雷公藤对猪小肠移植的抗排异作用
作者：周志韶 廖彩仙 黎介寿
单位：210002 南京金陵医院病理科(周志韶)，腹部外科(廖彩仙、黎介寿)
关键词：移植物生存；移植，同种；肠，小动物，实验
中华医学杂志930909 摘要 采用两步法以猪互为小肠节段性移植的供、受体。移植后逐日取移植肠活检或尸检。I组为自体移植，Ⅱ组为同种同窝异体移植，Ⅲ，Ⅳ、Ⅴ组均为同种异窝异体移植，但Ⅲ组给环孢素A(CsA)每日 15mg/kg，Ⅳ组给半量 CsA 加雷公藤每日 2mg/kg，V组单给半量CsA。观察肠粘膜绒毛、上皮、腺体和间质血管及细胞浸润程度等排异现象及出现的时间，并以彩色图像分析仪对细胞浸润作定量分析。结果：排异反应以V组最重、Ⅱ、Ⅲ组次之，Ⅳ组最轻，ⅴ、Ⅱ组与Ⅳ、Ⅲ组比较差异有显著意义。结果表明，雷公藤与 CsA 合用有协同或相加抗异作用，能降低 CsA 的用量并有良好的抗急性排异作用，雷公藤单独使用有抗慢性排异的效果。排异反应在早期主要为粘膜固有层中等量单个核细胞浸润；中度排异时，浸润细胞波及肠壁全层，且普遍有明显的绒毛、上皮和腺体改变；重度时则为粘膜或肠壁坏死。活检仍为诊断排异基本可靠的方法。
, 百拇医药
排异是器官移植的共同难题，在小肠移植尤为突出，因小肠富含淋巴组织，不但会产生排异反应，还可能发生移植物抗宿主病(GVHD)。本实验通过观察不给或给予不同的抗排异药物的分组猪移植小肠的病理学改变，探讨小肠移植排异的进程、排异反应特点和病理学诊断标准等，并验证雷公藤的抗排异作用。
材料及方法
实验动物为杂交长白猪，20±1.5kg。除I组为自体移植外，其他4组均以两猪互为供、受体，采用两步法：第一步将 5m 的供肠系膜血管主干邻近的淋巴结尽量清除，然后将供、受体相应切断的血管吻合，供体肠两端外置肠造口，受体肠两端行端端吻合。待受体及其接受的供体肠健康存活30～35天后，行第二步手术，将移植肠置于受体肠的连续之中，完成原位移植。
实验共分5组：Ⅰ组为自体移植(5)只；Ⅱ组为同种同窝异体移植(5只)；Ⅲ～Ⅴ组增为同种异窝异移植，Ⅲ组(4只)给环孢素A(CsA)每日 15mg/kg，Ⅳ组(5只)给 CsA 每日7.5mg/kg和雷公藤每日2mg/kg，Ⅴ组(5只)每日给 CsA7.5mg/kg。此外，Ⅲ、Ⅴ组尚给予甲基泼尼松龙、硫唑嘌呤，Ⅳ组给予甲基泼尼松龙。各组凡存活100天后只给雷公藤，停用其他抗排异药物。
, 百拇医药
第一步手术后逐日以内窥镜经造口部取移植肠全层粘膜活检(达粘膜肌层下)；如移植肠段肉眼明显失活或动物有严重感染等，则处死尸或死亡尸检，行全肠段全层肠壁病理学检查，受体肠及其系膜淋巴结和心、肺、肝、脾、肾、胰腺、胸腺及漏摘的供体肠系膜淋巴结亦作病理学检查。标本甲醛固定，常规石蜡切片，HE染色，部分作了PAS、网状纤维和抗酸染色。反映排异的单个核细胞浸润量，以XY-540型医学彩色图像分析仪(海军神经生物研究中心提供)作细胞定量分析：在5 000μm2的测量窗口内，测反应细胞数，计算其平均数(
)、标准差(s)和标准误(s-x)。各项观察结果，作组间和供、受体间对比分析。
结 果
各组肠粘膜病理改变：Ⅰ组除粘膜水肿、少量单个核细胞和嗜酸性细胞浸润及明显脱颗粒现象外，余无改变。脱颗粒现象和水肿在第一步术后1周内消失。细胞浸润持续至26天无变化而行第二步手术，生存100天处死。
, 百拇医药
