聚合酶链反应检测肺癌组织中乳头状瘤病毒DNA
作者：潘国强 佟倜 纪振东 郑永晨 王淑清
单位：130021长春，白求恩医科大学第一临床学院内科(潘国强，佟倜)，胸外科(纪振东)，儿科研究室(郑永晨)，放射线科(王淑清)
关键词：
中华医学杂志930815 人类乳头状瘤病毒(HPV)是人类易感病毒，它与人类鳞状上皮有高亲和性。用聚合酶链反应(PCR)技术已经证实宫颈癌、喉癌组织中有HPV DNA序列整合。基于宫颈、头颈部及支气管某些部位的粘膜同属鳞状上皮，我们采用PCR技术对肺癌组织中HPV DNA进行了检测。
一、材料和方法
1.标本来源：收集我院1991年3月至1992年5月间手术切除的，已经确诊的肺癌标本30例，其中男18例，女12例，年龄在38～69岁。长期大量吸烟者20例(吸烟指数 400～1600之间)，不吸烟者10例。病理类型为鳞状上皮细胞癌18例，未分化癌5例，鳞腺癌2例，腺癌5例。标本均在取下后立即置入液氮中保存。
, 百拇医药
2.主要仪器与试剂：(1)PCR DNA扩增仪FR-300(上海复旦大学生物实验技术研制所)。(2)紫外灯2F-3型(上海长兴机械厂)。(3)FDDNA多聚酶，dNTP等主要生物试剂，购于上海复旦大学生物技术开发公司及中国医学科学院。(4)PCR引物：本实验采用HPV公共引物[1，2]，其序列为：5'-GCACCAGGGATC ATAACTAATGG-3' 5'-CGTCCACAAGAGGGAATACTGATC-3'以381A型DNA合成仪合成。
2.方法
(1)组织DNA模板提取：低温保存的肺癌组织200mg，剪碎，胰酶消化，裂解液裂解，用饱合酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)混合液提取DNA，无水乙醇沉演，离心，最后将DNA模板溶于灭菌的离子水中。(2)PCR步骤：反应在0.5ml塑料离心管中进行，反应总体积50μl，其中包括模板DNA15μl，引物10μl,2.5mmol/L dNTP4μl,，10倍的PCR缓冲液5μl,FD DNA多聚酶10μl(一个单位)，蒸馏水6μl。PCR周期为92℃60秒，55℃45秒，70℃120秒，30个周期，最后加70℃300秒。取10μlPCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙喧染色，紫外灯下观察结果(附图)。
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注:1,2,3,4,5为HPV PCR阳性产物,6、7、8分别为阴性对照,9孔为
Ф×174噬菌体DNA HaeIII酶切片段、附图 HPV PCR产物电泳结果
二、结果
30例肺癌组织中含HPV DNA片段17例(56.7%)，其中13例为鳞状细胞癌(76.5%)，2例未分化癌(11.8%)，腺癌和鳞腺癌各1例(各5.9%)。此17例阳性患者中男10(58.8%)，女7例(41.2%)。吸烟情况统计，17例阳性患者中长期大量吸烟者12例，不吸烟者5例，13例HPV DNA阴性患者中，长期大量吸烟者8例，不吸烟者5例。对吸烟情况进行统计处理经卡方检验，P>0.01，差异无显著意义。
三、讨论
HPV是人类易感病毒，与人类鳞状上皮有高亲和性。近年来，已阐明HPV感染同许多肿瘤有关[3]，泌尿生殖道肿瘤，如宫颈癌几乎大部分病人从肿瘤组织中可查到HPV，呼吸道肿瘤，如喉癌也有报告指出与HPV有关，直肠癌、食管癌也有HPV感染的报告。而HPV感染与肺癌关系的研究较少，Syrjanen等[4]于1980年发现30%的支气管鳞状上皮癌活检组织提示有HPV感染的形态学改变。1987年Syrjanen等又用HPV16、11、6、18、30DNA混合型探针对99例支气管活检及手术切除的浸润性支气管鳞癌进行HPV DNA序列检测，其阳性率为5%(5/99)。我们的研究结果证明了肺癌的发生确与HPV感染密切相关，其阳性率约为56.7%。(17/30)。同时不难看出，应用PCR技术可以大大提高HPV DNA检出的阳性率。而采用DNA混合型探针进行的传统分子杂交方法则有其局限性，检出阳性率低。研究还提示(1)HPV与支气管鳞状上皮有很高的亲和性，支气管鳞癌的发生和HPV感染的关系密切。(2)长期以来吸烟并不能明显增加支气管鳞状上皮对HPV的亲和性。HPV感染和肺癌关系的研究拓宽了肺癌病因学研究的范围，同时，为从分子水平进一步研究病毒的致癌机理打下了基础。
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参考文献
1 Hriaan JC,General Primer-Mediated Polymerase Chain Reaction Permits the Detection of Sequenced and still anseauenced Human Papillimavirus Genotypes in Cervical Scrapes and Carcinomas.Int,J.Cancer,1990,45:644.
2 Manos Y,Ting D K,Wright A L.et al.Use of Polymerase Chain Reaction Amplification for the Detection of Genital Human Papillimaviruses.Cancer Cells,1989,7:209.
