大肠癌相关癌基因的研究
作者：田竟生 杨房生 王锡伟 张宏 陈德高
单位：100034北京市肿瘤防治研究所临床分子生物室
关键词：
中华医学杂志930813 癌症的发生、发展与转归是一系列复杂的多步性的变化过程[1]。近来，Stanbridge对于大肠癌的形成机制提出了新的模式；即在正常肠上皮细胞经过腺癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级转化成癌的进程中，涉及多种癌基因的激活和肿瘤抑制基因的丢失[2]。我们从分子水平先对24例大肠癌患者5种癌基因(ras、erbB、myb、myc和sis基因)进行检测，对78例大肠癌Ki-ras的点突变进行分析，以探索大肠癌中癌基因的变化规律，试图为大肠癌的基因诊断和预后提供线索。
一、材料和方法
1.人大肠癌的组织来源与高分子量DNA的制备：从外科手术室收集102例大肠癌患者新鲜标本，立即用常规酚氯仿抽提法提取高分子量的DNA。其中24例作5种癌基因检测，另78例作Ki-ras点突变。
, 百拇医药
2.DNA分子探针的制备与32P同位素标记：分别制备erbB、myb、myc、Ki-ras和sis五种癌基因的分子探针，再用α-32P-dNTP行缺口翻译法标记。
3.对上述靶DNA行硝酸纤维素膜或尼龙膜的吸印转移，进行Southern或斑点杂交。
4.采用聚合酶链反应(PCR)[3,4]，自行设计并合成-对Ki-ras第12位密码子的引物，将Ki-ras包括第12位密码子的108bp的片段予以体外扩增，使被测序列在数量上增长106倍。然后与3种寡聚核苷酸探针杂交。引物序列：
KA-12：GACTGAATATAAACTTGTGG
KB-12：CTATTGTTGGATCATATTCG
, http://www.100md.com
二、结果
1.Ras癌基因与人大肠癌的关系
在人类肿瘤中经常出现Ras基因家族的变化。ras基因家族包括3个成员(H-ras,Ki-ras和N-ras)。H-ras基因定位在人染色体12(12P21.1-ter),Ki-ras守位在人染色体1(1P22-32).ras基因家族的成员均以4个外显子编码一个分子量为21000的蛋白质，由于这个原因3个成员归属成为一个家族[5]。在ras基因家庭中，Ki-ras参予了大肠癌的癌变过程，因此我们首先对24例人大肠癌、癌旁和远端部分的正常肠组织DNA做了分析，发现5/24例(20.8%)大肠癌中出现Ki-ras基因的扩增，扩增的倍数为4～128倍。对另外的78例大人肠癌行Ki-ras点突变的研究。结果表明：35例存在Ki-ras的点突变(44.8%)，其中7例是第12位点的第一核苷酸G→T;8例是G→A，43例G→G另20例存在突变，但类型未定(附表)。
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附表 78例大肠癌标本Ki-ras第十二位密码子第一个核苷酸的突变情况
K12:GGT
K12:TGT
K12:AGT
其他
氨基酸
Gly
Cys
Ser
*
例数
43
, 百拇医药
8
8
20
百分数(%)
55
9
10
26
注:无法断定的突变类型
寡聚核苷酸探针顺序:
K12n(Gly):GTT-GAA-GCT-GGT-GGT-GGC-GTA-G
K12ab(Cys):***-***-***-TGT-***-***-*
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K12ab(Sys):***-***-***-AGT-***-***-*
2.与大肠癌相关的其它癌基因
除了研究Ki-ras癌基因扩增、点突变之外，还选择了其它常见的癌基因即erbB、myb、myc、Ki-ras和sis基因为分子探针，经32P标记后与上述24例人大肠癌、癌旁与远端正常组织DNA杂交，结果发现：以C-erbβ扩增的阳性率最高(8/24例为33.3%)，扩增8～64倍。其中6例在扩增的同时还存在重排，在EcoR1酶解大肠癌DNA与erbB探针杂交时出现异常杂交信号。在正常肠上皮组织DNA中仅出现5.3kb、10kb杂交信号。在在大肠癌组织DNA中，可出现2.0kb、2.9kb、4.0kb、7.0kb或11.5kb的杂交带。c-myb扩增结果是24例中有7例出现扩增(占29.2%)，扩增程度为8～512倍，而用myc和sis这两种癌基因进行检测时未发现异常。由此推论不仅Ki-ras基因参予了人大肠癌的癌变过程，而且erbB、myb癌基因也起了重要作用。
, 百拇医药
三、讨论
现已证实癌基因激活的机制，包括基因扩增，基因重排，点突变或启动子的插入。在这些变化之中，大肠癌出现Ki-ras基因的扩增、重排或点突变[6]。本研究的结果中5/24例中出现Ki-ras基因扩增，15/78例中出现Ki-ras第12密码子的第一个核苷酸G→T或G→A转换与当前国外的有关报道相一致[3，4]。本研究室曾对142例人大肠癌的P21表达做过免疫组化分析，发现85%～90%的大肠癌呈过量表达[7]，也支持Ki-ras在大肠癌癌变中起主要作用的看法。