Ⅱ组中2只仅有少～中量细胞浸润(图1)，其中1只于第一步术后第10天突然原因不明死亡，1只于第27天无变化，一次活检见粘膜局限性溃疡。另3只反应较重，粘膜固有层中量细胞浸润，绒毛短粗、消失，上皮脱落，腺体减少，间质大量细胞浸润(图2)，直至出现粘膜或肠壁坏死，且出现时间早，始于第4和第8天。
图1 第Ⅱ组术后27天,肠粘膜绒毛短粗,杯状细胞减少,固有层中等量细胞浸润,属轻度排异改变 HE×148.5
图2 第Ⅱ组术后12天,粘膜绒毛消失,腺体明显减少,固有层、粘膜肌层及粘膜下层多量细胞浸润，属中度排异改变 HE×74.5
Ⅲ组(图3)及Ⅳ组(图4)与Ⅰ组病变相似，生存天数分别为92～419及135～356天，死亡者均非因排异反应，4只一直存活。
, 百拇医药
图3 第Ⅲ组术后33天,粘膜绒毛略短，固有层少量淋巴细胞浸润 HE×148.5
图4 第Ⅳ组术后27天,粘膜绒毛、上皮、杯状细胞基本无改变，固有层少量细胞浸润 HE×74.5
Ⅴ组与Ⅱ组相似(图5)，仅排异出现时间较Ⅱ组早，最早出现于第一步术后第1天和第4天，存活时间为10～16天。
图5 第Ⅴ组术后11天,肠壁全层坏死，仅残存腺体轮廓和细胞碎片HE×148.5
Ⅰ、Ⅱ组受体肠系膜淋巴结副皮质区及滤泡均增生，但Ⅱ组病变重者滤泡则减少，Ⅰ组淋巴结窦内见较多的嗜酸性细胞，且有脱颗粒现象，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组亦见少数嗜酸性细胞和中性粒细胞，无脱颗粒现象。
各组受体肠、心、肺、肝、肾、胰、胸腺均未见明显病变，也未发现GVHD。
, 百拇医药
各组移植肠粘膜固有层排异反应的细胞图像定量分析，结果为：Ⅰ组=10.4，s=4.3932；Ⅱ组轻度排异=25.4，s=3.6469，重度排异=38.6，s=11.3930；Ⅲ组=10.4，s=2.6750；Ⅳ组=12.4，s=3.5340；Ⅴ组=55.52，s=40.6990；受体小肠=11.0，s=2.3570。经t检验结果：Ⅰ组与Ⅲ组(t=0.000,P>0.05)、Ⅰ组与Ⅳ组(t=0.9570，P>0.05)差异均无显著意义，Ⅱ组与Ⅴ组的轻、中、重度排异反应(t轻=2.1160、t中=1.6240、t重=0.8960，均P>0.05)，差异亦无显著意义。而Ⅱ组与Ⅲ组(t=3.5550～9.3210，P<0.01)、Ⅱ组与Ⅳ组(t=6.6530～6.8650，P<0.01)的差异均有非常显著意义。
, 百拇医药
讨 论
因小肠富含淋巴组织，所以克服排异反应成为小肠移植成败的关键。虽然当今已有数种较好的抗排异制剂，但价格昂贵，副反应大，又常因使用不当而使移植因副反应而失败。本实验5个组的猪移植肠粘膜的病理改变轻重次序依次为：Ⅰ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅴ组。除Ⅰ组为自体移植外，异体移植的4个组中，使用大剂量 CsA 的 Ⅲ 组与使用小剂量 CsA 加雷公藤的 Ⅳ 组排异改变相似，但Ⅳ组更轻。说明雷公藤有拮抗排异的作用，与CsA合用有协同或加效果，并能单独作为抗慢性排异药物，至于能否作为人类小肠移植之用，尚待进一步研究。另外，未用药的同窝Ⅱ组与使用小剂量 CsA 的异窝Ⅴ组，其排异反应相似，说明选择近亲移植组织有助于移植成功。此外，本实验未见 GVHD 发生，这可能与节段性肠移植切除供体肠系膜血管周围淋巴结有关，也可能是选用动物为猪的原因。
