,免疫电镜下N抗原.包埋前IGS染色×60000
二、肾小管内液
近曲小管上皮呈弥漫性阳性染色，管腔原尿中亦有弥漫性抗原阳性物质，全部G2抗原阳性，部分N抗原阳性。N抗原染色7例，其近曲小管上皮细胞内及管腔中均有散在的、大量圆形实心或空心包涵体性颗粒状抗原阳性物质，以远曲小管，享利襻，尤其是集合管中多见。见图3，4。
图3 肾近曲小管内及细胞内颗粒包涵体样抗原.N抗原体A258AP×400
, 百拇医药
图4 肾远曲小管腔内弥漫性抗原,近曲管弥漫性抗原.G2(LV48A)抗体,4PAP+4ABC,苏木精衬染×400
三、肺泡及气管内液
肺泡及各级支气管中的水肿渗出液中既有G2蛋白(全部病例)又有N蛋白(部分病例)的弥漫性抗原，也可见圆形包涵体性颗粒性抗图(图5)。
图5 肺泡液中颗粒性抗原,N抗体(A25)4PAP+4ABC,苏木精衬染×1000
四、曲细精管内液
精原细胞，精母细胞和部分精子G2及N抗原阳性，精管液中既可见到可溶性弥漫性G2及N抗原，也可见到包涵体样颗粒状N抗原。
, http://www.100md.com 五、其它
脑脊液、淋巴液、胃、肠、胰，甲状腺上皮及分泌物均可见弥漫性溶解抗原，亦见颗粒性抗原，有的颗粒性抗原仍在退变的细胞之中(图6)。表皮中亦可见类似的抗原分布。
图6 甲状腺胶质中颗粒性抗原N抗体(A35),4PAP+4ABC,苏木精衬染×400
骨髓穿刺标本在光镜下的颗粒性抗原阳性物质，与免疫电镜下懈涵体是一致〔6〕，多数N抗原为阳性(图2)。在弥漫性抗原部位，多数情况下IgG，C1q染色阳性，少数情况下IgM亦阳性。所有组织对照、空白及替代对照均阴性。vero-E6细胞抗原片阳性。
讨 论
本组资料说明，流行性出血热病人的大部分腺上皮、导管上皮、粘膜上皮、表皮以及内皮均有病毒抗原表达及脱落。在所检测的标本中均有大量弥漫性抗原物质及部分有颗粒状抗原物质，后者实质上是电镜下的包涵体。从切片上看，细胞内外抗原十分丰富(所测病例为野鼠型感染)，估计病人每日有大量抗原排出体外，不可避免地污染了体表。但是从流行病学规律看，人与人之间传染极少发生，这是因为：(1)抗原不是活病毒；(2)病毒必经伤口才能感染；(3)本组资料中弥漫性抗原一般伴有IgG，C1q，为免疫复合物状态，已失去了感染性。
, 百拇医药
病毒一般在细胞内复制。细胞外液中抗原与相邻细胞内抗原形态一致，有的仍在崩解的细胞之中，细胞外液抗原一般来源于细胞。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 杨为松，白宪光，张文彬，等.从单核细胞中分离流行性出血热病毒.中华传染病杂志，1986，34：102.
2 姚志强，杨为松，张文彬，等.流行性出血热病毒在体液中的分布.中华医学杂志，1988，68：618.
3 杨风仪，张文彬，杨为松.流行性出血热尿液中特异性抗原抗体的检测.人民军医，1986，10：23.
4 Liu Yanfang,Yang Shoujing,Yan Peisong.Detedtion of virusantigen of epidemic hemorrhagic fever by multiple repeated PAP or repeated PAP+ABC.Acta Anatomica Sinica,1991,22 〔Suppl 2〕:21.
5 De Waele M,De Mey J,Moeremans M,et al.The immunogold staining method:an immunocytochemical procedure for leukocyte characterization by monoclonal antibodies.In:Knapp W,Leukemia maker,eds.London:Ap,1981,173-176.
6 杨守京，刘彦仿，韩爱萍，等.流行性出血热尸检细胞内包涵体的研究.病毒学杂志，1992，7：246.