综上所述，在人大肠癌的发生，发展过程中，Ki-ras的扩增、点突变起主要作用，同时erbB、myb基因同样涉及了这个演变过程。这种认识符合现代肿瘤形成的新理论、新观点。从应用前景来看，尤其是在大肠癌的基因诊断和预后判别的联系尚需进一步积累材料，方可提出应用之可能性。目前追踪工作尚在继续之中。
, 百拇医药
本课题受卫生部“七五”攻关项目资助
参考文献
1 Astrin SM,Costanzi C.The molecular genetics of coloncancer.Semin Oncol 1989,16:138.
2 Stanbridge EJ,Identifying tumour suppressor genes in human colorectal cancer.Science 1990,247:12.
3 Bos JL,Fearon ER,Hamilton SR,et al.Prevalence of ras gene mutations in human colorectal cancer,Nature 1987,327:293.
, 百拇医药 4 Suchy B,Zietz C,Rabes HM,K-ras point mutations in human colorectal carcinomas:relation to anerploidy and metastasis.Int,J.Cancer,1992,52:30.
5 Bos JL,ras oncogenes in human cancer:a review.Cancer Res,1989,49:4682.
6 Bishop JM,The molecrlar genetics of cancer.Science 1987,235:305.
7 Tian JS,Chen DG,An immunohistochemical analysis of ras oncogene expression in colon cancer Acta Anat Sinica (Supl)1991,P261.
(收稿：1992-02-02 修回：1993-05-24), http://www.100md.com
单位：100034北京市肿瘤防治研究所临床分子生物室
关键词：
中华医学杂志930813 癌症的发生、发展与转归是一系列复杂的多步性的变化过程[1]。近来，Stanbridge对于大肠癌的形成机制提出了新的模式；即在正常肠上皮细胞经过腺癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级转化成癌的进程中，涉及多种癌基因的激活和肿瘤抑制基因的丢失[2]。我们从分子水平先对24例大肠癌患者5种癌基因(ras、erbB、myb、myc和sis基因)进行检测，对78例大肠癌Ki-ras的点突变进行分析，以探索大肠癌中癌基因的变化规律，试图为大肠癌的基因诊断和预后提供线索。
一、材料和方法
1.人大肠癌的组织来源与高分子量DNA的制备：从外科手术室收集102例大肠癌患者新鲜标本，立即用常规酚氯仿抽提法提取高分子量的DNA。其中24例作5种癌基因检测，另78例作Ki-ras点突变。
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2.DNA分子探针的制备与32P同位素标记：分别制备erbB、myb、myc、Ki-ras和sis五种癌基因的分子探针，再用α-32P-dNTP行缺口翻译法标记。
3.对上述靶DNA行硝酸纤维素膜或尼龙膜的吸印转移，进行Southern或斑点杂交。
4.采用聚合酶链反应(PCR)[3,4]，自行设计并合成-对Ki-ras第12位密码子的引物，将Ki-ras包括第12位密码子的108bp的片段予以体外扩增，使被测序列在数量上增长106倍。然后与3种寡聚核苷酸探针杂交。引物序列：
KA-12：GACTGAATATAAACTTGTGG
KB-12：CTATTGTTGGATCATATTCG
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二、结果
1.Ras癌基因与人大肠癌的关系
在人类肿瘤中经常出现Ras基因家族的变化。ras基因家族包括3个成员(H-ras,Ki-ras和N-ras)。H-ras基因定位在人染色体12(12P21.1-ter),Ki-ras守位在人染色体1(1P22-32).ras基因家族的成员均以4个外显子编码一个分子量为21000的蛋白质，由于这个原因3个成员归属成为一个家族[5]。在ras基因家庭中，Ki-ras参予了大肠癌的癌变过程，因此我们首先对24例人大肠癌、癌旁和远端部分的正常肠组织DNA做了分析，发现5/24例(20.8%)大肠癌中出现Ki-ras基因的扩增，扩增的倍数为4～128倍。对另外的78例大人肠癌行Ki-ras点突变的研究。结果表明：35例存在Ki-ras的点突变(44.8%)，其中7例是第12位点的第一核苷酸G→T;8例是G→A，43例G→G另20例存在突变，但类型未定(附表)。