早期排异的诊断是小肠移植能否成功的关键。目前应用的包括活检、血清学和免疫学检查等，都对诊断排异有一定价值，但各有不足之处〔1～6〕。通过观察，我们认为活检仍是诊断排异的基本的可靠的途径，与 Todo 等〔1〕意见相一致。本组有1例从移植肠肉眼观察及动物症状看，极似重度排异，但移植肠活检不支持排异的诊断，故决定继续观察，结果动物及移植肠均存活。另外，活检须达到一定深度，并结合临床表现、移植肠肉眼所见和其他辅助检查等综合分析，才可能确立、甚至早期确立是否排异反应。
, 百拇医药
小肠排异的基本病变，本组主要观察下列三方面：(1)肠壁单个核细胞浸润量；(2)粘膜绒毛、上皮和腺体的变化；(3)间质改变，包括血管改变和纤维化等。经观察，急性排异早期主要病变是粘膜固有层中等量单个核细胞和嗜酸性细胞浸润，偶有局部绒毛变短粗；中度排异，有中到多量的细胞浸润，并波及粘膜下层或肌层，粘膜绒毛短粗，上皮内杯状细胞减少及上皮变性脱失，腺体减少，间质血管可见纤维素样坏死；重度排异，粘膜呈坏死状，仅残留腺体轮廓，大量中性粒细胞及单个核细胞浸润，血管亦见坏死。慢性排异则主要表现为肠壁的纤维化和血管闭塞等。应该指出，排异从发生到发展成重度为一连续过程，轻、中、重之间无截然分界，从病理学上看，中、重度排异反应的诊断并不困难，但早期排异的确立则较困难，因为中等量的细胞浸润和极少的粘膜绒毛、上皮损害，在炎症时也会出现；同样，慢性排异的纤维化和血管闭塞等改变，也可因其他原因，如梗阻、血供不足等引起。另外，实验动物因手术损伤，免疫抑制剂的应用等，常会出现一定量的细胞浸润或局部浅溃疡或小脓肿等，这在自体移植组也可见到，不能视为排异病变。为此，观察应着眼整个肠段的改变和连续活检的结果，不能视局部病变为整体病变，并应紧密结合临床和实验室检查，综合判断。
, 百拇医药
参考文献
1 Todo S,Tzakis AG,Abu-Elmagd K,et al.Intestinal trasplantation in composite visceral grafts or alone. Ann Surg,1992,216∶223.
2 Fujuwara H,Raju S,Grogan JB,et al.Total orthotopic small bowel allotransplantation in the dog. Transplantation,1987,44∶747.
3 Millaard PR,Dennison A,Hughes DA,et al. Morphology of intestinal allograft rejection and the inadequacy of mucosal biopsy in its recognition. Br J Exp Pathol,1986,67∶687.
, 百拇医药
4 Alexander S,Rosemurgy MD,Wolfgang H,et al.Small bowel allografts sequence of histologi changes in acute and chronic rejection.Am J Surg,1986,151∶470.
5 廖彩仙，黎介寿(综述).小肠移植后排异的诊断进展.国外医学.外科分册，1992，19∶143.
6 廖彩仙，黎介寿.小肠移植后的功能研究.国外医学.外科分册，1992，19∶74.
