过氧化脂质对淋巴细胞功能的影响
作者：张 强 李 通
单位：100034 北京医科大学第一医院外科
关键词：
中华医学杂志930617 已证实在体外用化学体系产生的活性氧化物质可抑制淋巴细胞的多种功能〔1〕。本实验着重观察了过氧化亚油酸对淋巴细胞功能的影响，并探讨了其作用机制。
一、材料与方法
1.氢过氧化亚油酸(linoleic acid hydroperoxide，LOOH)的制备：参照文献[2，3]进行。将亚油酸配成12.7mmol/L，加入脂氧化酶，制得LOOH。以四乙氧基丙烷为标准品，用TBA反应荧光法〔4〕测得LOOH含量为30.48μmol MDA/L。
, http://www.100md.com 2.脾淋巴细胞的制备：无菌取小鼠脾，剪碎、过滤制成单细胞悬液。用0.85%NH4Cl溶解红细胞，洗涤后悬于培养液中。台盼蓝染色示活细胞≥95%。
3.淋巴细胞增殖反应测定：LACA鼠脾淋巴细胞悬液(2×106/ml)加入ConA 5μg/ml或LPS10μg/ml，再加入LOOH液。维生素E组则另加维生素E 50μg/ml。培养72小时，用MTT法5〔〕测定增殖反应。
4.白细胞介素2(IL2)测定：在LACA鼠脾淋巴细胞液中加入不同量的LOOH液，或再加维生素E50μg/ml，培养6小时后洗3次，重悬于培养液中(3.5×106/ml)，加ConA 5μg/ml，培养48小时，取上清液作为IL2待测样品，-20℃保存。另将Balb/c鼠脾淋巴细胞液(3.5×106/ml)，加到24孔培养板内(1ml/孔)，加ConA3μg/孔，培养48小时，吸弃上清0.54ml，加250μg/ml α-甲基甘露糖苷40μl，IL2待测样品0.5ml，继续培养48小时。用MTT法〔5〕测增殖，以ΔOD570表示IL2活性。
, 百拇医药
5.脾淋巴细胞过氧化脂质(lipid peroxide，LPO)测定：按文献[4]进行。将所测MDA量减去所加LOOH的MDA量，即为最后结果。以nmol MDA/2×106细胞表示。
6.细胞内谷胱甘肽(GSH)测定：将培养72小时的LACA鼠脾淋巴细胞(1×107)用生理盐水洗3次，置沉淀细胞于液氮中速冻融数次，使细胞破裂。按文献[6]测定GSH。
7.统计学方法：t检验，结果均以均值±标准差(
±s)。
二、结果
1.LOOH对淋巴细胞产生IL2和增殖的影响：培养液中随着LOOH剂量增加，IL2生成逐渐下降。提示LOOH的这种抑制使用。LOOH也可抑制淋巴细胞增殖反应(表1)。
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表1 LOOH对淋巴细胞增殖反应的抑制率(%，±s) LOOH剂量(μl/ml)
n
T淋巴细胞
B淋巴细胞
不加VitE
加VitE
不加VitE
加VitE
2
8
18.5±2.6
, 百拇医药
7.0±1.7*
17.9±1.9
5.0±2.1*
4
8
38.3±2.5
11.4±2.2*
37.3±2.2
11.6±1.9*
6
8
, http://www.100md.com 53.5±2.7
27.7±1.6*
52.2±4.4
31.3±3.1*
8
8
70.6±3.2
57.1±4.8*
68.8±3.2
58.1±4.3*
*与不加VitE组相比，P<0.001
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2.LOOH对淋巴细胞GSH含量和线粒体功能的影响：表2显示淋巴细胞内GSH含量随LOOH剂量增加而下降，加入维生素E则淋巴细胞内GSH也有所减少，但与不加维生素E者相比，差异无显著意义。MTT被活性细胞线粒体代谢为甲
，甲形成的多少可反映线粒体功能。5.0×106个细胞与LOOH培养72小时测定甲形成量(OD570)，结果显示LOOH可抑制淋巴细胞线粒体功能，维生素E可减轻这种作用。
表2 LOOH对淋巴细胞GSH和线粒体功能的影响(±s) LOOH剂量(μl/ml)
, 百拇医药
n
GSH(nmol/107细胞)
线粒体功能(D570)
不加VitE
加VitE
不加VitE
加VitE
0
6
2.97±0.23
2.93±0.23
0.420±0.010
, 百拇医药
0.431±0.007
4
6
2.52±0.17
2.73±0.21
0.364±0.008
0.392±0.010
8
6
2.11±0.24
2.41±0.24
0.318±0.006
, 百拇医药
0.378±0.006
*与不加VitE组相比，P<0.001
