反义寡聚硫代磷酸脱氧核苷对Polio病毒增殖的抑制作用
作者：汤 华 任中原 张 灏 宗建超 倪爱国 刘福森
单位：300070 天津医学院微生物学教研室(汤 华，任中原，张 灏)；南开大学分子生物学研究所(宗建超，倪爱国，刘福森)
关键词：
中华医学杂志930618 已有研究表明较低浓度反义寡聚硫代磷酸脱氧核苷(S-ODN)能有效地抑制HIV〔1〕及HBV〔2〕基因表达，为探讨S-ODN对病毒增殖的直接抑制作用，选用RNA病毒(Polio病毒)作为靶病毒，合成了两个与其基因特异性互补的S-ODN，在细胞培养系统中证明了它对Polio病毒增殖的特异性抑制作用。
一、材料与方法
1.HeLa细胞及Polio病毒Ⅰ型(sabin株)培养：按常规方法进行培养并滴定病毒毒力。
, 百拇医药
2.反义S-ODN的设计与合成：根据Toyoda等〔3〕报道的Polio病毒Ⅰ型的核酸序列，经微机与其它已知人类基因顺序进行同源性比较，设计出长为14个核苷酸组成的特异性互补于Polio病毒Ⅰ型基因的片段，按文献[4]介绍的方法进行合成与纯化。
3.S-ODN对Polio病毒Ⅰ型在Hela细胞中增殖所致细胞病变(CPE)的抑制作用：在24孔培养板上进行。100半数组织细胞培养感染量(TCID50)的病毒液常规吸附于单层Hela细胞后，加含不同浓度S-ODN的维持液，同样培养3天，观察CPE；或加维持液，在其后0、3、6、12小时分别加S-ODN，同样培养3天，观察CPE。
4.S-ODN对Polio病毒Ⅰ型在Hela细胞中增殖产生感染性病毒的抑制作用：100TICD50病毒常规接种后，加入不同浓度的S-ODN维持液，同样培养3天，冻融细胞、离心收集上清液，分别滴定其TCID50。
, 百拇医药
二、结果
1.反义S-ODN对Polio病毒Ⅰ型在Hela细胞中增殖所致CPE的抑制作用：在0.6μmol/L浓度时反义S-ODN1、S-ODN2、都未显示明显的抑制作用，6μmol/L时则100%抑制了病毒所致CPE的作用。
2.CPE抑制作用与反义S-ODN加入时间关系：在病毒吸附后不同时间加入6μmol/L的反义S-ODN1或S-ODN2，同样培养3天后观察结果表明：在3小时以内加 时则能抑制80%以上的CPE，而在12小时加入时则几乎不能抑制CPE的形成，两者作用无明显差异。。
3.反义S-ODN对Polio病毒Ⅰ型在Hela细胞中增殖产生感染性病毒的抑制作用：在0.6μmol/L时S-ODN1及S-ODN2能分别降低2、1个对数值的TCID50；在1.2μmol/L时均能降低3个对数值；≥3μmol/L时则病毒原液不稀释接种亦不引起CPE。
, 百拇医药
三、讨论
Polio病毒是一单股正链RNA病毒，其RNA既作为病毒复制的模块又直接指导病毒蛋白合成。本试验设计的反义DNA片段：S-ODN1序列为5′-CAGAGCTGTTTTAA-3′，互补位置为病毒RNA5′-未端(1-14位)；S-ODN2序列为5′-ACAATTGTCTGATT-3′，互补于病毒RNA的748-761位。结果表明特异性反义S-ODN对Polio病毒增殖的抑制作用与其剂量呈正相关并与开始作用的时间明显相关，加入时间越晚其作用越不明显，亦同时表明反义S-ODN能明显抑制子代感染性病毒的产生。提示反义S-ODN确能抑制Polio病毒复制。Polio病毒RNA5′-未端700±碱基无编码功能，但对病毒复制是必需的，因而S-ODN1的作用可能是直接抑制了病毒的复制。S-ODN2的互补区是病毒蛋白VP4的起始密码(767位)上游，此区对于病毒蛋白翻译很重要。S-ODN2与此区结合后既阻碍了病毒RNA的翻译功能又破坏了其作为病毒核酸复制的模块。
, http://www.100md.com
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Agrawal S,Ikeuchi T,Sun D,et al.Inhibition of human immunodeficiency virus in early infected and chronically infected cells by antisense oligodeoxynucleotides and their phosphorothioate analogues.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:7790.
2 汤 华，任中原，张 灏，等.人乙肝病毒体外增殖系统的建立及反义寡聚硫代磷酸脱氧核苷对其抗原表达的抑制作用.见：病毒性肝炎防治研究.北京：中国科学出版社，1991：524-529.
3 Toyoda H,Kohara M,Kataoka Y,et al.Complete nucleotide sequences of all three poliovirus serotype genomes,Implication for gentic relationship,gene function and antigenic determinants.J Mol Biol,1984,174:561.
4 宗建超、倪爱国、任中原，等.反义DNA研究I.硫代DNA片段合成.南开大学学报，1991，3：33.
