乙型肝炎患者睾丸组织中HBV分布的研究
作者：郎振为 孟 忻 闫惠平 肖桂兰 马志春 李俊强 贺立香
单位：100054 北京佑安医院病理科(郎振为、孟 忻，肖桂兰，马志春，李俊强)；北京市肝炎研究所(闫惠平，贺立香)
关键词：乙型肝炎病毒；睾丸；免疫酶技术
中华医学杂志930603 摘要 采用免疫组化法对34例肝病患者睾丸组织中乙型肝炎病毒(HBV)的分布进行了研究，睾丸组织中HBsAg、HBcAg的检出率分别为56.3%及12.5%。HBV阳性物质不仅存在于精原细胞、初级精母细胞有子细胞中，而且也见于支持细胞内。阳性细胞呈单个或灶性分布。对其中6例睾丸组织进行了原位杂交研究，发现2例生精细胞中有HBV DNA阳性物质，均表现为核型。睾丸组织中的定位研究为HBV的性传播提供了形态依据。
乙型肝炎(简称乙肝)病人的精液中存在HBV已被证实，然而，有关HBV在睾丸组织中的形态学定位及分布尚不清楚。为此，我们采用乙肝病毒表面及核心多克隆抗体和ABC法及地高辛标记的HBV DNA探针，对各种乙肝患者睾丸组织中的生精细胞及排精管道进行了免疫组化及原位杂交研究，现报告如下：
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材料与方法
一、材料
材料选自1990年至1991年我院病理收检的肝病患者尸检睾丸及相应肝组织共34例，所有腊块作连续切片后，除常规病理检查外，其余切片分别作免疫组化ABC法检测HBxAg、HBcAg及对照用，其中6例睾丸HBV阳性病列作地高辛标记的HBV DNA探针检测。肝炎分类标准按1990年上海会议方案；本组34例中重症肝炎5例(急性3例，亚急性和慢性各1例)，活动性肝硬化11例，原发性肝癌18例。
二、方法
主要试剂：羊抗-HBs、兔抗-HBc、生物素标记兔IgG和抗羊IgG为DAKO产品：ABC药盒系美国Vector Lab产品。地高辛素(Digoxigenin，Dig异羟基洋地黄毒甙配基)标记的探针由北京肝炎研究所制备。全基因HBV DNA(3.2kb)由重组PBR322获得，EcoRI(华美公司产品)切割，再经凝胶电泳回收HBV DNA片段。用Digoxigenin DNA标记和检测试剂盒(Boehuinger Mannhein)随机引物方法标记HBV DNA探针，斑点杂交证实Dig-HBV DNA杂交敏感度为0.5pg。原位杂交具体步骤按文献报告〔1〕。
, 百拇医药
用3例非肝病组织与6例睾HBsAg阳性切片及2例活动性肝硬化切片同时进行杂交；用50%甲酰胺替代HBV DNA探针液，以Dig-HAV cDNA(中国预防医学科学院病毒研究所郭可骞教授惠赠)、Dig-HPV DNA探针(首都医学院电镜室标记赠送)作为阴性对照。用DNA酶处理阳性切片后阳性信号完全消失，RNA酶预处理后对杂交阳性信号无影响。与美国ENZO Biochen公司生产的生物素标记的HBV DNA探针检测结果一致，但生物素标记的HBV DNA探针易出现假阳性。
血清学HBV检测采用ELISA法。
结 果
一、睾丸组织内HBV标志的检测
34例睾丸组织中HBsAg阳性18例，HBcAg阳性4例。曲细精管中阳性细胞多呈单个或灶性分布，少数呈弥散分布。不同发育阶段的生精细胞如精原细胞、初级精母细胞、精子细胞的胞浆内均可见HBsAg和HBcAg阳性颗粒，呈弥漫分布，其中受染的精子细胞和初级母精母细胞较精原细胞多见，偶见处于分裂状态的胞浆内也有HBsAg阳性颗粒(图1)。部分支持细胞的胞浆内也可见HBsAg阳性颗粒，呈弥漫棕色或棕黄色(图2)。
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图1 睾丸曲细精管内HBsAg阳性,生精细胞单个散在分布,其胞浆呈棕黄色 ABC×600
图2 下部示曲细精管支持细胞胞浆中HBsAg阳性颗粒,呈棕黄色 ABC×600
表1 34例睾丸，肝组织及血清HBV检测阳性例数 肝病类别
例数
血清
肝脏
睾丸
附睾
HBsAg
HBeAg
抗-HBc
, 百拇医药
HBsAg
HBcAg
HBsAg
HBcAg
HBsAg
HBcAg
重症肝炎
5
3
2
3
3
2
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1