3.LOOH对淋巴细胞LPO水平的影响：LOOH可使淋巴细胞LPO水平迅速升高。淋巴细胞与LOOH(8μl/ml)温育30分钟其LPO为基值的330%，2小时为基值的460%，以后不再继续增加。表3显示淋巴细胞与LOOH温育3小时其LPO水平升高与LOOH剂量呈正相关，同时加入维生素E(50μg/ml)则LPO水平低于不加维生素E者。
表3 LOOH对淋巴细胞PLO水平的的影响(±s) LOOH剂量(μl/ml)
n
LPO(×10-2nmol MDA/2×106细胞)
, 百拇医药
不加VitE
加VitE
0
6
5.46±0.14
5.12±0.24*
2
6
10.74±0.48
7.34±0.40**
4
6
, http://www.100md.com
16.04±0.26
8.83±0.34**
6
6
20.44±0.41
13.67±0.39**
8
6
26.60±0.43
20.71±0.35**
*与不加VitE组相比，*P<0.02**P<0.001
, 百拇医药
4.亚油酸对淋巴细胞上述指标的影响：在细胞悬液中加入12.7mmol/L的亚油酸(8μl/ml)，相同方法测定的这些指标与正常对照相同。
三、讨论
我们以前的研究和国外的研究表明有机过氧化物可抑制巨噬细胞功能〔4〕和淋巴细胞增殖反应〔7〕。但对IL2生成影响的报道尚未见到。IL2由受激活的T辅助细胞产生，广泛地参与许多免疫反应，为一种极为重要的淋巴因子，对机体免疫功能具有重要作用。本实验体外观察了存在于机体内的一种过氧脂质——LOOH对淋巴细胞功能的影响。结果表示LOOH可抑制淋巴细胞产生IL2以及增殖激活反应，呈剂量-效应关系，而亚油酸则无此作用。LOOH的这种作用可能主要通过诱发淋巴细胞脂质过氧化。LOOH可使淋巴细胞LPO水平升高，并呈剂量-效应关系。加入脂质过氧化链式反应阻断剂维生素E可以减轻LOOH的上述作用。本实验还显示LOOH可抑制线粒体功能，减少GSH含量。这两者的状态与淋巴细胞功能有密切关系〔8～10〕。本实验结果表示过氧化脂质可抑制淋巴细胞产生IL2和增殖反应，其作用机制与其诱发脂质过氧化、抑制线粒体功能、减少细胞内GSH含量有关。
, 百拇医药
参考文献
1 el-Hag A,Lipsky PE,Bennett M,et al.Immunomodulation byneutrophil my eoleroxidase and hydrogen peroxide:differential susceptibilily of human lymphocyte fuctions.J Immunol,1986,136:3420.
2 Gardner HW.Isolation of a pure ismer of linoleic acid hydroperoxide.Lipids,1975,10:248.
3 Ohkawa H,Ohishi N,Yagi K.Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid.J Lipid Res,1978,19:1053.
, 百拇医药
4 张 强，李 通.脂质过氧化作用对单核巨噬细胞系统功能的影响.上海免疫学杂志，1992，12：146.
5 志明，赵西龙，薛 彬.用721分光光度计测定淋巴细胞增殖反应MTT颜色反应法.上海免疫学杂志，1990，10：172.
6 陈生弟，丁训诚，周孝达.MPTP对鼠肝粒体和微粒体谷胱甘肽含量的影响.上海医学，1990，13：343.
7 Shimura J,Shimura F,Hosoya N.Functional disabilityof rat splenocytes provoked to lipid peroxidation by cumene hydroperoxide.Biochim Biophys Acta,1985,845:43.
8 Holman RG,Maier RV.Oxidant-induced endothelial leak correlates with decreased cellular energy levels.Am Rev Respir Dis,1990;141:134.
, http://www.100md.com
9 Carson DA,Seto S,Wasson DB.Lymphocyte dysfunction after DNA damage by toxic oxygen species.A model of immunodeficiency.J Exp Med,1986,163:746.