(收稿：1992-07-11 修回：1992-02-20), http://www.100md.com
单位：710032 西安第四军医大学病理教研室
关键词：出血热，流行性；体液；抗原，病毒
中华医学杂志930607 摘要 用流行性出血热病毒抗G2及N蛋白单克隆抗体，对20例流行性出血热患者尸检组织中病毒抗原等进行免疫组化检测。细胞外液包括血、淋巴液、水肿液、肾小管内液(尿)、肺、支气管内液(痰)、曲细精管内液(精液)以及胃、肠、胰、甲状腺等分泌物中均可见到弥漫性G2及N抗原物质。部分病例尚可见到着色较深的精颗粒状N抗原。细胞外抗原与相邻细胞内抗原形态一致，说明病毒在细胞内复制产生抗原并排出细胞，或因细胞崩解而释放。表明弥漫性可溶性抗原多已形成复合物。这可能与病毒经人体后其致病性有所降解有关。病毒抗原随细胞外液大量排出体外。
自1986年来，国内学者分别从流行性出血热患者血、尿及脑脊液中用间接免疫荧光法及反向血凝法检测出流行性出血热病毒及抗原〔1～3〕。我们从20例尸检标本中用免疫组织化学法观察到患者细胞外液中有弥漫性及颗粒性两种抗原阳性物质，现就其染色、形态、来源、性质及意义报道如下。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、材料
1.标本：20例尸检材料系本教研室1961～1988年收集的典型病例，基本上皆具有流行性出血热的典型病变，临床同理均诊断为流行性出血热，标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，切片5μm厚，脱蜡后行免疫组化染色。重点观察细胞内外抗原的异同，并用5例年龄、性别相似，死于其他病因者的相应组织块如肾、肝、肺、脑、心、甲状腺及肾上腺为对照。为了证明颗粒性抗原性物质的性质，取23例骨髓穿刺标本PLP固定，电镜观察。
2.抗体：第一抗体有抗G2蛋白单克隆抗体(MAb)LV48A，抗N蛋白MAb抗体133、A35、A25(来自预防医学科学院病毒研究所)及未定性抗体12种。抗人IgG、IgM购自上海生物制品所。抗补体：C1q(第三军医大学免疫室)、鼠PAP(武汉生物制品研究所)。桥抗：羊抗兔，兔抗鼠及其金5nm标抗体均由本室制备。
, 百拇医药
二、染色方法
主要用显示尸检组织中流行性出血热病毒抗原的新的更加敏感的免疫组织化学方法〔4〕，一为多重量PAP法，即在双PAP的基础上再加桥抗及PAP，直至出现阳性为止(有时达8PAP)；二是用多重PAP加ABC法，即用生物素化的桥抗，多重PAP后，一次使用ABC，可使PAP与ABC结合起来(至4PAP+4ABC)。不同抗体均用连续切片以利于相互对照，并于每张切片上用无关抗体、PBS进行替代及空白对照，另用其它疾病尸检片及出血热病毒感染阳性Vero-E6细胞抗原片进行同样染色对照。骨髓用De waele包埋前染色进行〔5〕。
结 果
一、血液
各种组织血管及血窦的血液中可见两种抗原阳性物质：(1)弥漫性抗原阳性物质，是溶解于血浆的抗原，在切片上呈褐黄色弥漫性DAB反应(图1)。纤维蛋白也呈阳性反应。G2蛋白染色，所有病例的细胞内外均抗原阳性，N蛋白染色13例阳性。(2)颗粒状抗原阳性物质，20例中有7例的血浆表现为染色较深，圆形或空泡状颗粒，主要是N抗原部分病例阳性，直径1～5μm。有的颗粒抗原尚在结构模糊的退变细胞之中。G2抗原染色，少数完整或破碎的红细胞呈阳性反应(图1)。中性粒细胞包涵体N抗原阳性，见图2。
, 百拇医药
图1 血浆内弥漫性抗原阳性物质(1)及颗粒性抗原物质(2),G2抗体LV48A+8PAP×400
图2 中性粒细胞中的包涵体,免疫电镜下N抗原.包埋前IGS染色×60000
二、肾小管内液
近曲小管上皮呈弥漫性阳性染色，管腔原尿中亦有弥漫性抗原阳性物质，全部G2抗原阳性，部分N抗原阳性。N抗原染色7例，其近曲小管上皮细胞内及管腔中均有散在的、大量圆形实心或空心包涵体性颗粒状抗原阳性物质，以远曲小管，享利襻，尤其是集合管中多见。见图3，4。
