谷胱甘肽S-转移酶与肝癌癌变关系的研究
作者：李春海 诸亚群 谭子兴 曹禄森 李文广
单位：
关键词：肝肿瘤；谷胱甘肽转移酶类
中华医学杂志930805 摘要 为了探讨谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)与肝癌癌变的关系，建立了测定血清GSTs水平的BA-ELISA方法。北京地区肿瘤病人血清中GSTs水平以肝癌病人最高，为3.60±3.70μg/L,其阳性率为82%。同时测定了我国启东肝癌高发区不同人群血清中GSTs水平，其中肝癌家族GSTs阳性率为47%，HBsAg携带者为57%，甲胎蛋白(AFP)持续低阳性者为85%，肝癌病人为97%，提示GSTs与肝癌病变的进展有关。通过112例AFP和GSTs联合检测表明联合检测可使阳性检测出率提高到93%(单项AFP阳性率为72%)。
谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferuse,EC2、5、1、1-8GSTs)是一组具有多种生理功能的蛋白，根据其酶学，生化和免疫学特性，按其待电点(PI)可将其分为碱性(Alpha,α类)，中性(Mu,μ类)和酸性(Pi,π类，大鼠为P)，前两类主要分布于肝脏，后一种分布于胎盘中。Sato等[1]发现GST-P在大鼠化学致癌诱发的肝癌前病变中明显升高，因此，目前GST-Pi类同工酶已成为肿瘤酶学热点之一，但对于来自肝脏同工酶(GSTs)与肝瘤关系研究报道不多。本研究测定肝癌病人血清中GSTs水平，以期从分子水平研究GSTs在癌变发生过程中的作用及其临床诊断意义。
, 百拇医药
材料和方法
一、人肝GSTs同工酶的分离纯化，生化特性和抗体制备
按文献[2]方法，所用GSTs同工酶来自人肝，其中碱性同工酶约占75%，其抗体不与来自人胎盘的GST-π发生交叉反应。
二、生物素-亲和素酶联免疫吸附法(BA-ELISA)测定血清中GSTs水平[3，4]。最低检出值为0.05μg/L，灵敏度高。标准曲线测定范围为0.025～6μg/L。
三、样品来源
1.北京地区样品：正常人血清来自健康体检和献血员，肿瘤病人和其他疾病病人血清来自北京地区有关医院，并经临床和病理诊断来确诊。
2.启东肝癌高发区样品：(1)正常人血清来自启东人民医院献血员；(2)肝癌家族：指患有肝癌两例以上的家族(包括直系亲属；父母和同胞子女)；(3)HBsAg携带者：采用P-PHA法检测阳性者；(4)甲胎蛋(AFP)低持阳性病人：指用血凝法测定AFP范围在1：10～1：1000，或火箭电泳测定AFP含量为50～200mg/L，连续3次以上，持续时间超过两个月，但临床尚不能确诊为肝癌者(5)肝癌病人：均经临床B超，生化检测或病理明确诊断者。
, 百拇医药
结 果
一、正常人血清GSTs水平
用BA-ELISA法测定北京地区202名同年龄和性别正常人血清GSTs水平，平均值为0.37±0.27μg/L，男性为0.34±0.25μg/L，女性为0.39±0.20μg/L。正常人血清GSTs水平似乎随着年龄增加而升高，女性较男性明显，经统计学处理差异无显著性，但40岁以上各组GSTs水平均比10岁以下组高(表1)。
表1 北京地区正常人血清中GSTs水平 年龄组(岁)
男
女
平均值
10～
, 百拇医药 0.17±0.08(11)
0.28±0.67(4)
0.20±0.09(15)
11～
0.30±0.21(32)
0.24±0.24(31)
0.28±0.23(63)
31～
0.32±0.24(18)
0.36±0.26(21)
0.36±0.26(39)
, 百拇医药
41～
0.47±0.34(14)
0.47±0.26(26)
0.47±0.28(40)
51～
0.36±0.27(14)
0.53±0.30(9)
0.43±0.28(23)
61～
0.37±0.35(10)
0.73±0.20(5)
, 百拇医药
0.37±0.35(15)
71～
0.33±0.15(7)
合 计
0.34±0.25(106)
0.39±0.20(96)
0.37±0.27(202)
注：括号内为例数
二、肿瘤和其他疾病病人血清GSTs水平
1.北京地区肿瘤和其他疾病病人血清GSTs水平：肿瘤病人血清GSTs水平以肝癌病人为最高(3.6μg/L)。如以正常人平均值加1.96倍标准差(0.9μg/L)为阳性发生率最低检出值(cut off值)，则肝癌病人的阳性率为82%，除乳腺癌为48%外其他肿瘤和良性疾病阳性率均在20%左右(表2)。
, 百拇医药
表2 北京地区肿瘤和其他疾病患者血清GSTs水平(
+s，μg/L) 组别
例数
GSTs
阳性率(%)
正常对照
202
0.37±0.27
4