3 王修杰，罗元德，人类乳头状瘤病毒与人类肿瘤，国外医学肿瘤学分册，1989，5：142。
4 Syrjanen K J,Syrjanen SM,Humas Papillomavirus DNA in bronchial Squamous Cell Carcinoma.Lancet,1987,1:168.
(收稿：1992-12-24 修回：1993-04-01), 百拇医药
单位：130021长春，白求恩医科大学第一临床学院内科(潘国强，佟倜)，胸外科(纪振东)，儿科研究室(郑永晨)，放射线科(王淑清)
关键词：
中华医学杂志930815 人类乳头状瘤病毒(HPV)是人类易感病毒，它与人类鳞状上皮有高亲和性。用聚合酶链反应(PCR)技术已经证实宫颈癌、喉癌组织中有HPV DNA序列整合。基于宫颈、头颈部及支气管某些部位的粘膜同属鳞状上皮，我们采用PCR技术对肺癌组织中HPV DNA进行了检测。
一、材料和方法
1.标本来源：收集我院1991年3月至1992年5月间手术切除的，已经确诊的肺癌标本30例，其中男18例，女12例，年龄在38～69岁。长期大量吸烟者20例(吸烟指数 400～1600之间)，不吸烟者10例。病理类型为鳞状上皮细胞癌18例，未分化癌5例，鳞腺癌2例，腺癌5例。标本均在取下后立即置入液氮中保存。
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2.主要仪器与试剂：(1)PCR DNA扩增仪FR-300(上海复旦大学生物实验技术研制所)。(2)紫外灯2F-3型(上海长兴机械厂)。(3)FDDNA多聚酶，dNTP等主要生物试剂，购于上海复旦大学生物技术开发公司及中国医学科学院。(4)PCR引物：本实验采用HPV公共引物[1，2]，其序列为：5'-GCACCAGGGATC ATAACTAATGG-3' 5'-CGTCCACAAGAGGGAATACTGATC-3'以381A型DNA合成仪合成。
2.方法
(1)组织DNA模板提取：低温保存的肺癌组织200mg，剪碎，胰酶消化，裂解液裂解，用饱合酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)混合液提取DNA，无水乙醇沉演，离心，最后将DNA模板溶于灭菌的离子水中。(2)PCR步骤：反应在0.5ml塑料离心管中进行，反应总体积50μl，其中包括模板DNA15μl，引物10μl,2.5mmol/L dNTP4μl,，10倍的PCR缓冲液5μl,FD DNA多聚酶10μl(一个单位)，蒸馏水6μl。PCR周期为92℃60秒，55℃45秒，70℃120秒，30个周期，最后加70℃300秒。取10μlPCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙喧染色，紫外灯下观察结果(附图)。
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注:1,2,3,4,5为HPV PCR阳性产物,6、7、8分别为阴性对照,9孔为
Ф×174噬菌体DNA HaeIII酶切片段、附图 HPV PCR产物电泳结果
二、结果
30例肺癌组织中含HPV DNA片段17例(56.7%)，其中13例为鳞状细胞癌(76.5%)，2例未分化癌(11.8%)，腺癌和鳞腺癌各1例(各5.9%)。此17例阳性患者中男10(58.8%)，女7例(41.2%)。吸烟情况统计，17例阳性患者中长期大量吸烟者12例，不吸烟者5例，13例HPV DNA阴性患者中，长期大量吸烟者8例，不吸烟者5例。对吸烟情况进行统计处理经卡方检验，P>0.01，差异无显著意义。
三、讨论
HPV是人类易感病毒，与人类鳞状上皮有高亲和性。近年来，已阐明HPV感染同许多肿瘤有关[3]，泌尿生殖道肿瘤，如宫颈癌几乎大部分病人从肿瘤组织中可查到HPV，呼吸道肿瘤，如喉癌也有报告指出与HPV有关，直肠癌、食管癌也有HPV感染的报告。而HPV感染与肺癌关系的研究较少，Syrjanen等[4]于1980年发现30%的支气管鳞状上皮癌活检组织提示有HPV感染的形态学改变。1987年Syrjanen等又用HPV16、11、6、18、30DNA混合型探针对99例支气管活检及手术切除的浸润性支气管鳞癌进行HPV DNA序列检测，其阳性率为5%(5/99)。我们的研究结果证明了肺癌的发生确与HPV感染密切相关，其阳性率约为56.7%。(17/30)。同时不难看出，应用PCR技术可以大大提高HPV DNA检出的阳性率。而采用DNA混合型探针进行的传统分子杂交方法则有其局限性，检出阳性率低。研究还提示(1)HPV与支气管鳞状上皮有很高的亲和性，支气管鳞癌的发生和HPV感染的关系密切。(2)长期以来吸烟并不能明显增加支气管鳞状上皮对HPV的亲和性。HPV感染和肺癌关系的研究拓宽了肺癌病因学研究的范围，同时，为从分子水平进一步研究病毒的致癌机理打下了基础。
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参考文献
1 Hriaan JC,General Primer-Mediated Polymerase Chain Reaction Permits the Detection of Sequenced and still anseauenced Human Papillimavirus Genotypes in Cervical Scrapes and Carcinomas.Int,J.Cancer,1990,45:644.
2 Manos Y,Ting D K,Wright A L.et al.Use of Polymerase Chain Reaction Amplification for the Detection of Genital Human Papillimaviruses.Cancer Cells,1989,7:209.
3 王修杰，罗元德，人类乳头状瘤病毒与人类肿瘤，国外医学肿瘤学分册，1989，5：142。
4 Syrjanen K J,Syrjanen SM,Humas Papillomavirus DNA in bronchial Squamous Cell Carcinoma.Lancet,1987,1:168.
(收稿：1992-12-24 修回：1993-04-01), 百拇医药