1
0
0
活动性肝硬化
11
6
5
7
9
5
5
3
3
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0
原发性肝痛
18
11
6
8
16
6
12
0
3
0
合 计
34
, 百拇医药
21
13
19
28
13
18
4
6
0
18例睾丸曲精管内HBV阳性病例中有6例其直细精管、睾丸网、输出小管或附睾管内的上皮细胞胞浆内检测出HBsAg阳性颗粒，尤以输出小管和附睾管明显，阳性细胞呈灶性分布，其中于1例附睾平滑肌内检出HBsAg阳性物质。
18例中有6例切片作Dig-HBV DNA原位杂交，其中有2例生精细胞内HBV DNA阳性，均表现为核型(图3)，这2例其免疫组化检测均为HBsAg单项阳性。
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图3 HBV DNA阳性物质在生精细胞的核内,呈兰紫色,原位杂交 ABC×600
本组睾丸HE染色光镜下均未发现有明显病理改变。
二、血清及肝内HBV标志的检测
34例中有HBV血清学检测资料者32例，其与睾丸、肝内HBV标志的关系见表1。血清HBeAg阳性与HBeAg阴性者其睾丸HBV检出率差异无显著意义(表2)。
表2 血清HBeAg阳性与阴性组睾丸HBV检出比较(例数) 组 别
例数
睾丸
附睾
HBsAg
, 百拇医药
HBcAg
HBsAg
HBcAg
血清HBeAgb阳性
13
7
1
3
0
血清HBeAg阴性
19
11
3
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3
0
*P<0.05
34例肝组织中HBsAg、HBcAg的检出率分别为82.3%及35.3%。对部分肝组织内HBV DNA检测，阳性率为60.0%，HBV DNA阳性物质位于肝细胞浆内或核内或两者兼有。
讨 论
1974年Heathcote等〔2〕应用放射免疫技术于18例血清HBsAg阳性患者的精液中检测出HBsAg 10例。流行病学资料亦已证实HBV能通过性途径传播〔3，4〕。1985年有人采用分子杂交技术在乙肝患者的精液中发现有HBV DNA，其中2例精子细胞内有整合型的HBV DNA。1988年Peng等〔5〕报告1例血清HBV标志阳性、血及精液内HBV DNA均阴性的供血员，其精子内有整合的HBV DNA。目前通过对肝组织的原位杂交分析，有人认为分布在肝细胞浆内HBV DNA为复制型，分布在肝细胞核内的HBV DNA为整合状态，尤其是肝内仅有HBsAg表达时，可能由于整合不完全或部分HBV的基因被甲基化，而无HBcAg表达，比较符合HBV DNA整合到宿主基因组的表现，可代表HBV处于非复制状态〔6〕。本文中，HBV DNA分布于各级生精细胞核内表现为核型，其免疫组化均只有HBsAg表达，是否类似于肝组织，代表HBV处于整合状态，而支持乙肝病毒可以通过精子垂直传播的假说。
, 百拇医药
睾丸支持细胞担负着对各级生精细胞提供营养等功能，其受染亦可能会致使各级生精细胞受染。支持细胞紧密连接，生精上皮基膜及界膜构成了血-睾屏障。本文从支持细胞及各级生精细胞中检测出HBV，从形态学上表明乙肝病毒可通过血睾屏障而出现于精液中。
有的学者认为，血清乙肝e抗原阳性的患者其体液或分泌物中HBV检测的阳性率较高〔7，8〕。本文中，血清e抗原阳性与阴性组相比，其睾丸组织中HBV检出率差异无显著意义。
本组中有1例于附睾平滑肌组织中检测出HBsAg阳性物质。我们曾于部分乙肝患者的胆囊平滑肌组织中呈现HBV阳性着色，表明乙肝病毒具有多组织的泛嗜性。
参考文献
1.Lau JYN,Naoumov NV,Alexander GJM,et al.Rapid detection of hepatitis B virus DNA in liver tissue by in situ hybridisation and its combination with immunohistochemistry for simultaneous detection of HBV antigens.Pathology,1991,44:905.
