人淋巴细胞生长激素受体基因的表达及其调节
作者：杨毅 郭履 刘湘云 郭礼和 朱丽华
单位：200032上海医科大学儿科医院(杨毅、郭履 、刘湘云)，中国科学院上海细胞所(郭礼和、朱丽华)
关键词：
中华医学杂志930816 生长激素(GH)在免疫系统的发育和功能维持中的重要作用，已越来赵引起人们的关注[1]。现已证实人淋巴细胞存在生长激素受体(GHR)[2]，深入研究淋巴细胞GHR的代谢活动及基因表达对阐明GH与免疫系统之间的调节机制具有重要意义。为此，我们构建了hGHR DNA探针，用核酸杂交方法检测人外周血淋巴细胞hGHRmRNA的表达水平，观察年龄变化、丝裂原刺激、以及hGH对淋巴细胞hGNRmRNA表达水平的影响和调节，现报道如下。
一、材料与方法
, http://www.100md.com
1.研究对象及标本来源：以正常人静脉血淋巴细胞为检测材料，其来源：(1)上海市血液中心伊朗成人献血者；(2)本校妇产科医院产房提供脐血；(3)本校中山医院60岁以上体检者；(4)本院体检儿童。
2.主要试剂及材料：(1)hGHR DNA探针：用PCR方法构建(另文发表)；(2)hGH：为基因重组产品(rhGH),由中国科学院上海细胞所基因工程组提供。
3.方法：(1)淋巴细胞总RNA分离[3]：用淋巴细胞分离液分离肝素抗素凝血中的单个核细胞，玻器吸附法去除吞噬细胞后经磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤两次，置90μl含10mmol/L氧矾核糖核苷的TE溶液中，加5%NP-40 10μl裂解细胞膜，取胞浆，用等体积酚氯仿异戊醇混合液(25：24：1)抽提两次，加无水乙醇，存放于-70℃，杂交实验前回收RNA，并测OD260以定量。(2)点杂交检测hGHRmRNA：用乙二醛法变性的定量RNA样品点在尼龙膜上，按常法烘干；用32P-dATP以随机引物法标记hGHP DNA探针；65℃杂交24小时，洗膜后压X光片，于-70℃曝光5～7天。(3)hGHRmRNA定量分析：倍比稀释已知量的PTZ19u-hGHR重组质粒，与RNA样品同时进行点杂交作一标准曲线。放射自显影后作X线斑点灰度扫描(用计算机图像处理系统)，算出样品中hGHRmRNA含量，结果以amol/μgRNA表示。(4)观察PHA(50μg/ml)、Con A(50μg/ml)和hGH(200ng/ml)分别与淋巴细胞共同孵育18小时后，测该细胞hGHRmRNA表达水平。
, 百拇医药
二、结果与讨论
1.淋巴细胞hGHRmRNA水平：分6个年龄组共检测104份标本，其淋巴细胞hGHRmRNA水平分别为：成人组(18例)4.5±1.5;60～75岁组(14例)3.8±1.0;13～10岁组(14例)2.5±0.8;9～6岁组(15例)2.3±0.7;≤5岁组(17例)2.5±0.5；新生儿组(26例)1.9±1.0。提示，淋巴细胞hGHRmRNA转录水平随年龄而变化，初生时最低，而后迅速增加，但在整个儿童期直至青春前期都没有明显变化(P>0.05)，在成年期达到高峰。t检验，各儿童组与成人组相比，差异均有非常显著意义(P<0.001)。进入老年期后hGHRmRNA水平有所下降，但与成年期相比差异无显著意义(P>0.2)。说明淋巴细胞hGHR不仅在与配体结合水平，而且在mRNA转录水平都表现出与年龄相关的变化。这种变化趋势与人体免疫系统发育成熟的年龄过程是平行的，提示淋巴细胞作为GH作用的靶细胞在其生长分化过程中受到GH的影响和调节。
, 百拇医药 2.几种培养物对hGHRmRNA水平影响：加入PHA、Con或AhGH后6个组hGHRmRNA水平提高的均数分别为0.5、12.0及-14.5。用同体比较的t检验方法处理，经PHA或Con A刺激后hGHRmRNA水平虽有所增加，但无统计学意义(P>0.1)，表明淋巴细胞活化时其hGHR的表达较之静息状态时的增加差异无显著性意义，提示GH可能并不参予细胞活化过程的调节。hGH对自身受体的调节十分复杂，研究结果各异[4,5]，我们实验结果显示，加入200ng/ml hGH后，18小时培养物的hGHR基因表达水平明显降低(P<0.001)，说明hGH下调hGHR的作用在hGHRmRNA转录时已出现。至于淋巴细胞自身合成和分泌极微量的GH与其表达GHR之间的调节关系尚有待进一步研究。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Kelley KW.Growth hormone,lymphocytes and macrophages.Biochem Pharmacol,1989,38:705
, 百拇医药
2 Kiess W,Butenandt O.Specific growth hormone reeptors on human peripheral mononuclear cells:reexpression,identification,and characterization.J Clin Endocrinol Metab,1985,60:740.
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,Molecular cloning:A laboratiory manual.2nd.New York:Cold Spring Harbor Laboratories,1989:7
4 Mathews LS,et al.Regulation of rat growth hormone receptor gene expression.J Biological Chemistry.1989,264:9905
5 Stewart C,et al.Growth Hormone receptors in lymphocytes of growth hormone-deficient children.Arch Biochem Biophy.1983,220:309.