肝癌
137
3.60±3.70
, 百拇医药
82
乳腺癌
337
1.40±1.40
48
胃肠道肿瘤
87
0.84±0.86
22
肺癌
97
0.72±0.78
19
, 百拇医药
肺部良性疾病
53
0.62±0.54
18
肝炎
15
0.83±0.71
33
其他良性疾病
17
0.53±0.51
18
2.启东肝癌高发区不同人群血清GSTs水平：启东肝癌高发区，据1988和1989年发病率分别为45.9/10万和38.8/10万、通过测定表明启东地区正常人血甭GSTs水平和阳性率明显高于北京地区正常值；而两地肝癌病人GSTs水平相近，但启东地区肝癌病人GSTs水平相近，但启东地区肝癌病人阳性检出率比北京地区高，分别为97%和82%；肝癌家族、HBsAg携带者、AFP低持阳者和肝癌病人的GSTs水平和阳性率依次增高，其中以肝癌病人最高(表3)
, 百拇医药
表3 启东肝癌高发区不同人群GSTs水平(μg/L)、阳性率和ALT阳性率 组别
例数
GSTs
ALT(%)+s
%
正常人
33
0.66±0.54
19
0
肝癌家族
, http://www.100md.com
55
1.25±1.46
47
5
HBsAg携带者
70
1.43±1.44
57
5
AFP低持阳者
27
2.81±1.76
85
, 百拇医药
33
肝癌病人
57
3.08±2.35
97
49
对上述人群的肝功能变化，用赖氏法测定其ALT(SGPT)水平，>500nmol*s-1/L(>3U)为阳性，测定结果表明，各组的ALT阳性率均明显低于GSTs，提示GSTs反映各组肝肘损伤状况比ALT更为敏感。
三、AFP和GSTs检测肝癌病人阳性率的比较
为了与目前临床应用的肝癌肿瘤标志物AFP进行比较，在137例肝癌病人中的112例同时检查血清AFP水平，AFP阳性率为72%，而GSTs和AFP两者联合测测定可使阳性检出率提高到93%。对31例AFP阴性的肝癌病人测定GSTs水平，阳性率为74%，而在22例GSTs阴性者中有14例AFP阳性，阳性率为64%。说明GSTs阳性检出率高于AFP。
, http://www.100md.com
讨 论
本实验用Reddy改进方法[2]从人肝中纯化得到GSTs同工酶，以碱性同工酶(GST-α)为主。据文献[5]介绍，酸性和碱性同工酶两者的生理功能不同，前者是通过酶催化作用促使谷胱甘肽与有害极性异物相结合；后者由非酶结合方式将体内各种具有潜在毒性化学药物、染料、致癌物及亲脂性化合物从体内排出，从而达到解毒的目的。而迄今认为[6，7]肝癌致病因素主要与乙肝病毒(CHBV)、黄曲霉毒素(AFT)、饮水污染和某些微量元素(如硒)缺乏及遗传因素有关，而GSTs是机体重要解毒酶之一，所以启东地区正常人血清GSTs升高，可能与此酶防止化学致癌诱导细胞损伤有关，是机体自我保护作用的反映。
启东肝癌高发区肝癌家庭和HBsAg携带者，其肝癌发病率分别是普通自然人群的7.56和11.96倍，被称为肝癌危险人群，属于肝癌前病变。经流行病学调查表明，AFT是强烈的化学致癌物，并与HBV有协同致癌作用。大鼠化学放发肝癌实验也表明，当细胞恶性转化时常伴有GST-P同工酶的表达，由此推测肝癌前病变中GST-P升高，可能与化学致癌后肝、脏细胞恶性转化有关。
, 百拇医药
而肝癌病人与AFP低持阳者是处于肝癌进展阶段，癌细胞对其周围肝细胞浸润和破坏，使肝细胞受损或坏死，GSTs释放到血液中，从而GSTs水平升高。由此可见GSTs的变化与肝癌癌变有关。正常人受到化学致癌物或致癌因子作用后，GSTs表达增高以免细胞受损；癌前变时细胞开始恶性转化，GSTs也随之表达增高；在癌变时细胞大量受损，使GSTs释放到血浓度增加。所以GSTs不仅与癌前变有关，并与癌变后肝细胞损伤程度有关。因此GSTs同工酶不仅可作为癌前标志酶，而且对判断肝癌损伤也有重要意义。与AFP相比，灵敏度较高，但由于它是一种具有解毒功能的酶，凡是由化学物质引起的肝脏损伤和癌变均可表达增高，所以特异性不及AFP，但两者联合应用可提高肝癌阳性检出率。由于GSTs在血液中含量较低，要求测定方法灵敏度高，我们建立BA-ELISA法灵敏度与放射免疫法相近，最低检出值为0.05μg/L，但操作简单，快速，无需昂贵的仪器设备，可处理大量样品，便于临床推广应用。
参考文献
, 百拇医药 1 Sato K,Kitahara A,Satoh K,et al.The placental form of glutathione S-transferases as a new marker protein for prenoplasia in rat chemical hepatcacinogenesis.Gann,1984,75:199.