10 Suthanthiran M,Anderson ME,Sharma VK,et al.Glutathione regulates activation-dependent DNA synthesis in highly purified normal human T lymphocytes stimulated via the CD2 and CD3 antigen.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:3343.
(收稿：1992-09-11 修回：1993-03-05), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院外科
关键词：
中华医学杂志930617 已证实在体外用化学体系产生的活性氧化物质可抑制淋巴细胞的多种功能〔1〕。本实验着重观察了过氧化亚油酸对淋巴细胞功能的影响，并探讨了其作用机制。
一、材料与方法
1.氢过氧化亚油酸(linoleic acid hydroperoxide，LOOH)的制备：参照文献[2，3]进行。将亚油酸配成12.7mmol/L，加入脂氧化酶，制得LOOH。以四乙氧基丙烷为标准品，用TBA反应荧光法〔4〕测得LOOH含量为30.48μmol MDA/L。
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3.淋巴细胞增殖反应测定：LACA鼠脾淋巴细胞悬液(2×106/ml)加入ConA 5μg/ml或LPS10μg/ml，再加入LOOH液。维生素E组则另加维生素E 50μg/ml。培养72小时，用MTT法5〔〕测定增殖反应。
4.白细胞介素2(IL2)测定：在LACA鼠脾淋巴细胞液中加入不同量的LOOH液，或再加维生素E50μg/ml，培养6小时后洗3次，重悬于培养液中(3.5×106/ml)，加ConA 5μg/ml，培养48小时，取上清液作为IL2待测样品，-20℃保存。另将Balb/c鼠脾淋巴细胞液(3.5×106/ml)，加到24孔培养板内(1ml/孔)，加ConA3μg/孔，培养48小时，吸弃上清0.54ml，加250μg/ml α-甲基甘露糖苷40μl，IL2待测样品0.5ml，继续培养48小时。用MTT法〔5〕测增殖，以ΔOD570表示IL2活性。
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5.脾淋巴细胞过氧化脂质(lipid peroxide，LPO)测定：按文献[4]进行。将所测MDA量减去所加LOOH的MDA量，即为最后结果。以nmol MDA/2×106细胞表示。
6.细胞内谷胱甘肽(GSH)测定：将培养72小时的LACA鼠脾淋巴细胞(1×107)用生理盐水洗3次，置沉淀细胞于液氮中速冻融数次，使细胞破裂。按文献[6]测定GSH。
7.统计学方法：t检验，结果均以均值±标准差(
±s)。二、结果
1.LOOH对淋巴细胞产生IL2和增殖的影响：培养液中随着LOOH剂量增加，IL2生成逐渐下降。提示LOOH的这种抑制使用。LOOH也可抑制淋巴细胞增殖反应(表1)。
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表1 LOOH对淋巴细胞增殖反应的抑制率(%，
±s) LOOH剂量(μl/ml)n
T淋巴细胞
B淋巴细胞
不加VitE
加VitE
不加VitE
加VitE
2
8
18.5±2.6
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7.0±1.7*
17.9±1.9
5.0±2.1*
4
8
38.3±2.5
11.4±2.2*
37.3±2.2
11.6±1.9*
6
8
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27.7±1.6*
52.2±4.4
31.3±3.1*
8
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70.6±3.2
57.1±4.8*
68.8±3.2
58.1±4.3*
*与不加VitE组相比，P<0.001
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2.LOOH对淋巴细胞GSH含量和线粒体功能的影响：表2显示淋巴细胞内GSH含量随LOOH剂量增加而下降，加入维生素E则淋巴细胞内GSH也有所减少，但与不加维生素E者相比，差异无显著意义。MTT被活性细胞线粒体代谢为甲
，甲形成的多少可反映线粒体功能。5.0×106个细胞与LOOH培养72小时测定甲形成量(OD570)，结果显示LOOH可抑制淋巴细胞线粒体功能，维生素E可减轻这种作用。表2 LOOH对淋巴细胞GSH和线粒体功能的影响(
±s) LOOH剂量(μl/ml), 百拇医药
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GSH(nmol/107细胞)
线粒体功能(D570)
不加VitE
加VitE
不加VitE
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2.52±0.17
2.73±0.21
0.364±0.008
0.392±0.010
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2.11±0.24
2.41±0.24
0.318±0.006
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0.378±0.006
*与不加VitE组相比，P<0.001