(收稿：1992-11-23 修回L1993-03-11), 百拇医药
单位：300070 天津医学院微生物学教研室(汤 华，任中原，张 灏)；南开大学分子生物学研究所(宗建超，倪爱国，刘福森)
关键词：
中华医学杂志930618 已有研究表明较低浓度反义寡聚硫代磷酸脱氧核苷(S-ODN)能有效地抑制HIV〔1〕及HBV〔2〕基因表达，为探讨S-ODN对病毒增殖的直接抑制作用，选用RNA病毒(Polio病毒)作为靶病毒，合成了两个与其基因特异性互补的S-ODN，在细胞培养系统中证明了它对Polio病毒增殖的特异性抑制作用。
一、材料与方法
1.HeLa细胞及Polio病毒Ⅰ型(sabin株)培养：按常规方法进行培养并滴定病毒毒力。
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2.反义S-ODN的设计与合成：根据Toyoda等〔3〕报道的Polio病毒Ⅰ型的核酸序列，经微机与其它已知人类基因顺序进行同源性比较，设计出长为14个核苷酸组成的特异性互补于Polio病毒Ⅰ型基因的片段，按文献[4]介绍的方法进行合成与纯化。
3.S-ODN对Polio病毒Ⅰ型在Hela细胞中增殖所致细胞病变(CPE)的抑制作用：在24孔培养板上进行。100半数组织细胞培养感染量(TCID50)的病毒液常规吸附于单层Hela细胞后，加含不同浓度S-ODN的维持液，同样培养3天，观察CPE；或加维持液，在其后0、3、6、12小时分别加S-ODN，同样培养3天，观察CPE。
4.S-ODN对Polio病毒Ⅰ型在Hela细胞中增殖产生感染性病毒的抑制作用：100TICD50病毒常规接种后，加入不同浓度的S-ODN维持液，同样培养3天，冻融细胞、离心收集上清液，分别滴定其TCID50。
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二、结果
1.反义S-ODN对Polio病毒Ⅰ型在Hela细胞中增殖所致CPE的抑制作用：在0.6μmol/L浓度时反义S-ODN1、S-ODN2、都未显示明显的抑制作用，6μmol/L时则100%抑制了病毒所致CPE的作用。
2.CPE抑制作用与反义S-ODN加入时间关系：在病毒吸附后不同时间加入6μmol/L的反义S-ODN1或S-ODN2，同样培养3天后观察结果表明：在3小时以内加 时则能抑制80%以上的CPE，而在12小时加入时则几乎不能抑制CPE的形成，两者作用无明显差异。。
3.反义S-ODN对Polio病毒Ⅰ型在Hela细胞中增殖产生感染性病毒的抑制作用：在0.6μmol/L时S-ODN1及S-ODN2能分别降低2、1个对数值的TCID50；在1.2μmol/L时均能降低3个对数值；≥3μmol/L时则病毒原液不稀释接种亦不引起CPE。
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三、讨论
Polio病毒是一单股正链RNA病毒，其RNA既作为病毒复制的模块又直接指导病毒蛋白合成。本试验设计的反义DNA片段：S-ODN1序列为5′-CAGAGCTGTTTTAA-3′，互补位置为病毒RNA5′-未端(1-14位)；S-ODN2序列为5′-ACAATTGTCTGATT-3′，互补于病毒RNA的748-761位。结果表明特异性反义S-ODN对Polio病毒增殖的抑制作用与其剂量呈正相关并与开始作用的时间明显相关，加入时间越晚其作用越不明显，亦同时表明反义S-ODN能明显抑制子代感染性病毒的产生。提示反义S-ODN确能抑制Polio病毒复制。Polio病毒RNA5′-未端700±碱基无编码功能，但对病毒复制是必需的，因而S-ODN1的作用可能是直接抑制了病毒的复制。S-ODN2的互补区是病毒蛋白VP4的起始密码(767位)上游，此区对于病毒蛋白翻译很重要。S-ODN2与此区结合后既阻碍了病毒RNA的翻译功能又破坏了其作为病毒核酸复制的模块。
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注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Agrawal S,Ikeuchi T,Sun D,et al.Inhibition of human immunodeficiency virus in early infected and chronically infected cells by antisense oligodeoxynucleotides and their phosphorothioate analogues.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:7790.
2 汤 华，任中原，张 灏，等.人乙肝病毒体外增殖系统的建立及反义寡聚硫代磷酸脱氧核苷对其抗原表达的抑制作用.见：病毒性肝炎防治研究.北京：中国科学出版社，1991：524-529.
3 Toyoda H,Kohara M,Kataoka Y,et al.Complete nucleotide sequences of all three poliovirus serotype genomes,Implication for gentic relationship,gene function and antigenic determinants.J Mol Biol,1984,174:561.
4 宗建超、倪爱国、任中原，等.反义DNA研究I.硫代DNA片段合成.南开大学学报，1991，3：33.
(收稿：1992-11-23 修回L1993-03-11), 百拇医药