2 李春海，谭子兴，人肝谷甘肽S-转移酶的纯化和生和经特性，生物学杂志，1989，5：78。
3 Li C H,Chu YJ,Tan ZX,et al,On microanalysis of Glutathione S-Transferases serum with BAC-ELISA and its clinical application.Tumor Marker Oncol,1989,4:223.
4 李春海，谭子兴，诸亚群，等，BA-ELISA检测谷胱甘肽S-转移酶对肝癌诊断的意义，上海免疫学杂志，1989，9：294
, http://www.100md.com
5 Bayer TD.The Glutathione S-Transferases:an update.Hepatology,1989,9:489
6 Harries C C,Chemical and physical carcinogenesis:advance and perspectives for the 1990s.Cancer Res,1991,51[Suppl]:5023
7 朱源荣，陆培新，肝癌高发现场的研究方向：预防战略。中华肿瘤杂志，1991，13：77。
(收稿：1993-01-13 修回：1993-06-03), 百拇医药
单位：
关键词：肝肿瘤；谷胱甘肽转移酶类
中华医学杂志930805 摘要 为了探讨谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)与肝癌癌变的关系，建立了测定血清GSTs水平的BA-ELISA方法。北京地区肿瘤病人血清中GSTs水平以肝癌病人最高，为3.60±3.70μg/L,其阳性率为82%。同时测定了我国启东肝癌高发区不同人群血清中GSTs水平，其中肝癌家族GSTs阳性率为47%，HBsAg携带者为57%，甲胎蛋白(AFP)持续低阳性者为85%，肝癌病人为97%，提示GSTs与肝癌病变的进展有关。通过112例AFP和GSTs联合检测表明联合检测可使阳性检测出率提高到93%(单项AFP阳性率为72%)。
谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferuse,EC2、5、1、1-8GSTs)是一组具有多种生理功能的蛋白，根据其酶学，生化和免疫学特性，按其待电点(PI)可将其分为碱性(Alpha,α类)，中性(Mu,μ类)和酸性(Pi,π类，大鼠为P)，前两类主要分布于肝脏，后一种分布于胎盘中。Sato等[1]发现GST-P在大鼠化学致癌诱发的肝癌前病变中明显升高，因此，目前GST-Pi类同工酶已成为肿瘤酶学热点之一，但对于来自肝脏同工酶(GSTs)与肝瘤关系研究报道不多。本研究测定肝癌病人血清中GSTs水平，以期从分子水平研究GSTs在癌变发生过程中的作用及其临床诊断意义。
, 百拇医药
材料和方法
一、人肝GSTs同工酶的分离纯化，生化特性和抗体制备
按文献[2]方法，所用GSTs同工酶来自人肝，其中碱性同工酶约占75%，其抗体不与来自人胎盘的GST-π发生交叉反应。
二、生物素-亲和素酶联免疫吸附法(BA-ELISA)测定血清中GSTs水平[3，4]。最低检出值为0.05μg/L，灵敏度高。标准曲线测定范围为0.025～6μg/L。
三、样品来源
1.北京地区样品：正常人血清来自健康体检和献血员，肿瘤病人和其他疾病病人血清来自北京地区有关医院，并经临床和病理诊断来确诊。
2.启东肝癌高发区样品：(1)正常人血清来自启东人民医院献血员；(2)肝癌家族：指患有肝癌两例以上的家族(包括直系亲属；父母和同胞子女)；(3)HBsAg携带者：采用P-PHA法检测阳性者；(4)甲胎蛋(AFP)低持阳性病人：指用血凝法测定AFP范围在1：10～1：1000，或火箭电泳测定AFP含量为50～200mg/L，连续3次以上，持续时间超过两个月，但临床尚不能确诊为肝癌者(5)肝癌病人：均经临床B超，生化检测或病理明确诊断者。
, 百拇医药
