肾综合征出血热患者肾组织及血液中出血热病毒RNA的检测及临床意义
作者：沈克勤 黎磊石 周 虹 刘志红
单位：210002 南京金陵医院 解放军肾脏病研究所
关键词：出血热，流行性；杂交；病毒
中华医学杂志931011 摘要 采用地高辛标记的出血热病毒cDNA探针，以原位杂交方法检测21例肾综合征出血热患者肾组织中出血热病毒核酸(HFV-RNA)脑其分布，并与肾组织免疫组化方法检测出血热病毒及同期血清斑点杂交检测HFV-RNA结果进行对比。发现肾组织内HFV-RNA的检出率重型为6/7例，中型及轻型分别为2/9例及0，与病情严重度成正比(P〈0.01)；与免疫复合物的沉积不相平行；与血清中HFV-RNA的检出亦无直接关联。从而证实在肾综合征出血热肾损伤的发生机理中免疫复合物病变与病毒的直接损伤作用同时存在。
肾综合征出血热(HFRS)是造成急性肾脏衰竭的重要原因之一。有关本病肾脏损害的发生机理从组织形态出发已做了不少研究[1，2]。作者等以曾证实免疫复合物在肾损伤中的致病作用，免疫荧光检查也证实出血热病毒(HFV)抗体能与肾小球基膜相结合[3]，但迄今为止HFV对肾组织直接损伤效应的学说因缺乏直接证据而仅仅是推理。现在采用分子生物学技术对HFRS患者肾组织中HFV进行了检测并结合临床分析其在致肾损伤中的作用。
, 百拇医药
对象及方法
一、对象
21例HFRS患者皆为住院患者，男20例，女1例；年龄16～55岁，平均33岁，均符合国家卫生部1987年2白颁发的《流行性出血热防治方案》诊断标准；全部病例血清抗出血热病毒抗体(IgG)滴度≥1：40(间接免疫荧光法)，疾病后期连续检测，抗体滴度持续升高。21例中重型7例，中型9例，轻型5例。
患者于病情趋于稳定，血清肌酐降至353.6mmol/L以下后在B型超声引导下行针吸快速穿刺法取肾组织。从起病到肾活检的时间为11～60天，平均25.9天；1例于入院后即死于少尿期的危重型患者在呼吸心跳停止后即刻做尸体肾穿刺取材。本组其余病例均痊愈出院。
二、方法
1.原位杂交：采用地高辛标记的流行性出血热病毒cDNA探针(Ding-HFV cDNA探针，购自北京医科大学)。简要操作步骤：(1)邓处理：肾组织冰冻切片经固定、蛋白酶K消化后脱水干燥。(2)杂交反应：将经变性处理后的Dig-HFV cDNA探针与杂交液(50%去离子甲酰胺、2×SSC、10%硫酸葡聚糖。2×Denhard液(聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白，聚蔗糖、250μg/ml变性鱼精DNA)。混合，滴加切片上，42℃杂交过液，继以2×SSC、0.2×SSC加温清洗。(3)结果检测：切片以0.3%BSA封闭→碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(D-Ding-AP)37℃1小时→缓冲液Ⅰ(0.1mol/LTris-HCl，0.15mol/L NaCl)洗20分钟，缓冲液Ⅱ(0.1mol/LTris-HCl，0.1mol/LNaCl，5mmol/L MgCl2)洗60分钟→硝基四氮唑蓝-5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸混合液暗处显示色→2%甲基绿衬染→透明封片。肾组织中蓝紫色颗粒为阳性。(4)对照：HFV感染的Vero-E6细胞片作阳性对照，同时设正常肾组织对照及不加探针的阴性对照。
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2.斑点杂交：9例患者在肾活检同日留取血清标本进行斑点杂交，试剂盒购自北京医科大学。操作步骤：(1)标本处理：待检血清经饱和酚、氯仿-异戊醇抽提后乙醇沉淀，加入甲醛变性。(2)杂交：将经上述处理的标本抽滤加样至硝酸纤维素膜上，80℃烤2小时，加入杂交液预杂交2小时，再加入经热变性处理的Dig-HFV cDNA探针，68℃杂交12小时以上。(3)结果检测：加N-Dig-AP37℃1小时，NBT-BCIP避光显色12小时。(4)阴性、阳性对照：试剂盒内提供。
3.免疫组化检查：肾组织冰冻切片以异硫氰荧光素标记的抗流行性出血热病毒抗体(本所自制)行直接法免疫荧光染色。另以辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG、IgA、IgM、C3、C1q按直接法酶标染色，观察肾组织中这些免疫成份的沉积状况。
结 果