, 百拇医药
2.Heathcote J,Cameron CH,Dane DS,et al.Hepatitis B antigen in saliva and semen.Lancet,1974,1:71.
3.马复兴.病毒性肝炎与性传播.实用内科杂志，1990，3：153.
4.陈 延.人工授精中供者精液微生物感染与性传播疾病.国外医学参考资料微生物分册，1991，5：197.
5.Peng HW,Su TS,Han SH,et al.Assessment of HBV Persistent infection in an adult population in Taiwan.J Med Virol,1988,24:405.
6.Su Ts,Lui WY,Lin LH,et al.Analysis of hepatitis B virus transcripts in in fected human liver.Hepatol,1989,9:180.
, 百拇医药
7.Karayiannis P,Novick DM,Lok ASF,et al.Hepatitis Bvirus DNA in saliva,urine,and seminal fluid of carriers of hepatitis B antigen.British Med J,1985,290:1853.
8.Yoffe B,Burns DK,Bhatt HS,et al.Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection.Hepatol,1990,2:187.
(收稿：1992-07-20 修回：1993-03-19), 百拇医药
单位：100054 北京佑安医院病理科(郎振为、孟 忻，肖桂兰，马志春，李俊强)；北京市肝炎研究所(闫惠平，贺立香)
关键词：乙型肝炎病毒；睾丸；免疫酶技术
中华医学杂志930603 摘要 采用免疫组化法对34例肝病患者睾丸组织中乙型肝炎病毒(HBV)的分布进行了研究，睾丸组织中HBsAg、HBcAg的检出率分别为56.3%及12.5%。HBV阳性物质不仅存在于精原细胞、初级精母细胞有子细胞中，而且也见于支持细胞内。阳性细胞呈单个或灶性分布。对其中6例睾丸组织进行了原位杂交研究，发现2例生精细胞中有HBV DNA阳性物质，均表现为核型。睾丸组织中的定位研究为HBV的性传播提供了形态依据。
乙型肝炎(简称乙肝)病人的精液中存在HBV已被证实，然而，有关HBV在睾丸组织中的形态学定位及分布尚不清楚。为此，我们采用乙肝病毒表面及核心多克隆抗体和ABC法及地高辛标记的HBV DNA探针，对各种乙肝患者睾丸组织中的生精细胞及排精管道进行了免疫组化及原位杂交研究，现报告如下：
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材料与方法
一、材料
材料选自1990年至1991年我院病理收检的肝病患者尸检睾丸及相应肝组织共34例，所有腊块作连续切片后，除常规病理检查外，其余切片分别作免疫组化ABC法检测HBxAg、HBcAg及对照用，其中6例睾丸HBV阳性病列作地高辛标记的HBV DNA探针检测。肝炎分类标准按1990年上海会议方案；本组34例中重症肝炎5例(急性3例，亚急性和慢性各1例)，活动性肝硬化11例，原发性肝癌18例。
二、方法
主要试剂：羊抗-HBs、兔抗-HBc、生物素标记兔IgG和抗羊IgG为DAKO产品：ABC药盒系美国Vector Lab产品。地高辛素(Digoxigenin，Dig异羟基洋地黄毒甙配基)标记的探针由北京肝炎研究所制备。全基因HBV DNA(3.2kb)由重组PBR322获得，EcoRI(华美公司产品)切割，再经凝胶电泳回收HBV DNA片段。用Digoxigenin DNA标记和检测试剂盒(Boehuinger Mannhein)随机引物方法标记HBV DNA探针，斑点杂交证实Dig-HBV DNA杂交敏感度为0.5pg。原位杂交具体步骤按文献报告〔1〕。
, 百拇医药
