抗上皮膜抗原克隆抗体的研制鉴定与初步应用
作者：程正 范维珂 李培然 段积华
单位：630046重庆医科大学病理生理教研室
关键词：
中华医学杂志930814 乳脂球是乳腺上皮细胞以顶浆分泌的方式分泌乳脂时，包被在脂滴外的一层单位膜。膜上有多种与一般胞膜类似的蛋白成分。Heyderman等[1，2]用乳脂球膜提取物作为抗原制备了多克隆抗体与单克隆抗体，研究了这些抗原的组织学分布，发现其存在于上皮细胞的表面，尤以近腔面最为显著，故称为上皮膜抗原(Epithelial Membrane Antigen,EMA)。进一步研究EMA在肿瘤中的分布，发现它几乎存在于所有上皮性肿瘤，而不出现于非上皮性肿瘤，因而具有诊断与鉴别诊断的价值[3]。但在国内至今尚未见研制成功的报道。我们采用淋巴细胞杂交瘤技术，研制成功并生产了抗EMA单抗，经国内外多个单位应用于肿瘤病理诊断，其特异性和灵敏度均不亚于国际同类优质产品，现报道如下。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.人EMA的提取：参照Heyderman法[2]。
2.EMA的蛋白含量测定：采用Lowry法。
3.乳脂球膜的电镜观察：用H-600型电镜。
4.SDS-PAGE测定EMA蛋白组分及分子量：参考Tsang法[4]。
5.分泌抗EMA单抗的杂交瘤细胞株的建立：采用Galfre法及本室常规[5，6]。
6.杂交瘤细胞株的染色体核型鉴定：参考本室常规[7]。
7.抗EMA单抗的鉴定：(1)鼠IgG亚类分析：采用双向琼脂扩散法；(2)抗体效价测定：采用ELISA法；(3)识别抗原的分子量测定：采用免疫印迹法[4]；(4)组织特异性鉴定：采用免疫组化ABC-AEC法。正常组织采用7月龄引产胎儿21种的石蜡切片及美国国立医学中心的专利乳腺多组织石蜡切片。同时取部分组织与DAKO公司的抗EMA单抗进行对比染色，求其灵敏度与特异性。
, 百拇医药
附表 AEMA1单抗与肿瘤组织的免疫组化反应 肿瘤组织
检测例数
阳性例数
食道鳞癌
4
4
胃腺癌
2
2
结肠腺癌
5
5
肝细胞癌
, 百拇医药
4
1
胆管细胞癌
3
3
胰腺癌
2
2
肾透明细胞癌
3
3
肾腺癌
4
4
, 百拇医药
膀胱癌
5
5
皮肤鳞癌
8
肺腺鳞癌
3
8
肺低分化腺癌
1
3
乳腺癌
6
1
, 百拇医药
卵巢腺癌
4
6
宫颈鳞癌
5
4
宫内膜腺癌
3
5
恶性黑色素瘤
3
3
恶性淋巴瘤
, http://www.100md.com 5
0
垂体嗜酸性细胞瘤
2
0
脑膜瘤
2
0
子宫平滑肌肉瘤
1
0
多形性横纹肌肉瘤
1
0
, 百拇医药
合 计
76
59
二、结果
1.EMA的提取与鉴定：
用Lowry法测得乳脂球膜提取蛋白液度为982μg/ml。EMA提取液蛋白浓度为72μg/ml。前者在电镜下具有双层高电子密度区和中间低电子密度区的脂质膜结构，厚度86A。后者在SDS-PAGE电泳图谱中可出现11条较为清晰的蛋白区带，其分子量依次为14 600、16 500、27 400、31 300～35 800、41 400、46 700、54 000、62 900、69 400、81 600、134 100。
2.分泌抗EMA单抗的杂交瘤细胞株的建立：
, 百拇医药
用EMA提取物免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞(10：1)以42%聚乙二醇进行融合，HAT培养基选择性培养，ELISA及免疫组筛选、阳性细胞反复克隆化，获得一株能稳定分泌抗EMA单抗的杂交瘤细胞株，命名为AEMA1。其染色体众数为85(54～114)，分泌的单抗属小鼠IgG1亚类，免疫印迹显示能识别54 000的EMA蛋白，不与结蛋白或胶质纤维酸性蛋白起反应。免疫组化染色显示其相应抗原，分布于食道粘膜复鳞上皮及腺上皮、小支气管及肺泡上皮、胃及小肠腺上皮、气管粘膜假复层柱状上皮及腺上皮、肝内胆管上皮、胆囊上皮、胰外分泌腺上皮、肾远曲小管及集合管上皮、胸腺哈氏小体、甲状腺腺泡上皮、汗腺及皮脂腺上皮，乳腺腺泡及导管上皮、副睾管上皮等，而在皮肤鳞状上皮、肝细胞、肾近曲小管上皮、小肠粘膜上皮及其他组织细胞，包括脾、主动脉、脐带、胃肠平滑肌、骨骼肌、心肌、睾丸生殖细胞、大脑、小脑、延脑、胸腺淋巴细胞及各器官的结缔组织均未见EMA抗原分布。与国外进口EMA单抗染色结果相一致。用AEMA1单抗检测22种76例恶性肿瘤组织，结果显示该单抗险不与肝细胞癌起反应外，与16种(59例)上皮源性肿瘤增呈阳性反应，而与6种(14例)非上皮肿瘤则呈阴性反应。故其诊断上皮性肿瘤的灵敏度为95.2%，特异性为100%。