一、原位杂交检测
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21份标本中，8例患者的肾组织中查见HFV-FNA，其阳性率与患者病情相关，以重型患者阳性率最高为6/7例，中型2/9例，轻型0/5例。重型与其他两型相比差异有非常显著意义(P〈0.01)。
观察HFV RNA在肾组织中的分布，除1例死于少尿期的危重型患者在肾小球、肾小管都检出HFV-RNA外，其余7例分布部位主要在肾小管上皮细胞内，有4例尚可见血管壁有阳性显示。
二、免疫组化检测
21例患者中，免疫荧光染色病毒抗原的检出与分子杂交的结果相近，原位杂交HFV RNA(+)的8例中免疫组化病毒抗原阳性的4例，而HFV-RNA(-)的13例中，病毒抗原阳性者仅2例，其余11例均为(-)。病毒抗原的分布亦多在肾小管上皮细胞内。
酶标染色发现，原位杂交阳性组肾组织内免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的沉积(3/8例)明显少于原位杂交阴性组(8/13例)(表1)。免疫复合物沉积部位主要在肾小球毛细血管基底膜，而C3在肾小球及肾小管均有沉积，且肾小管以C3沉积为主。
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表1 HFRS患者肾小球内免疫复合物沉积比较 序号
HFV-RNA(+)
HFV-RNA(-)
IgG
IgA
IgM
IgG
IgA
IgM
1
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2
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注：+阳性 -阴性
三、斑点杂交结果
9份肾穿刺当日血清标本中5份阳性，与相应肾组织中病毒核酸的检出无明显关联，(表2，附图)。
注：A1为空白对照，B4为阴性对照
附图 血清斑点杂交结果
表2 HFRS患者肾组织原位杂交与血清斑点杂交病毒核酸检出结果 序号
病程(d)
, 百拇医药 血清斑点杂交
肾组织原位杂交
1
20
-
-
2
24
-
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3
22
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4
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5
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17
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7
18
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8
25
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35
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讨 论
病毒感染造成肾组织损害可能是由于免疫复合物引起，也可能是病毒对细胞的直接损伤。血管壁病变及由此而产生的病理生理变化是HFRS发病机理中的核心环节，已经证明HFV能在体外培养的人体内皮细胞中繁殖[4]，由此有人推论病毒的直接作用很可能是血管损伤的重要原因。然而许多常见的病毒如腺病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒及巨细胞病毒等均可在人体内皮细胞培养中繁殖生长，但它们并没有造成类似HFRS的肾脏病损[4]，因此出血热病毒的直接损伤作用与HFRS肾损害的关联仍有许多不明了之处。
, 百拇医药
一、肾组织内HFV-RNA的检出率与病情的严重度成正比
本组21例肾活检标本中8例查见HFV-RNA，其阳性率与患者病情密切相关，病情重者其阳性率高，说明病毒在局部的繁衍及其所带来的组织损伤将影响肾脏病变的严重度。本组所有病例均同时应用免疫荧光技术检测肾组织内病毒抗原成份，发现它与病毒RNA检出的机会是基本一致的，在原位杂交(+)组其吻合率达50%，而在原位杂交(-)组，免疫荧光84.6%亦阴性，意味着病毒抗原的存在与病毒RNA的出现相互基本一致。
