病毒感染对培养心肌细胞钙离子内流的影响
作者：郭 棋 杨英珍 顾全保 赵剑星 朱 琳 陈灏珠
单位：200032 上海医科大学中山医院心血管病研究所(郭 棋、杨英珍、陈灏珠)；中国科学院上海细胞生物学研究所(顾全保、赵剑星、朱 琳)
关键词：
中华医学杂志930921 我们应用放射性同位素45Ca2+示踪技术，观察了培养大鼠心肌细胞感染 Coxsackie B病毒(CBV)后，其 Ca2+内流的变化，现报道如下。
一、材料与方法
1.培养心肌细胞制备：出生1～3天的 SD 大鼠，取心室肌用0.1%胰蛋白酶液分次消化，方法按文献[J Virol Methods 1985;12∶217]。生长液用含 20% 小牛血清的培养 MEM 液。
, 百拇医药
2.病毒及感染用量：CB3(Nancy 株)按 Reed 法测其 50% 组织感染率(TCID50)。在培养 18h 已呈规律搏动的心肌细胞上，每孔加入 0.5ml 含 100TCID50 的 CB3V 生长液，对照组加 0.5ml 生长液，置 37℃ 孵育 1h ，弃上清后再加生长液 1ml/孔培养观察。
3.Ca2+内流测定：同位素示踪法。各组细胞弃上清，用无 Ca-Ringer 液洗涤 3 次，加入含45Ca2+(1μCi/ml，Dupont 公司产品)的 Ringer 0.5ml/孔，非放射性 Ca2+ 为 50μmol/L ，置 37℃ 摇荡。按所需时间取出，弃上清后用含 1mmol/L La3+的7%山梨醇洗涤 3 次(冰浴)，加5%SDS十二烷基硫酸钠0.5ml/孔室温 2h，混匀取出在 Beckman LS9800 机上计数。按 Lowry 法测各孔蛋白量。
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4.统计学处理：配对 t 检验。
二、结果
1.LA3+对细胞表面非特异结合 45Ca2+的作用：采用含 La3+液洗涤标记45Ca2+的心肌细胞，测得的 cpm 数较用无 La3+液洗涤的降低 34% ；用其洗涤无细胞培养孔后达本底水平，表明本实验所得为净流入细胞的 Ca2+量。
2. CB3V 感染不同时间对心肌细胞 Ca2+内流的影响：感染6、24、72h时，细胞Ca2+内流量与对照组无差异；仅感染 48h 时细胞 Ca2+ 内流量显著增加(图1)。
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图1 感染时间与心肌细胞Ca2+内流的关系
3.Ca2+流入心肌细胞的时间曲线：感染 48h 的心肌细胞与对照组的 Ca2+ 流入时间曲线如图2。两组细胞的Ca2+流入均与流入时间有依赖关系，但病毒感染缚的Ca2+流入从1分钟开始均显著高于对照组。
图2 Ca2+流入心肌细胞的时间曲线(感染 48h)
4.Ca2+内流量与胞外Ca2+浓度的关系：感染细胞外Ca2+浓度(μmol/L)C图3 Ca2+流入速度与细胞外Ca2+浓度的关系48h，两组细胞Ca2+内流量与胞外非放射性Ca2+浓度呈直线关系；随着胞外Ca2+浓度增加，感染组细胞Ca2+内流对照组高得多，且缺乏流入的饱和性(图3)。
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三、讨论
三病毒感染过程中，吸附及穿细胞时可能使宿主细胞的膜脂层不稳定，引起膜电导性与膜渗透增加，从而改变膜的功能[J Mol Cell cardiol 1985,17(Supple)27∶11]。本实验在 CB3V 感染培养心肌细胞早期(48h)发现细胞的Ca2+内流显著增加；经动力学分析，符合两室动力学特征，证明是Ca2+通道活性增加所致。结果表明病毒感染在直接导致细胞损伤的同时，亦引起细胞膜离子运输系统的紊乱，是感染细胞产生异常动作电位的原因。
感染 72h 后，随着病毒在心肌细胞中不断复制，细胞病变逐渐加重，大量出现细胞变形、团缩及伪足断裂等，造成细胞膜表面积缩小，而致其有效Ca2+通道数目减少，可能是此时未见细胞Ca2+内流显著增加的重要原因。
心肌细胞Ca2+内流的增加，可激活膜上某些Ca2+依赖性磷脂酶，使细胞膜降解产生一系列细胞毒性物质；并可调节许多依赖Ca2+的重要的酶活性，导致细胞信息、电解质和能量代谢平衡的紊乱，从而促进细胞损伤。而 CBV 具有嗜心肌特性，在感染早期亦可造成心肌线粒体损伤[Circ Res,1981,48∶1]，使细胞内Ca2+的调节失控。结合本实验结果，提示在 CBV 引起的心肌细胞病变早期，可能存在着继发性的 Ca2+ 损伤，值得进一步研究。
本课题为国家自然科学基金资助项目
(收稿：1993-02-15 修回：1993-05-28), 百拇医药