(收稿：1993-02-23 修回：1993-05.30), http://www.100md.com
单位：210002 南京金陵医院病理科(周志韶)，腹部外科(廖彩仙、黎介寿)
关键词：移植物生存；移植，同种；肠，小动物，实验
中华医学杂志930909 摘要 采用两步法以猪互为小肠节段性移植的供、受体。移植后逐日取移植肠活检或尸检。I组为自体移植，Ⅱ组为同种同窝异体移植，Ⅲ，Ⅳ、Ⅴ组均为同种异窝异体移植，但Ⅲ组给环孢素A(CsA)每日 15mg/kg，Ⅳ组给半量 CsA 加雷公藤每日 2mg/kg，V组单给半量CsA。观察肠粘膜绒毛、上皮、腺体和间质血管及细胞浸润程度等排异现象及出现的时间，并以彩色图像分析仪对细胞浸润作定量分析。结果：排异反应以V组最重、Ⅱ、Ⅲ组次之，Ⅳ组最轻，ⅴ、Ⅱ组与Ⅳ、Ⅲ组比较差异有显著意义。结果表明，雷公藤与 CsA 合用有协同或相加抗异作用，能降低 CsA 的用量并有良好的抗急性排异作用，雷公藤单独使用有抗慢性排异的效果。排异反应在早期主要为粘膜固有层中等量单个核细胞浸润；中度排异时，浸润细胞波及肠壁全层，且普遍有明显的绒毛、上皮和腺体改变；重度时则为粘膜或肠壁坏死。活检仍为诊断排异基本可靠的方法。
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排异是器官移植的共同难题，在小肠移植尤为突出，因小肠富含淋巴组织，不但会产生排异反应，还可能发生移植物抗宿主病(GVHD)。本实验通过观察不给或给予不同的抗排异药物的分组猪移植小肠的病理学改变，探讨小肠移植排异的进程、排异反应特点和病理学诊断标准等，并验证雷公藤的抗排异作用。
材料及方法
实验动物为杂交长白猪，20±1.5kg。除I组为自体移植外，其他4组均以两猪互为供、受体，采用两步法：第一步将 5m 的供肠系膜血管主干邻近的淋巴结尽量清除，然后将供、受体相应切断的血管吻合，供体肠两端外置肠造口，受体肠两端行端端吻合。待受体及其接受的供体肠健康存活30～35天后，行第二步手术，将移植肠置于受体肠的连续之中，完成原位移植。
实验共分5组：Ⅰ组为自体移植(5)只；Ⅱ组为同种同窝异体移植(5只)；Ⅲ～Ⅴ组增为同种异窝异移植，Ⅲ组(4只)给环孢素A(CsA)每日 15mg/kg，Ⅳ组(5只)给 CsA 每日7.5mg/kg和雷公藤每日2mg/kg，Ⅴ组(5只)每日给 CsA7.5mg/kg。此外，Ⅲ、Ⅴ组尚给予甲基泼尼松龙、硫唑嘌呤，Ⅳ组给予甲基泼尼松龙。各组凡存活100天后只给雷公藤，停用其他抗排异药物。
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第一步手术后逐日以内窥镜经造口部取移植肠全层粘膜活检(达粘膜肌层下)；如移植肠段肉眼明显失活或动物有严重感染等，则处死尸或死亡尸检，行全肠段全层肠壁病理学检查，受体肠及其系膜淋巴结和心、肺、肝、脾、肾、胰腺、胸腺及漏摘的供体肠系膜淋巴结亦作病理学检查。标本甲醛固定，常规石蜡切片，HE染色，部分作了PAS、网状纤维和抗酸染色。反映排异的单个核细胞浸润量，以XY-540型医学彩色图像分析仪(海军神经生物研究中心提供)作细胞定量分析：在5 000μm2的测量窗口内，测反应细胞数，计算其平均数(
)、标准差(s)和标准误(s-x)。各项观察结果，作组间和供、受体间对比分析。结 果
各组肠粘膜病理改变：Ⅰ组除粘膜水肿、少量单个核细胞和嗜酸性细胞浸润及明显脱颗粒现象外，余无改变。脱颗粒现象和水肿在第一步术后1周内消失。细胞浸润持续至26天无变化而行第二步手术，生存100天处死。