HFV-RNA在肾组织内的分布主要集中在肾小管，只有1例危重型病例(入院后迅即死亡)在肾小球及肾小管内同时存在，似乎说明病毒的直接损害作用在小管部位更为重要。
二、肾组织内HFV-RNA的检出与免疫复合物的沉积可能代表不同的发病机理
本组病例均同时应用免疫荧光技术检查肾组织内免疫复合物的沉积。饶有兴趣的是，发现它的出现规律与病毒核酸的检测结果很不一致。原位杂交(+)组中肾组织有免疫球蛋白沉积者仅占3/8例(37.5%)，而(-)组中却占8/13例(61.5%)，原位杂交(+)病例大多为重型病例，其出现免疫复合物沉积的机会反而较(-)者(轻型病例)为少，这一事实既说明了免疫复合物的出现与出血热病毒的存在无直接直联，也反映免疫复合物损伤可能与病毒对细胞的直接损伤是两种不同的发生机理。作者等在以往曾论述免疫复合物病变在出血热早期肾脏损害中可能具有重要意义，本组资料则进一步论证了HFV对肾脏细胞的损伤可能不仅在早期，在后期也是存在的，特别是重型病例。
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三、肾组织内与血清中HFV-RNA的检出无直接相关性。
有9例患者同时做了肾组织与血清中HFV RNA的检测，结果发现二者之间的检出率无明显相关性，有病毒血症者肾组织不一定有病毒核酸的存在，可能只是那些重型病例且处于疾病早期者，二者才会同时存在。
通过本项工作我们认为出血热的肾脏损伤既具有免疫复合物的病变，也存在病毒在局部造成的损伤。在疾病早期，免疫复合物可能是重要致病因素，而在极期、重型病例(尤其在肾小管病损)，病毒的直接损害可能起重要作用。当然，对病毒特异的免疫效应机制(特异性抗体或T细胞的作用)及病毒诱导产生的细胞因子及炎症介质的释放，也是不容忽视的致病因素，所有这些论点尚有待在今后的研究中进一步验证。
参考文献
1 Collan Y, Mihatsch M J, Lahdevirta J. Nephropathia epidemica: Mild variant of hemorrhagic fever with renal syndrine. Kidney Int, 1991, 40(Suppl 35):S62.
, 百拇医药
2 程德成，刁友芳，李维信.流行性出血热肾脏病变的观察——从光镜、电镜及免疫荧光观察探讨其发病机理.重庆医学院学报，1983，1：65.
3 黎磊石，李 莉，陈惠平，等.流行性出血热的免疫性肾脏损害，中华内科杂志，1988，27：10.
4 Cosgriff T M, Lewis R M. Mechanisms of disease in hemorrhagic fever withrenal syndrome. Kindey Int 1991, 40(Suppl 35):S72.
(收稿：1992-10-04 修回1992-06-25), 百拇医药
单位：210002 南京金陵医院 解放军肾脏病研究所
关键词：出血热，流行性；杂交；病毒
中华医学杂志931011 摘要 采用地高辛标记的出血热病毒cDNA探针，以原位杂交方法检测21例肾综合征出血热患者肾组织中出血热病毒核酸(HFV-RNA)脑其分布，并与肾组织免疫组化方法检测出血热病毒及同期血清斑点杂交检测HFV-RNA结果进行对比。发现肾组织内HFV-RNA的检出率重型为6/7例，中型及轻型分别为2/9例及0，与病情严重度成正比(P〈0.01)；与免疫复合物的沉积不相平行；与血清中HFV-RNA的检出亦无直接关联。从而证实在肾综合征出血热肾损伤的发生机理中免疫复合物病变与病毒的直接损伤作用同时存在。
肾综合征出血热(HFRS)是造成急性肾脏衰竭的重要原因之一。有关本病肾脏损害的发生机理从组织形态出发已做了不少研究[1，2]。作者等以曾证实免疫复合物在肾损伤中的致病作用，免疫荧光检查也证实出血热病毒(HFV)抗体能与肾小球基膜相结合[3]，但迄今为止HFV对肾组织直接损伤效应的学说因缺乏直接证据而仅仅是推理。现在采用分子生物学技术对HFRS患者肾组织中HFV进行了检测并结合临床分析其在致肾损伤中的作用。
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对象及方法
一、对象
21例HFRS患者皆为住院患者，男20例，女1例；年龄16～55岁，平均33岁，均符合国家卫生部1987年2白颁发的《流行性出血热防治方案》诊断标准；全部病例血清抗出血热病毒抗体(IgG)滴度≥1：40(间接免疫荧光法)，疾病后期连续检测，抗体滴度持续升高。21例中重型7例，中型9例，轻型5例。