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三、讨论
EMA抗原成分比较复杂，所产生的抗体必然呈多样性。要获得优质单抗，关键在于筛选方法。本研究采用胎儿及乳腺多组织切片进行筛选，获得了特异性强、灵敏度高的抗EMA单抗。国外最常用的抗EMA单抗(E29)[2]，其灵敏度为84.8%，特异性为89.1%[8]，且与某些类型的恶性淋巴瘤、浆细胞瘤发生反应。本文报道的AEMA1在特异性及灵敏度上稍有提高，且与被检测的恶性淋巴瘤无反应，所以它在上皮源性肿瘤的诊断与鉴别诊断上具有良好的应用价值。
本课题为四川省卫生厅科学基金资助项目
参考文献
1 Heyderman E,Steele K,Ormerod MG.A new antigen on the epithelial membrane:Its immunoperoxidase localization n normal and neoplastic tissue.J Clin Pathol 1979,32:35.
, 百拇医药
2 Heyderman E,Strudley I,Powell G,et al.A new monoclonal antibody to epithelial membrane antigen(EMA)-E29.A comparison of its immunocytochemical reactivity with polyclonal anti-EMA antibodies and with another monoclonal HMFG-2.Br J Cancer1985,52:355.
3 Sloane JP,Orrmerod MG,Distribution of epithelial membrane antigen in normal and neoplastic tissue and its value in diagnostic tumor pathology.Cancer 1981,47:1786.
4 Tsang VCW,Peralta JM Simons AR,et al Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blot Techniques(EITB)for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis Metn Enzymol 1983,93:377.
, http://www.100md.com
5 Galfre G,Milstein C,Preparation of monoclonal antibodies:Strategies and proceduress.Meth Enzymol 1981,73:1
6 胡军，范维珂。分泌抗人角蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立及其抗体的初步鉴定，中国免疫学杂志1987；3：258。
7 汤为学，范维珂，余懋棠，小鼠可移植性肝癌(H615)与骨髓瘤细胞(NSI)杂色体核型分析。重庆医科大学学报1986，11：233。
8 Swanson P E.Monoclonal antibodies to human milk fat globule proteins.In:Wick MR,Siegal GP.eds.Monoclonal antibodies in diagnostic inmmunohistochemistry.New York.Marcel Dekker Inc.1988.227.