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Ⅱ组中2只仅有少～中量细胞浸润(图1)，其中1只于第一步术后第10天突然原因不明死亡，1只于第27天无变化，一次活检见粘膜局限性溃疡。另3只反应较重，粘膜固有层中量细胞浸润，绒毛短粗、消失，上皮脱落，腺体减少，间质大量细胞浸润(图2)，直至出现粘膜或肠壁坏死，且出现时间早，始于第4和第8天。
图1 第Ⅱ组术后27天,肠粘膜绒毛短粗,杯状细胞减少,固有层中等量细胞浸润,属轻度排异改变 HE×148.5
图2 第Ⅱ组术后12天,粘膜绒毛消失,腺体明显减少,固有层、粘膜肌层及粘膜下层多量细胞浸润，属中度排异改变 HE×74.5
Ⅲ组(图3)及Ⅳ组(图4)与Ⅰ组病变相似，生存天数分别为92～419及135～356天，死亡者均非因排异反应，4只一直存活。
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图3 第Ⅲ组术后33天,粘膜绒毛略短，固有层少量淋巴细胞浸润 HE×148.5
图4 第Ⅳ组术后27天,粘膜绒毛、上皮、杯状细胞基本无改变，固有层少量细胞浸润 HE×74.5
Ⅴ组与Ⅱ组相似(图5)，仅排异出现时间较Ⅱ组早，最早出现于第一步术后第1天和第4天，存活时间为10～16天。
图5 第Ⅴ组术后11天,肠壁全层坏死，仅残存腺体轮廓和细胞碎片HE×148.5
Ⅰ、Ⅱ组受体肠系膜淋巴结副皮质区及滤泡均增生，但Ⅱ组病变重者滤泡则减少，Ⅰ组淋巴结窦内见较多的嗜酸性细胞，且有脱颗粒现象，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组亦见少数嗜酸性细胞和中性粒细胞，无脱颗粒现象。
各组受体肠、心、肺、肝、肾、胰、胸腺均未见明显病变，也未发现GVHD。
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各组移植肠粘膜固有层排异反应的细胞图像定量分析，结果为：Ⅰ组
=10.4，s=4.3932；Ⅱ组轻度排异=25.4，s=3.6469，重度排异=38.6，s=11.3930；Ⅲ组=10.4，s=2.6750；Ⅳ组=12.4，s=3.5340；Ⅴ组=55.52，s=40.6990；受体小肠=11.0，s=2.3570。经t检验结果：Ⅰ组与Ⅲ组(t=0.000,P>0.05)、Ⅰ组与Ⅳ组(t=0.9570，P>0.05)差异均无显著意义，Ⅱ组与Ⅴ组的轻、中、重度排异反应(t轻=2.1160、t中=1.6240、t重=0.8960，均P>0.05)，差异亦无显著意义。而Ⅱ组与Ⅲ组(t=3.5550～9.3210，P<0.01)、Ⅱ组与Ⅳ组(t=6.6530～6.8650，P<0.01)的差异均有非常显著意义。, 百拇医药
讨 论
因小肠富含淋巴组织，所以克服排异反应成为小肠移植成败的关键。虽然当今已有数种较好的抗排异制剂，但价格昂贵，副反应大，又常因使用不当而使移植因副反应而失败。本实验5个组的猪移植肠粘膜的病理改变轻重次序依次为：Ⅰ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅴ组。除Ⅰ组为自体移植外，异体移植的4个组中，使用大剂量 CsA 的 Ⅲ 组与使用小剂量 CsA 加雷公藤的 Ⅳ 组排异改变相似，但Ⅳ组更轻。说明雷公藤有拮抗排异的作用，与CsA合用有协同或加效果，并能单独作为抗慢性排异药物，至于能否作为人类小肠移植之用，尚待进一步研究。另外，未用药的同窝Ⅱ组与使用小剂量 CsA 的异窝Ⅴ组，其排异反应相似，说明选择近亲移植组织有助于移植成功。此外，本实验未见 GVHD 发生，这可能与节段性肠移植切除供体肠系膜血管周围淋巴结有关，也可能是选用动物为猪的原因。