(收稿:1992-09-11 修回:1993-05-25), http://www.100md.com
单位：200032上海医科大学儿科医院(杨毅、郭履 、刘湘云)，中国科学院上海细胞所(郭礼和、朱丽华)
关键词：
中华医学杂志930816 生长激素(GH)在免疫系统的发育和功能维持中的重要作用，已越来赵引起人们的关注[1]。现已证实人淋巴细胞存在生长激素受体(GHR)[2]，深入研究淋巴细胞GHR的代谢活动及基因表达对阐明GH与免疫系统之间的调节机制具有重要意义。为此，我们构建了hGHR DNA探针，用核酸杂交方法检测人外周血淋巴细胞hGHRmRNA的表达水平，观察年龄变化、丝裂原刺激、以及hGH对淋巴细胞hGNRmRNA表达水平的影响和调节，现报道如下。
一、材料与方法
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1.研究对象及标本来源：以正常人静脉血淋巴细胞为检测材料，其来源：(1)上海市血液中心伊朗成人献血者；(2)本校妇产科医院产房提供脐血；(3)本校中山医院60岁以上体检者；(4)本院体检儿童。
2.主要试剂及材料：(1)hGHR DNA探针：用PCR方法构建(另文发表)；(2)hGH：为基因重组产品(rhGH),由中国科学院上海细胞所基因工程组提供。
3.方法：(1)淋巴细胞总RNA分离[3]：用淋巴细胞分离液分离肝素抗素凝血中的单个核细胞，玻器吸附法去除吞噬细胞后经磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤两次，置90μl含10mmol/L氧矾核糖核苷的TE溶液中，加5%NP-40 10μl裂解细胞膜，取胞浆，用等体积酚氯仿异戊醇混合液(25：24：1)抽提两次，加无水乙醇，存放于-70℃，杂交实验前回收RNA，并测OD260以定量。(2)点杂交检测hGHRmRNA：用乙二醛法变性的定量RNA样品点在尼龙膜上，按常法烘干；用32P-dATP以随机引物法标记hGHP DNA探针；65℃杂交24小时，洗膜后压X光片，于-70℃曝光5～7天。(3)hGHRmRNA定量分析：倍比稀释已知量的PTZ19u-hGHR重组质粒，与RNA样品同时进行点杂交作一标准曲线。放射自显影后作X线斑点灰度扫描(用计算机图像处理系统)，算出样品中hGHRmRNA含量，结果以amol/μgRNA表示。(4)观察PHA(50μg/ml)、Con A(50μg/ml)和hGH(200ng/ml)分别与淋巴细胞共同孵育18小时后，测该细胞hGHRmRNA表达水平。
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二、结果与讨论
1.淋巴细胞hGHRmRNA水平：分6个年龄组共检测104份标本，其淋巴细胞hGHRmRNA水平分别为：成人组(18例)4.5±1.5;60～75岁组(14例)3.8±1.0;13～10岁组(14例)2.5±0.8;9～6岁组(15例)2.3±0.7;≤5岁组(17例)2.5±0.5；新生儿组(26例)1.9±1.0。提示，淋巴细胞hGHRmRNA转录水平随年龄而变化，初生时最低，而后迅速增加，但在整个儿童期直至青春前期都没有明显变化(P>0.05)，在成年期达到高峰。t检验，各儿童组与成人组相比，差异均有非常显著意义(P<0.001)。进入老年期后hGHRmRNA水平有所下降，但与成年期相比差异无显著意义(P>0.2)。说明淋巴细胞hGHR不仅在与配体结合水平，而且在mRNA转录水平都表现出与年龄相关的变化。这种变化趋势与人体免疫系统发育成熟的年龄过程是平行的，提示淋巴细胞作为GH作用的靶细胞在其生长分化过程中受到GH的影响和调节。
, 百拇医药 2.几种培养物对hGHRmRNA水平影响：加入PHA、Con或AhGH后6个组hGHRmRNA水平提高的均数分别为0.5、12.0及-14.5。用同体比较的t检验方法处理，经PHA或Con A刺激后hGHRmRNA水平虽有所增加，但无统计学意义(P>0.1)，表明淋巴细胞活化时其hGHR的表达较之静息状态时的增加差异无显著性意义，提示GH可能并不参予细胞活化过程的调节。hGH对自身受体的调节十分复杂，研究结果各异[4,5]，我们实验结果显示，加入200ng/ml hGH后，18小时培养物的hGHR基因表达水平明显降低(P<0.001)，说明hGH下调hGHR的作用在hGHRmRNA转录时已出现。至于淋巴细胞自身合成和分泌极微量的GH与其表达GHR之间的调节关系尚有待进一步研究。
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Kelley KW.Growth hormone,lymphocytes and macrophages.Biochem Pharmacol,1989,38:705
, 百拇医药
2 Kiess W,Butenandt O.Specific growth hormone reeptors on human peripheral mononuclear cells:reexpression,identification,and characterization.J Clin Endocrinol Metab,1985,60:740.
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,Molecular cloning:A laboratiory manual.2nd.New York:Cold Spring Harbor Laboratories,1989:7
4 Mathews LS,et al.Regulation of rat growth hormone receptor gene expression.J Biological Chemistry.1989,264:9905
5 Stewart C,et al.Growth Hormone receptors in lymphocytes of growth hormone-deficient children.Arch Biochem Biophy.1983,220:309.
(收稿:1992-09-11 修回:1993-05-25), http://www.100md.com