(收稿：1993-01-29 修回：1993-05-29), 百拇医药
单位：630046重庆医科大学病理生理教研室
关键词：
中华医学杂志930814 乳脂球是乳腺上皮细胞以顶浆分泌的方式分泌乳脂时，包被在脂滴外的一层单位膜。膜上有多种与一般胞膜类似的蛋白成分。Heyderman等[1，2]用乳脂球膜提取物作为抗原制备了多克隆抗体与单克隆抗体，研究了这些抗原的组织学分布，发现其存在于上皮细胞的表面，尤以近腔面最为显著，故称为上皮膜抗原(Epithelial Membrane Antigen,EMA)。进一步研究EMA在肿瘤中的分布，发现它几乎存在于所有上皮性肿瘤，而不出现于非上皮性肿瘤，因而具有诊断与鉴别诊断的价值[3]。但在国内至今尚未见研制成功的报道。我们采用淋巴细胞杂交瘤技术，研制成功并生产了抗EMA单抗，经国内外多个单位应用于肿瘤病理诊断，其特异性和灵敏度均不亚于国际同类优质产品，现报道如下。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.人EMA的提取：参照Heyderman法[2]。
2.EMA的蛋白含量测定：采用Lowry法。
3.乳脂球膜的电镜观察：用H-600型电镜。
4.SDS-PAGE测定EMA蛋白组分及分子量：参考Tsang法[4]。
5.分泌抗EMA单抗的杂交瘤细胞株的建立：采用Galfre法及本室常规[5，6]。
6.杂交瘤细胞株的染色体核型鉴定：参考本室常规[7]。
7.抗EMA单抗的鉴定：(1)鼠IgG亚类分析：采用双向琼脂扩散法；(2)抗体效价测定：采用ELISA法；(3)识别抗原的分子量测定：采用免疫印迹法[4]；(4)组织特异性鉴定：采用免疫组化ABC-AEC法。正常组织采用7月龄引产胎儿21种的石蜡切片及美国国立医学中心的专利乳腺多组织石蜡切片。同时取部分组织与DAKO公司的抗EMA单抗进行对比染色，求其灵敏度与特异性。
, 百拇医药
附表 AEMA1单抗与肿瘤组织的免疫组化反应 肿瘤组织
检测例数
阳性例数
食道鳞癌
4
4
胃腺癌
2
2
结肠腺癌
5
5
肝细胞癌
, 百拇医药
4
1
胆管细胞癌
3
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胰腺癌
2
2
肾透明细胞癌
3
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肾腺癌
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膀胱癌
5
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皮肤鳞癌
8
肺腺鳞癌
3
8
肺低分化腺癌
1
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乳腺癌
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卵巢腺癌
4
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宫颈鳞癌
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宫内膜腺癌
3
5
恶性黑色素瘤
3
3
恶性淋巴瘤
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0
垂体嗜酸性细胞瘤
2
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脑膜瘤
2
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子宫平滑肌肉瘤
1
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多形性横纹肌肉瘤
1
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合 计
76
59
二、结果
1.EMA的提取与鉴定：
用Lowry法测得乳脂球膜提取蛋白液度为982μg/ml。EMA提取液蛋白浓度为72μg/ml。前者在电镜下具有双层高电子密度区和中间低电子密度区的脂质膜结构，厚度86A。后者在SDS-PAGE电泳图谱中可出现11条较为清晰的蛋白区带，其分子量依次为14 600、16 500、27 400、31 300～35 800、41 400、46 700、54 000、62 900、69 400、81 600、134 100。
2.分泌抗EMA单抗的杂交瘤细胞株的建立：