早期排异的诊断是小肠移植能否成功的关键。目前应用的包括活检、血清学和免疫学检查等，都对诊断排异有一定价值，但各有不足之处〔1～6〕。通过观察，我们认为活检仍是诊断排异的基本的可靠的途径，与 Todo 等〔1〕意见相一致。本组有1例从移植肠肉眼观察及动物症状看，极似重度排异，但移植肠活检不支持排异的诊断，故决定继续观察，结果动物及移植肠均存活。另外，活检须达到一定深度，并结合临床表现、移植肠肉眼所见和其他辅助检查等综合分析，才可能确立、甚至早期确立是否排异反应。
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小肠排异的基本病变，本组主要观察下列三方面：(1)肠壁单个核细胞浸润量；(2)粘膜绒毛、上皮和腺体的变化；(3)间质改变，包括血管改变和纤维化等。经观察，急性排异早期主要病变是粘膜固有层中等量单个核细胞和嗜酸性细胞浸润，偶有局部绒毛变短粗；中度排异，有中到多量的细胞浸润，并波及粘膜下层或肌层，粘膜绒毛短粗，上皮内杯状细胞减少及上皮变性脱失，腺体减少，间质血管可见纤维素样坏死；重度排异，粘膜呈坏死状，仅残留腺体轮廓，大量中性粒细胞及单个核细胞浸润，血管亦见坏死。慢性排异则主要表现为肠壁的纤维化和血管闭塞等。应该指出，排异从发生到发展成重度为一连续过程，轻、中、重之间无截然分界，从病理学上看，中、重度排异反应的诊断并不困难，但早期排异的确立则较困难，因为中等量的细胞浸润和极少的粘膜绒毛、上皮损害，在炎症时也会出现；同样，慢性排异的纤维化和血管闭塞等改变，也可因其他原因，如梗阻、血供不足等引起。另外，实验动物因手术损伤，免疫抑制剂的应用等，常会出现一定量的细胞浸润或局部浅溃疡或小脓肿等，这在自体移植组也可见到，不能视为排异病变。为此，观察应着眼整个肠段的改变和连续活检的结果，不能视局部病变为整体病变，并应紧密结合临床和实验室检查，综合判断。
, 百拇医药
参考文献
1 Todo S,Tzakis AG,Abu-Elmagd K,et al.Intestinal trasplantation in composite visceral grafts or alone. Ann Surg,1992,216∶223.
2 Fujuwara H,Raju S,Grogan JB,et al.Total orthotopic small bowel allotransplantation in the dog. Transplantation,1987,44∶747.
3 Millaard PR,Dennison A,Hughes DA,et al. Morphology of intestinal allograft rejection and the inadequacy of mucosal biopsy in its recognition. Br J Exp Pathol,1986,67∶687.
, 百拇医药
4 Alexander S,Rosemurgy MD,Wolfgang H,et al.Small bowel allografts sequence of histologi changes in acute and chronic rejection.Am J Surg,1986,151∶470.
5 廖彩仙，黎介寿(综述).小肠移植后排异的诊断进展.国外医学.外科分册，1992，19∶143.
6 廖彩仙，黎介寿.小肠移植后的功能研究.国外医学.外科分册，1992，19∶74.
(收稿：1993-02-23 修回：1993-05.30), http://www.100md.com