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附表 78例大肠癌标本Ki-ras第十二位密码子第一个核苷酸的突变情况
K12:GGT
K12:TGT
K12:AGT
其他
氨基酸
Gly
Cys
Ser
*
例数
43
, 百拇医药
8
8
20
百分数(%)
55
9
10
26
注:无法断定的突变类型
寡聚核苷酸探针顺序:
K12n(Gly):GTT-GAA-GCT-GGT-GGT-GGC-GTA-G
K12ab(Cys):***-***-***-TGT-***-***-*
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K12ab(Sys):***-***-***-AGT-***-***-*
2.与大肠癌相关的其它癌基因
除了研究Ki-ras癌基因扩增、点突变之外，还选择了其它常见的癌基因即erbB、myb、myc、Ki-ras和sis基因为分子探针，经32P标记后与上述24例人大肠癌、癌旁与远端正常组织DNA杂交，结果发现：以C-erbβ扩增的阳性率最高(8/24例为33.3%)，扩增8～64倍。其中6例在扩增的同时还存在重排，在EcoR1酶解大肠癌DNA与erbB探针杂交时出现异常杂交信号。在正常肠上皮组织DNA中仅出现5.3kb、10kb杂交信号。在在大肠癌组织DNA中，可出现2.0kb、2.9kb、4.0kb、7.0kb或11.5kb的杂交带。c-myb扩增结果是24例中有7例出现扩增(占29.2%)，扩增程度为8～512倍，而用myc和sis这两种癌基因进行检测时未发现异常。由此推论不仅Ki-ras基因参予了人大肠癌的癌变过程，而且erbB、myb癌基因也起了重要作用。
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三、讨论
现已证实癌基因激活的机制，包括基因扩增，基因重排，点突变或启动子的插入。在这些变化之中，大肠癌出现Ki-ras基因的扩增、重排或点突变[6]。本研究的结果中5/24例中出现Ki-ras基因扩增，15/78例中出现Ki-ras第12密码子的第一个核苷酸G→T或G→A转换与当前国外的有关报道相一致[3，4]。本研究室曾对142例人大肠癌的P21表达做过免疫组化分析，发现85%～90%的大肠癌呈过量表达[7]，也支持Ki-ras在大肠癌癌变中起主要作用的看法。
综上所述，在人大肠癌的发生，发展过程中，Ki-ras的扩增、点突变起主要作用，同时erbB、myb基因同样涉及了这个演变过程。这种认识符合现代肿瘤形成的新理论、新观点。从应用前景来看，尤其是在大肠癌的基因诊断和预后判别的联系尚需进一步积累材料，方可提出应用之可能性。目前追踪工作尚在继续之中。
, 百拇医药
本课题受卫生部“七五”攻关项目资助
参考文献
1 Astrin SM,Costanzi C.The molecular genetics of coloncancer.Semin Oncol 1989,16:138.
2 Stanbridge EJ,Identifying tumour suppressor genes in human colorectal cancer.Science 1990,247:12.
3 Bos JL,Fearon ER,Hamilton SR,et al.Prevalence of ras gene mutations in human colorectal cancer,Nature 1987,327:293.
, 百拇医药 4 Suchy B,Zietz C,Rabes HM,K-ras point mutations in human colorectal carcinomas:relation to anerploidy and metastasis.Int,J.Cancer,1992,52:30.
5 Bos JL,ras oncogenes in human cancer:a review.Cancer Res,1989,49:4682.
6 Bishop JM,The molecrlar genetics of cancer.Science 1987,235:305.
7 Tian JS,Chen DG,An immunohistochemical analysis of ras oncogene expression in colon cancer Acta Anat Sinica (Supl)1991,P261.
(收稿：1992-02-02 修回：1993-05-24), http://www.100md.com