单位：200032 上海医科大学中山医院心血管病研究所(郭 棋、杨英珍、陈灏珠)；中国科学院上海细胞生物学研究所(顾全保、赵剑星、朱 琳)
关键词：
中华医学杂志930921 我们应用放射性同位素45Ca2+示踪技术，观察了培养大鼠心肌细胞感染 Coxsackie B病毒(CBV)后，其 Ca2+内流的变化，现报道如下。
一、材料与方法
1.培养心肌细胞制备：出生1～3天的 SD 大鼠，取心室肌用0.1%胰蛋白酶液分次消化，方法按文献[J Virol Methods 1985;12∶217]。生长液用含 20% 小牛血清的培养 MEM 液。
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2.病毒及感染用量：CB3(Nancy 株)按 Reed 法测其 50% 组织感染率(TCID50)。在培养 18h 已呈规律搏动的心肌细胞上，每孔加入 0.5ml 含 100TCID50 的 CB3V 生长液，对照组加 0.5ml 生长液，置 37℃ 孵育 1h ，弃上清后再加生长液 1ml/孔培养观察。
3.Ca2+内流测定：同位素示踪法。各组细胞弃上清，用无 Ca-Ringer 液洗涤 3 次，加入含45Ca2+(1μCi/ml，Dupont 公司产品)的 Ringer 0.5ml/孔，非放射性 Ca2+ 为 50μmol/L ，置 37℃ 摇荡。按所需时间取出，弃上清后用含 1mmol/L La3+的7%山梨醇洗涤 3 次(冰浴)，加5%SDS十二烷基硫酸钠0.5ml/孔室温 2h，混匀取出在 Beckman LS9800 机上计数。按 Lowry 法测各孔蛋白量。
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4.统计学处理：配对 t 检验。
二、结果
1.LA3+对细胞表面非特异结合 45Ca2+的作用：采用含 La3+液洗涤标记45Ca2+的心肌细胞，测得的 cpm 数较用无 La3+液洗涤的降低 34% ；用其洗涤无细胞培养孔后达本底水平，表明本实验所得为净流入细胞的 Ca2+量。
2. CB3V 感染不同时间对心肌细胞 Ca2+内流的影响：感染6、24、72h时，细胞Ca2+内流量与对照组无差异；仅感染 48h 时细胞 Ca2+ 内流量显著增加(图1)。
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图1 感染时间与心肌细胞Ca2+内流的关系
3.Ca2+流入心肌细胞的时间曲线：感染 48h 的心肌细胞与对照组的 Ca2+ 流入时间曲线如图2。两组细胞的Ca2+流入均与流入时间有依赖关系，但病毒感染缚的Ca2+流入从1分钟开始均显著高于对照组。
图2 Ca2+流入心肌细胞的时间曲线(感染 48h)
4.Ca2+内流量与胞外Ca2+浓度的关系：感染细胞外Ca2+浓度(μmol/L)C图3 Ca2+流入速度与细胞外Ca2+浓度的关系48h，两组细胞Ca2+内流量与胞外非放射性Ca2+浓度呈直线关系；随着胞外Ca2+浓度增加，感染组细胞Ca2+内流对照组高得多，且缺乏流入的饱和性(图3)。
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三、讨论
三病毒感染过程中，吸附及穿细胞时可能使宿主细胞的膜脂层不稳定，引起膜电导性与膜渗透增加，从而改变膜的功能[J Mol Cell cardiol 1985,17(Supple)27∶11]。本实验在 CB3V 感染培养心肌细胞早期(48h)发现细胞的Ca2+内流显著增加；经动力学分析，符合两室动力学特征，证明是Ca2+通道活性增加所致。结果表明病毒感染在直接导致细胞损伤的同时，亦引起细胞膜离子运输系统的紊乱，是感染细胞产生异常动作电位的原因。
感染 72h 后，随着病毒在心肌细胞中不断复制，细胞病变逐渐加重，大量出现细胞变形、团缩及伪足断裂等，造成细胞膜表面积缩小，而致其有效Ca2+通道数目减少，可能是此时未见细胞Ca2+内流显著增加的重要原因。
心肌细胞Ca2+内流的增加，可激活膜上某些Ca2+依赖性磷脂酶，使细胞膜降解产生一系列细胞毒性物质；并可调节许多依赖Ca2+的重要的酶活性，导致细胞信息、电解质和能量代谢平衡的紊乱，从而促进细胞损伤。而 CBV 具有嗜心肌特性，在感染早期亦可造成心肌线粒体损伤[Circ Res,1981,48∶1]，使细胞内Ca2+的调节失控。结合本实验结果，提示在 CBV 引起的心肌细胞病变早期，可能存在着继发性的 Ca2+ 损伤，值得进一步研究。
本课题为国家自然科学基金资助项目
(收稿：1993-02-15 修回：1993-05-28), 百拇医药