结 果
一、正常人血清GSTs水平
用BA-ELISA法测定北京地区202名同年龄和性别正常人血清GSTs水平，平均值为0.37±0.27μg/L，男性为0.34±0.25μg/L，女性为0.39±0.20μg/L。正常人血清GSTs水平似乎随着年龄增加而升高，女性较男性明显，经统计学处理差异无显著性，但40岁以上各组GSTs水平均比10岁以下组高(表1)。
表1 北京地区正常人血清中GSTs水平 年龄组(岁)
男
女
平均值
10～
, 百拇医药 0.17±0.08(11)
0.28±0.67(4)
0.20±0.09(15)
11～
0.30±0.21(32)
0.24±0.24(31)
0.28±0.23(63)
31～
0.32±0.24(18)
0.36±0.26(21)
0.36±0.26(39)
, 百拇医药
41～
0.47±0.34(14)
0.47±0.26(26)
0.47±0.28(40)
51～
0.36±0.27(14)
0.53±0.30(9)
0.43±0.28(23)
61～
0.37±0.35(10)
0.73±0.20(5)
, 百拇医药
0.37±0.35(15)
71～
0.33±0.15(7)
合 计
0.34±0.25(106)
0.39±0.20(96)
0.37±0.27(202)
注：括号内为例数
二、肿瘤和其他疾病病人血清GSTs水平
1.北京地区肿瘤和其他疾病病人血清GSTs水平：肿瘤病人血清GSTs水平以肝癌病人为最高(3.6μg/L)。如以正常人平均值加1.96倍标准差(0.9μg/L)为阳性发生率最低检出值(cut off值)，则肝癌病人的阳性率为82%，除乳腺癌为48%外其他肿瘤和良性疾病阳性率均在20%左右(表2)。
, 百拇医药
表2 北京地区肿瘤和其他疾病患者血清GSTs水平(
+s，μg/L) 组别例数
GSTs
阳性率(%)
正常对照
202
0.37±0.27
4
肝癌
137
3.60±3.70
, 百拇医药
82
乳腺癌
337
1.40±1.40
48
胃肠道肿瘤
87
0.84±0.86
22
肺癌
97
0.72±0.78
19
, 百拇医药
肺部良性疾病
53
0.62±0.54
18
肝炎
15
0.83±0.71
33
其他良性疾病
17
0.53±0.51
18
2.启东肝癌高发区不同人群血清GSTs水平：启东肝癌高发区，据1988和1989年发病率分别为45.9/10万和38.8/10万、通过测定表明启东地区正常人血甭GSTs水平和阳性率明显高于北京地区正常值；而两地肝癌病人GSTs水平相近，但启东地区肝癌病人GSTs水平相近，但启东地区肝癌病人阳性检出率比北京地区高，分别为97%和82%；肝癌家族、HBsAg携带者、AFP低持阳者和肝癌病人的GSTs水平和阳性率依次增高，其中以肝癌病人最高(表3)
, 百拇医药
表3 启东肝癌高发区不同人群GSTs水平(μg/L)、阳性率和ALT阳性率 组别
例数
GSTs
ALT(%)
+s%
正常人
33
0.66±0.54
19
0
肝癌家族
, http://www.100md.com
55
1.25±1.46
47
5
HBsAg携带者
70
1.43±1.44
57
5
AFP低持阳者
27
2.81±1.76
85
, 百拇医药
33
肝癌病人
57
3.08±2.35
97
49
对上述人群的肝功能变化，用赖氏法测定其ALT(SGPT)水平，>500nmol*s-1/L(>3U)为阳性，测定结果表明，各组的ALT阳性率均明显低于GSTs，提示GSTs反映各组肝肘损伤状况比ALT更为敏感。
三、AFP和GSTs检测肝癌病人阳性率的比较
为了与目前临床应用的肝癌肿瘤标志物AFP进行比较，在137例肝癌病人中的112例同时检查血清AFP水平，AFP阳性率为72%，而GSTs和AFP两者联合测测定可使阳性检出率提高到93%。对31例AFP阴性的肝癌病人测定GSTs水平，阳性率为74%，而在22例GSTs阴性者中有14例AFP阳性，阳性率为64%。说明GSTs阳性检出率高于AFP。