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用EMA提取物免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞(10：1)以42%聚乙二醇进行融合，HAT培养基选择性培养，ELISA及免疫组筛选、阳性细胞反复克隆化，获得一株能稳定分泌抗EMA单抗的杂交瘤细胞株，命名为AEMA1。其染色体众数为85(54～114)，分泌的单抗属小鼠IgG1亚类，免疫印迹显示能识别54 000的EMA蛋白，不与结蛋白或胶质纤维酸性蛋白起反应。免疫组化染色显示其相应抗原，分布于食道粘膜复鳞上皮及腺上皮、小支气管及肺泡上皮、胃及小肠腺上皮、气管粘膜假复层柱状上皮及腺上皮、肝内胆管上皮、胆囊上皮、胰外分泌腺上皮、肾远曲小管及集合管上皮、胸腺哈氏小体、甲状腺腺泡上皮、汗腺及皮脂腺上皮，乳腺腺泡及导管上皮、副睾管上皮等，而在皮肤鳞状上皮、肝细胞、肾近曲小管上皮、小肠粘膜上皮及其他组织细胞，包括脾、主动脉、脐带、胃肠平滑肌、骨骼肌、心肌、睾丸生殖细胞、大脑、小脑、延脑、胸腺淋巴细胞及各器官的结缔组织均未见EMA抗原分布。与国外进口EMA单抗染色结果相一致。用AEMA1单抗检测22种76例恶性肿瘤组织，结果显示该单抗险不与肝细胞癌起反应外，与16种(59例)上皮源性肿瘤增呈阳性反应，而与6种(14例)非上皮肿瘤则呈阴性反应。故其诊断上皮性肿瘤的灵敏度为95.2%，特异性为100%。
, http://www.100md.com
三、讨论
EMA抗原成分比较复杂，所产生的抗体必然呈多样性。要获得优质单抗，关键在于筛选方法。本研究采用胎儿及乳腺多组织切片进行筛选，获得了特异性强、灵敏度高的抗EMA单抗。国外最常用的抗EMA单抗(E29)[2]，其灵敏度为84.8%，特异性为89.1%[8]，且与某些类型的恶性淋巴瘤、浆细胞瘤发生反应。本文报道的AEMA1在特异性及灵敏度上稍有提高，且与被检测的恶性淋巴瘤无反应，所以它在上皮源性肿瘤的诊断与鉴别诊断上具有良好的应用价值。
本课题为四川省卫生厅科学基金资助项目
参考文献
1 Heyderman E,Steele K,Ormerod MG.A new antigen on the epithelial membrane:Its immunoperoxidase localization n normal and neoplastic tissue.J Clin Pathol 1979,32:35.
, 百拇医药
2 Heyderman E,Strudley I,Powell G,et al.A new monoclonal antibody to epithelial membrane antigen(EMA)-E29.A comparison of its immunocytochemical reactivity with polyclonal anti-EMA antibodies and with another monoclonal HMFG-2.Br J Cancer1985,52:355.
3 Sloane JP,Orrmerod MG,Distribution of epithelial membrane antigen in normal and neoplastic tissue and its value in diagnostic tumor pathology.Cancer 1981,47:1786.
4 Tsang VCW,Peralta JM Simons AR,et al Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blot Techniques(EITB)for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis Metn Enzymol 1983,93:377.
, http://www.100md.com
5 Galfre G,Milstein C,Preparation of monoclonal antibodies:Strategies and proceduress.Meth Enzymol 1981,73:1
6 胡军，范维珂。分泌抗人角蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立及其抗体的初步鉴定，中国免疫学杂志1987；3：258。
7 汤为学，范维珂，余懋棠，小鼠可移植性肝癌(H615)与骨髓瘤细胞(NSI)杂色体核型分析。重庆医科大学学报1986，11：233。
8 Swanson P E.Monoclonal antibodies to human milk fat globule proteins.In:Wick MR,Siegal GP.eds.Monoclonal antibodies in diagnostic inmmunohistochemistry.New York.Marcel Dekker Inc.1988.227.
(收稿：1993-01-29 修回：1993-05-29), 百拇医药