用3例非肝病组织与6例睾HBsAg阳性切片及2例活动性肝硬化切片同时进行杂交；用50%甲酰胺替代HBV DNA探针液，以Dig-HAV cDNA(中国预防医学科学院病毒研究所郭可骞教授惠赠)、Dig-HPV DNA探针(首都医学院电镜室标记赠送)作为阴性对照。用DNA酶处理阳性切片后阳性信号完全消失，RNA酶预处理后对杂交阳性信号无影响。与美国ENZO Biochen公司生产的生物素标记的HBV DNA探针检测结果一致，但生物素标记的HBV DNA探针易出现假阳性。
血清学HBV检测采用ELISA法。
结 果
一、睾丸组织内HBV标志的检测
34例睾丸组织中HBsAg阳性18例，HBcAg阳性4例。曲细精管中阳性细胞多呈单个或灶性分布，少数呈弥散分布。不同发育阶段的生精细胞如精原细胞、初级精母细胞、精子细胞的胞浆内均可见HBsAg和HBcAg阳性颗粒，呈弥漫分布，其中受染的精子细胞和初级母精母细胞较精原细胞多见，偶见处于分裂状态的胞浆内也有HBsAg阳性颗粒(图1)。部分支持细胞的胞浆内也可见HBsAg阳性颗粒，呈弥漫棕色或棕黄色(图2)。
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图1 睾丸曲细精管内HBsAg阳性,生精细胞单个散在分布,其胞浆呈棕黄色 ABC×600
图2 下部示曲细精管支持细胞胞浆中HBsAg阳性颗粒,呈棕黄色 ABC×600
表1 34例睾丸，肝组织及血清HBV检测阳性例数 肝病类别
例数
血清
肝脏
睾丸
附睾
HBsAg
HBeAg
抗-HBc
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HBsAg
HBcAg
HBsAg
HBcAg
HBsAg
HBcAg
重症肝炎
5
3
2
3
3
2
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1
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0
0
活动性肝硬化
11
6
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5
3
3
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0
原发性肝痛
18
11
6
8
16
6
12
0
3
0
合 计
34
, 百拇医药
21
13
19
28
13
18
4
6
0
18例睾丸曲精管内HBV阳性病例中有6例其直细精管、睾丸网、输出小管或附睾管内的上皮细胞胞浆内检测出HBsAg阳性颗粒，尤以输出小管和附睾管明显，阳性细胞呈灶性分布，其中于1例附睾平滑肌内检出HBsAg阳性物质。
18例中有6例切片作Dig-HBV DNA原位杂交，其中有2例生精细胞内HBV DNA阳性，均表现为核型(图3)，这2例其免疫组化检测均为HBsAg单项阳性。
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图3 HBV DNA阳性物质在生精细胞的核内,呈兰紫色,原位杂交 ABC×600
本组睾丸HE染色光镜下均未发现有明显病理改变。
二、血清及肝内HBV标志的检测
34例中有HBV血清学检测资料者32例，其与睾丸、肝内HBV标志的关系见表1。血清HBeAg阳性与HBeAg阴性者其睾丸HBV检出率差异无显著意义(表2)。
表2 血清HBeAg阳性与阴性组睾丸HBV检出比较(例数) 组 别
例数
睾丸
附睾
HBsAg
, 百拇医药
HBcAg
HBsAg
HBcAg
血清HBeAgb阳性
13
7
1
3
0
血清HBeAg阴性
19
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3
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3
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*P<0.05
34例肝组织中HBsAg、HBcAg的检出率分别为82.3%及35.3%。对部分肝组织内HBV DNA检测，阳性率为60.0%，HBV DNA阳性物质位于肝细胞浆内或核内或两者兼有。