患者于病情趋于稳定，血清肌酐降至353.6mmol/L以下后在B型超声引导下行针吸快速穿刺法取肾组织。从起病到肾活检的时间为11～60天，平均25.9天；1例于入院后即死于少尿期的危重型患者在呼吸心跳停止后即刻做尸体肾穿刺取材。本组其余病例均痊愈出院。
二、方法
1.原位杂交：采用地高辛标记的流行性出血热病毒cDNA探针(Ding-HFV cDNA探针，购自北京医科大学)。简要操作步骤：(1)邓处理：肾组织冰冻切片经固定、蛋白酶K消化后脱水干燥。(2)杂交反应：将经变性处理后的Dig-HFV cDNA探针与杂交液(50%去离子甲酰胺、2×SSC、10%硫酸葡聚糖。2×Denhard液(聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白，聚蔗糖、250μg/ml变性鱼精DNA)。混合，滴加切片上，42℃杂交过液，继以2×SSC、0.2×SSC加温清洗。(3)结果检测：切片以0.3%BSA封闭→碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(D-Ding-AP)37℃1小时→缓冲液Ⅰ(0.1mol/LTris-HCl，0.15mol/L NaCl)洗20分钟，缓冲液Ⅱ(0.1mol/LTris-HCl，0.1mol/LNaCl，5mmol/L MgCl2)洗60分钟→硝基四氮唑蓝-5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸混合液暗处显示色→2%甲基绿衬染→透明封片。肾组织中蓝紫色颗粒为阳性。(4)对照：HFV感染的Vero-E6细胞片作阳性对照，同时设正常肾组织对照及不加探针的阴性对照。
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2.斑点杂交：9例患者在肾活检同日留取血清标本进行斑点杂交，试剂盒购自北京医科大学。操作步骤：(1)标本处理：待检血清经饱和酚、氯仿-异戊醇抽提后乙醇沉淀，加入甲醛变性。(2)杂交：将经上述处理的标本抽滤加样至硝酸纤维素膜上，80℃烤2小时，加入杂交液预杂交2小时，再加入经热变性处理的Dig-HFV cDNA探针，68℃杂交12小时以上。(3)结果检测：加N-Dig-AP37℃1小时，NBT-BCIP避光显色12小时。(4)阴性、阳性对照：试剂盒内提供。
3.免疫组化检查：肾组织冰冻切片以异硫氰荧光素标记的抗流行性出血热病毒抗体(本所自制)行直接法免疫荧光染色。另以辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG、IgA、IgM、C3、C1q按直接法酶标染色，观察肾组织中这些免疫成份的沉积状况。
结 果
一、原位杂交检测
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21份标本中，8例患者的肾组织中查见HFV-FNA，其阳性率与患者病情相关，以重型患者阳性率最高为6/7例，中型2/9例，轻型0/5例。重型与其他两型相比差异有非常显著意义(P〈0.01)。
观察HFV RNA在肾组织中的分布，除1例死于少尿期的危重型患者在肾小球、肾小管都检出HFV-RNA外，其余7例分布部位主要在肾小管上皮细胞内，有4例尚可见血管壁有阳性显示。
二、免疫组化检测
21例患者中，免疫荧光染色病毒抗原的检出与分子杂交的结果相近，原位杂交HFV RNA(+)的8例中免疫组化病毒抗原阳性的4例，而HFV-RNA(-)的13例中，病毒抗原阳性者仅2例，其余11例均为(-)。病毒抗原的分布亦多在肾小管上皮细胞内。
酶标染色发现，原位杂交阳性组肾组织内免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的沉积(3/8例)明显少于原位杂交阴性组(8/13例)(表1)。免疫复合物沉积部位主要在肾小球毛细血管基底膜，而C3在肾小球及肾小管均有沉积，且肾小管以C3沉积为主。
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表1 HFRS患者肾小球内免疫复合物沉积比较 序号
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三、斑点杂交结果
9份肾穿刺当日血清标本中5份阳性，与相应肾组织中病毒核酸的检出无明显关联，(表2，附图)。