图3 肾近曲小管内及细胞内颗粒包涵体样抗原.N抗原体A258AP×400
, 百拇医药
图4 肾远曲小管腔内弥漫性抗原,近曲管弥漫性抗原.G2(LV48A)抗体,4PAP+4ABC,苏木精衬染×400
三、肺泡及气管内液
肺泡及各级支气管中的水肿渗出液中既有G2蛋白(全部病例)又有N蛋白(部分病例)的弥漫性抗原，也可见圆形包涵体性颗粒性抗图(图5)。
图5 肺泡液中颗粒性抗原,N抗体(A25)4PAP+4ABC,苏木精衬染×1000
四、曲细精管内液
精原细胞，精母细胞和部分精子G2及N抗原阳性，精管液中既可见到可溶性弥漫性G2及N抗原，也可见到包涵体样颗粒状N抗原。
, http://www.100md.com 五、其它
脑脊液、淋巴液、胃、肠、胰，甲状腺上皮及分泌物均可见弥漫性溶解抗原，亦见颗粒性抗原，有的颗粒性抗原仍在退变的细胞之中(图6)。表皮中亦可见类似的抗原分布。
图6 甲状腺胶质中颗粒性抗原N抗体(A35),4PAP+4ABC,苏木精衬染×400
骨髓穿刺标本在光镜下的颗粒性抗原阳性物质，与免疫电镜下懈涵体是一致〔6〕，多数N抗原为阳性(图2)。在弥漫性抗原部位，多数情况下IgG，C1q染色阳性，少数情况下IgM亦阳性。所有组织对照、空白及替代对照均阴性。vero-E6细胞抗原片阳性。
讨 论
本组资料说明，流行性出血热病人的大部分腺上皮、导管上皮、粘膜上皮、表皮以及内皮均有病毒抗原表达及脱落。在所检测的标本中均有大量弥漫性抗原物质及部分有颗粒状抗原物质，后者实质上是电镜下的包涵体。从切片上看，细胞内外抗原十分丰富(所测病例为野鼠型感染)，估计病人每日有大量抗原排出体外，不可避免地污染了体表。但是从流行病学规律看，人与人之间传染极少发生，这是因为：(1)抗原不是活病毒；(2)病毒必经伤口才能感染；(3)本组资料中弥漫性抗原一般伴有IgG，C1q，为免疫复合物状态，已失去了感染性。
, 百拇医药
病毒一般在细胞内复制。细胞外液中抗原与相邻细胞内抗原形态一致，有的仍在崩解的细胞之中，细胞外液抗原一般来源于细胞。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 杨为松，白宪光，张文彬，等.从单核细胞中分离流行性出血热病毒.中华传染病杂志，1986，34：102.
2 姚志强，杨为松，张文彬，等.流行性出血热病毒在体液中的分布.中华医学杂志，1988，68：618.
3 杨风仪，张文彬，杨为松.流行性出血热尿液中特异性抗原抗体的检测.人民军医，1986，10：23.
4 Liu Yanfang,Yang Shoujing,Yan Peisong.Detedtion of virusantigen of epidemic hemorrhagic fever by multiple repeated PAP or repeated PAP+ABC.Acta Anatomica Sinica,1991,22 〔Suppl 2〕:21.
5 De Waele M,De Mey J,Moeremans M,et al.The immunogold staining method:an immunocytochemical procedure for leukocyte characterization by monoclonal antibodies.In:Knapp W,Leukemia maker,eds.London:Ap,1981,173-176.
6 杨守京，刘彦仿，韩爱萍，等.流行性出血热尸检细胞内包涵体的研究.病毒学杂志，1992，7：246.
(收稿：1992-07-11 修回：1992-02-20), http://www.100md.com