讨 论
1974年Heathcote等〔2〕应用放射免疫技术于18例血清HBsAg阳性患者的精液中检测出HBsAg 10例。流行病学资料亦已证实HBV能通过性途径传播〔3，4〕。1985年有人采用分子杂交技术在乙肝患者的精液中发现有HBV DNA，其中2例精子细胞内有整合型的HBV DNA。1988年Peng等〔5〕报告1例血清HBV标志阳性、血及精液内HBV DNA均阴性的供血员，其精子内有整合的HBV DNA。目前通过对肝组织的原位杂交分析，有人认为分布在肝细胞浆内HBV DNA为复制型，分布在肝细胞核内的HBV DNA为整合状态，尤其是肝内仅有HBsAg表达时，可能由于整合不完全或部分HBV的基因被甲基化，而无HBcAg表达，比较符合HBV DNA整合到宿主基因组的表现，可代表HBV处于非复制状态〔6〕。本文中，HBV DNA分布于各级生精细胞核内表现为核型，其免疫组化均只有HBsAg表达，是否类似于肝组织，代表HBV处于整合状态，而支持乙肝病毒可以通过精子垂直传播的假说。
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睾丸支持细胞担负着对各级生精细胞提供营养等功能，其受染亦可能会致使各级生精细胞受染。支持细胞紧密连接，生精上皮基膜及界膜构成了血-睾屏障。本文从支持细胞及各级生精细胞中检测出HBV，从形态学上表明乙肝病毒可通过血睾屏障而出现于精液中。
有的学者认为，血清乙肝e抗原阳性的患者其体液或分泌物中HBV检测的阳性率较高〔7，8〕。本文中，血清e抗原阳性与阴性组相比，其睾丸组织中HBV检出率差异无显著意义。
本组中有1例于附睾平滑肌组织中检测出HBsAg阳性物质。我们曾于部分乙肝患者的胆囊平滑肌组织中呈现HBV阳性着色，表明乙肝病毒具有多组织的泛嗜性。
参考文献
1.Lau JYN,Naoumov NV,Alexander GJM,et al.Rapid detection of hepatitis B virus DNA in liver tissue by in situ hybridisation and its combination with immunohistochemistry for simultaneous detection of HBV antigens.Pathology,1991,44:905.
, 百拇医药
2.Heathcote J,Cameron CH,Dane DS,et al.Hepatitis B antigen in saliva and semen.Lancet,1974,1:71.
3.马复兴.病毒性肝炎与性传播.实用内科杂志，1990，3：153.
4.陈 延.人工授精中供者精液微生物感染与性传播疾病.国外医学参考资料微生物分册，1991，5：197.
5.Peng HW,Su TS,Han SH,et al.Assessment of HBV Persistent infection in an adult population in Taiwan.J Med Virol,1988,24:405.
6.Su Ts,Lui WY,Lin LH,et al.Analysis of hepatitis B virus transcripts in in fected human liver.Hepatol,1989,9:180.
, 百拇医药
7.Karayiannis P,Novick DM,Lok ASF,et al.Hepatitis Bvirus DNA in saliva,urine,and seminal fluid of carriers of hepatitis B antigen.British Med J,1985,290:1853.
8.Yoffe B,Burns DK,Bhatt HS,et al.Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection.Hepatol,1990,2:187.
(收稿：1992-07-20 修回：1993-03-19), 百拇医药