注：A1为空白对照，B4为阴性对照
附图 血清斑点杂交结果
表2 HFRS患者肾组织原位杂交与血清斑点杂交病毒核酸检出结果 序号
病程(d)
, 百拇医药 血清斑点杂交
肾组织原位杂交
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讨 论
病毒感染造成肾组织损害可能是由于免疫复合物引起，也可能是病毒对细胞的直接损伤。血管壁病变及由此而产生的病理生理变化是HFRS发病机理中的核心环节，已经证明HFV能在体外培养的人体内皮细胞中繁殖[4]，由此有人推论病毒的直接作用很可能是血管损伤的重要原因。然而许多常见的病毒如腺病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒及巨细胞病毒等均可在人体内皮细胞培养中繁殖生长，但它们并没有造成类似HFRS的肾脏病损[4]，因此出血热病毒的直接损伤作用与HFRS肾损害的关联仍有许多不明了之处。
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一、肾组织内HFV-RNA的检出率与病情的严重度成正比
本组21例肾活检标本中8例查见HFV-RNA，其阳性率与患者病情密切相关，病情重者其阳性率高，说明病毒在局部的繁衍及其所带来的组织损伤将影响肾脏病变的严重度。本组所有病例均同时应用免疫荧光技术检测肾组织内病毒抗原成份，发现它与病毒RNA检出的机会是基本一致的，在原位杂交(+)组其吻合率达50%，而在原位杂交(-)组，免疫荧光84.6%亦阴性，意味着病毒抗原的存在与病毒RNA的出现相互基本一致。
HFV-RNA在肾组织内的分布主要集中在肾小管，只有1例危重型病例(入院后迅即死亡)在肾小球及肾小管内同时存在，似乎说明病毒的直接损害作用在小管部位更为重要。
二、肾组织内HFV-RNA的检出与免疫复合物的沉积可能代表不同的发病机理
本组病例均同时应用免疫荧光技术检查肾组织内免疫复合物的沉积。饶有兴趣的是，发现它的出现规律与病毒核酸的检测结果很不一致。原位杂交(+)组中肾组织有免疫球蛋白沉积者仅占3/8例(37.5%)，而(-)组中却占8/13例(61.5%)，原位杂交(+)病例大多为重型病例，其出现免疫复合物沉积的机会反而较(-)者(轻型病例)为少，这一事实既说明了免疫复合物的出现与出血热病毒的存在无直接直联，也反映免疫复合物损伤可能与病毒对细胞的直接损伤是两种不同的发生机理。作者等在以往曾论述免疫复合物病变在出血热早期肾脏损害中可能具有重要意义，本组资料则进一步论证了HFV对肾脏细胞的损伤可能不仅在早期，在后期也是存在的，特别是重型病例。
, http://www.100md.com
三、肾组织内与血清中HFV-RNA的检出无直接相关性。
有9例患者同时做了肾组织与血清中HFV RNA的检测，结果发现二者之间的检出率无明显相关性，有病毒血症者肾组织不一定有病毒核酸的存在，可能只是那些重型病例且处于疾病早期者，二者才会同时存在。
通过本项工作我们认为出血热的肾脏损伤既具有免疫复合物的病变，也存在病毒在局部造成的损伤。在疾病早期，免疫复合物可能是重要致病因素，而在极期、重型病例(尤其在肾小管病损)，病毒的直接损害可能起重要作用。当然，对病毒特异的免疫效应机制(特异性抗体或T细胞的作用)及病毒诱导产生的细胞因子及炎症介质的释放，也是不容忽视的致病因素，所有这些论点尚有待在今后的研究中进一步验证。
参考文献
1 Collan Y, Mihatsch M J, Lahdevirta J. Nephropathia epidemica: Mild variant of hemorrhagic fever with renal syndrine. Kidney Int, 1991, 40(Suppl 35):S62.
, 百拇医药
2 程德成，刁友芳，李维信.流行性出血热肾脏病变的观察——从光镜、电镜及免疫荧光观察探讨其发病机理.重庆医学院学报，1983，1：65.
3 黎磊石，李 莉，陈惠平，等.流行性出血热的免疫性肾脏损害，中华内科杂志，1988，27：10.
4 Cosgriff T M, Lewis R M. Mechanisms of disease in hemorrhagic fever withrenal syndrome. Kindey Int 1991, 40(Suppl 35):S72.
(收稿：1992-10-04 修回1992-06-25), 百拇医药