3.LOOH对淋巴细胞LPO水平的影响：LOOH可使淋巴细胞LPO水平迅速升高。淋巴细胞与LOOH(8μl/ml)温育30分钟其LPO为基值的330%，2小时为基值的460%，以后不再继续增加。表3显示淋巴细胞与LOOH温育3小时其LPO水平升高与LOOH剂量呈正相关，同时加入维生素E(50μg/ml)则LPO水平低于不加维生素E者。
表3 LOOH对淋巴细胞PLO水平的的影响(
±s) LOOH剂量(μl/ml)n
LPO(×10-2nmol MDA/2×106细胞)
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不加VitE
加VitE
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5.46±0.14
5.12±0.24*
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10.74±0.48
7.34±0.40**
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16.04±0.26
8.83±0.34**
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20.44±0.41
13.67±0.39**
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26.60±0.43
20.71±0.35**
*与不加VitE组相比，*P<0.02**P<0.001
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4.亚油酸对淋巴细胞上述指标的影响：在细胞悬液中加入12.7mmol/L的亚油酸(8μl/ml)，相同方法测定的这些指标与正常对照相同。
三、讨论
我们以前的研究和国外的研究表明有机过氧化物可抑制巨噬细胞功能〔4〕和淋巴细胞增殖反应〔7〕。但对IL2生成影响的报道尚未见到。IL2由受激活的T辅助细胞产生，广泛地参与许多免疫反应，为一种极为重要的淋巴因子，对机体免疫功能具有重要作用。本实验体外观察了存在于机体内的一种过氧脂质——LOOH对淋巴细胞功能的影响。结果表示LOOH可抑制淋巴细胞产生IL2以及增殖激活反应，呈剂量-效应关系，而亚油酸则无此作用。LOOH的这种作用可能主要通过诱发淋巴细胞脂质过氧化。LOOH可使淋巴细胞LPO水平升高，并呈剂量-效应关系。加入脂质过氧化链式反应阻断剂维生素E可以减轻LOOH的上述作用。本实验还显示LOOH可抑制线粒体功能，减少GSH含量。这两者的状态与淋巴细胞功能有密切关系〔8～10〕。本实验结果表示过氧化脂质可抑制淋巴细胞产生IL2和增殖反应，其作用机制与其诱发脂质过氧化、抑制线粒体功能、减少细胞内GSH含量有关。
, 百拇医药
参考文献
1 el-Hag A,Lipsky PE,Bennett M,et al.Immunomodulation byneutrophil my eoleroxidase and hydrogen peroxide:differential susceptibilily of human lymphocyte fuctions.J Immunol,1986,136:3420.
2 Gardner HW.Isolation of a pure ismer of linoleic acid hydroperoxide.Lipids,1975,10:248.
3 Ohkawa H,Ohishi N,Yagi K.Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid.J Lipid Res,1978,19:1053.
, 百拇医药
4 张 强，李 通.脂质过氧化作用对单核巨噬细胞系统功能的影响.上海免疫学杂志，1992，12：146.
5 志明，赵西龙，薛 彬.用721分光光度计测定淋巴细胞增殖反应MTT颜色反应法.上海免疫学杂志，1990，10：172.
6 陈生弟，丁训诚，周孝达.MPTP对鼠肝粒体和微粒体谷胱甘肽含量的影响.上海医学，1990，13：343.
7 Shimura J,Shimura F,Hosoya N.Functional disabilityof rat splenocytes provoked to lipid peroxidation by cumene hydroperoxide.Biochim Biophys Acta,1985,845:43.
8 Holman RG,Maier RV.Oxidant-induced endothelial leak correlates with decreased cellular energy levels.Am Rev Respir Dis,1990;141:134.
, http://www.100md.com
9 Carson DA,Seto S,Wasson DB.Lymphocyte dysfunction after DNA damage by toxic oxygen species.A model of immunodeficiency.J Exp Med,1986,163:746.
10 Suthanthiran M,Anderson ME,Sharma VK,et al.Glutathione regulates activation-dependent DNA synthesis in highly purified normal human T lymphocytes stimulated via the CD2 and CD3 antigen.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:3343.
(收稿：1992-09-11 修回：1993-03-05), http://www.100md.com