, http://www.100md.com
讨 论
本实验用Reddy改进方法[2]从人肝中纯化得到GSTs同工酶，以碱性同工酶(GST-α)为主。据文献[5]介绍，酸性和碱性同工酶两者的生理功能不同，前者是通过酶催化作用促使谷胱甘肽与有害极性异物相结合；后者由非酶结合方式将体内各种具有潜在毒性化学药物、染料、致癌物及亲脂性化合物从体内排出，从而达到解毒的目的。而迄今认为[6，7]肝癌致病因素主要与乙肝病毒(CHBV)、黄曲霉毒素(AFT)、饮水污染和某些微量元素(如硒)缺乏及遗传因素有关，而GSTs是机体重要解毒酶之一，所以启东地区正常人血清GSTs升高，可能与此酶防止化学致癌诱导细胞损伤有关，是机体自我保护作用的反映。
启东肝癌高发区肝癌家庭和HBsAg携带者，其肝癌发病率分别是普通自然人群的7.56和11.96倍，被称为肝癌危险人群，属于肝癌前病变。经流行病学调查表明，AFT是强烈的化学致癌物，并与HBV有协同致癌作用。大鼠化学放发肝癌实验也表明，当细胞恶性转化时常伴有GST-P同工酶的表达，由此推测肝癌前病变中GST-P升高，可能与化学致癌后肝、脏细胞恶性转化有关。
, 百拇医药
而肝癌病人与AFP低持阳者是处于肝癌进展阶段，癌细胞对其周围肝细胞浸润和破坏，使肝细胞受损或坏死，GSTs释放到血液中，从而GSTs水平升高。由此可见GSTs的变化与肝癌癌变有关。正常人受到化学致癌物或致癌因子作用后，GSTs表达增高以免细胞受损；癌前变时细胞开始恶性转化，GSTs也随之表达增高；在癌变时细胞大量受损，使GSTs释放到血浓度增加。所以GSTs不仅与癌前变有关，并与癌变后肝细胞损伤程度有关。因此GSTs同工酶不仅可作为癌前标志酶，而且对判断肝癌损伤也有重要意义。与AFP相比，灵敏度较高，但由于它是一种具有解毒功能的酶，凡是由化学物质引起的肝脏损伤和癌变均可表达增高，所以特异性不及AFP，但两者联合应用可提高肝癌阳性检出率。由于GSTs在血液中含量较低，要求测定方法灵敏度高，我们建立BA-ELISA法灵敏度与放射免疫法相近，最低检出值为0.05μg/L，但操作简单，快速，无需昂贵的仪器设备，可处理大量样品，便于临床推广应用。
参考文献
, 百拇医药 1 Sato K,Kitahara A,Satoh K,et al.The placental form of glutathione S-transferases as a new marker protein for prenoplasia in rat chemical hepatcacinogenesis.Gann,1984,75:199.
2 李春海，谭子兴，人肝谷甘肽S-转移酶的纯化和生和经特性，生物学杂志，1989，5：78。
3 Li C H,Chu YJ,Tan ZX,et al,On microanalysis of Glutathione S-Transferases serum with BAC-ELISA and its clinical application.Tumor Marker Oncol,1989,4:223.
4 李春海，谭子兴，诸亚群，等，BA-ELISA检测谷胱甘肽S-转移酶对肝癌诊断的意义，上海免疫学杂志，1989，9：294
, http://www.100md.com
5 Bayer TD.The Glutathione S-Transferases:an update.Hepatology,1989,9:489
6 Harries C C,Chemical and physical carcinogenesis:advance and perspectives for the 1990s.Cancer Res,1991,51[Suppl]:5023
7 朱源荣，陆培新，肝癌高发现场的研究方向：预防战略。中华肿瘤杂志，1991，13：77。
(收稿：1993-01-13 修回：1993-06-03), 百拇医药