SSA抗原的纯化及抗SSA抗体的检测
作者：李小春 甘小丹 史艳萍 宋琴芳 文竹咸
单位：100730北京协和医院口腔科(李小春、文竹咸)，风湿免疫科(甘小丹、史艳萍、宋琴芳)
关键词：
中华医学杂志931020 为提高抗SSA抗体检测的特异性和敏感性，我们对从人脾组织提取的可提取性核抗原(ENA)进行了纯化，对此抗原采用ELISA方法对不同的自身免疫疾病患者血清中的抗SSA抗体进行了检测。
一、材料和方法
1.ENA抗原的制备：方法见文献[1]。
2.亲和层析法纯化SSA抗原：新和柱为溴为氢活化的Sepharose 4B(Cigma产品)与浓缩的单纯抗SSA阳性抗血清交联制成。方法按文献[2]取用ENA抗原200mg，用pH7.4、0.01mol/L缓冲溶解后加入亲和柱内封闭过液，再用上述缓冲液洗去未结合的抗原至波长280nm的吸光度小于0.02，用3mol/L的吸光度大于0.3的溶液经PBS透析后与抗SSA标准血清(美国疾病中心)进行参比电脉，证实为SSA抗原，冷冻干燥置-79℃备用。
, http://www.100md.com
3.抗原成分鉴定：(1)将纯化后的抗原与标准分子量蛋白同时进行SDS聚丙烯凝胶电冰分离。(2)免疫印迹(Western Blot)：将分离后的SSA抗原由凝胶转印至硝酸纤维膜上，然后将膜切成0.3cm宽条带，洗涤后分别加1：100稀释的SSA标准抗体和含有其它自身抗体的阳性血清，室温1.5小时后洗涤，再加1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG室温1.5小时后洗涤，加新配底物3，3′-二胺基联苯胺30分钟后洗涤。(3)ELISA法：用纯化的SSA抗原包被96孔聚苯乙烯板，浓度7.5μg/ml，每孔200μl4℃20小时；弃包被液，吐温缓冲液洗涤3次；加明胶阻断液阻断1小时，洗涤，加1：200稀释的待测血清室温2小时，洗涤，加1：4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，室温2小时后加新配底物ABTS200μl，1小时后以410nm波长测各孔吸光度，以大于正常人
±2s＝0.276+0.072为阳性。(4)用经纯化的SSA抗原采用ELISA法和用未经纯化的ENA抗原用免疫双扩散法(ID法)对96例自身免疫病患者和40名正常人血清中SSA抗体进行检测。
, 百拇医药
二、结果
1.纯化后的SSA抗原经免疫印迹法检测仅出现一条蛋白多肽带，与同时电泳分离的标准分子量比较证实其分子量为60 000，并且只与抗SSA抗体反应，不与其它自身抗体发生交叉反应。
2.96例自身免疫病患者和40名正常人血清中抗SSA抗体检测结果见附表
附表 ID法和ELISA法检测抗SSA抗体阳性率的比较 疾病名称
检测例数
ID法
ELISA法
阳性例数
阳性率(%)
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阳性例数
阳性率(%)
干燥综合征
32
23
71.8
25
78.1
系统性红斑狼疮
52
23
44.2
25
, 百拇医药
53.8
类风湿关节炎
12
0
0
2
16.6
正常人
40
0
0
1
2.5
用纯化后的SSA抗原进行ELISA法检测较传统的ID法比较，抗SSA抗体的检出率有所提高，但统计学检测差异无显著意义。
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三、讨论
本组纯化的SSA抗原与Slobbe等[3]检测结果比较缺少一条52 000的多肽带，这可能与制备过程中抗原成分的丢失或提取物的来源不同有关。抗SSB抗体多伴随抗SSA抗体同时出现，而SSA和SSB抗原常同时存在于一个蛋白分子中。传统的ID法常因沉淀线分辩不清而造成误差，而我们用单纯抗SSA抗体制备的亲和层析柱可将SSA抗原分离出来，检测证明特异性很强。用ELISA法检测IgG型抗SSA抗体的阳性率国外学者的结果基本一致。证明此方法较ID法敏感、可靠。
参考文献
1 唐福林，董 怡，陈培珍.ENA的提取及抗RNP及抗Sm抗体的测定，全国风湿病专题学术会议论文汇编.1982.
2 武建国.亲和色谱.实用临床免疫学检验，南京：江苏科学技术出版社，1989，38
3 Slobbe, R L, Pruijn G J M, Damen W G M et al. Detection and occurence of the 60-and 52-KD Ro(SS-A)antigens and of autoantibodies against these proteins Clin. Exp. Immunol. 1991, 86:99
(收稿：1993-02-17 修回：1993-07-20), http://www.100md.com
单位：100730北京协和医院口腔科(李小春、文竹咸)，风湿免疫科(甘小丹、史艳萍、宋琴芳)
关键词：
中华医学杂志931020 为提高抗SSA抗体检测的特异性和敏感性，我们对从人脾组织提取的可提取性核抗原(ENA)进行了纯化，对此抗原采用ELISA方法对不同的自身免疫疾病患者血清中的抗SSA抗体进行了检测。
一、材料和方法
1.ENA抗原的制备：方法见文献[1]。
2.亲和层析法纯化SSA抗原：新和柱为溴为氢活化的Sepharose 4B(Cigma产品)与浓缩的单纯抗SSA阳性抗血清交联制成。方法按文献[2]取用ENA抗原200mg，用pH7.4、0.01mol/L缓冲溶解后加入亲和柱内封闭过液，再用上述缓冲液洗去未结合的抗原至波长280nm的吸光度小于0.02，用3mol/L的吸光度大于0.3的溶液经PBS透析后与抗SSA标准血清(美国疾病中心)进行参比电脉，证实为SSA抗原，冷冻干燥置-79℃备用。
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3.抗原成分鉴定：(1)将纯化后的抗原与标准分子量蛋白同时进行SDS聚丙烯凝胶电冰分离。(2)免疫印迹(Western Blot)：将分离后的SSA抗原由凝胶转印至硝酸纤维膜上，然后将膜切成0.3cm宽条带，洗涤后分别加1：100稀释的SSA标准抗体和含有其它自身抗体的阳性血清，室温1.5小时后洗涤，再加1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG室温1.5小时后洗涤，加新配底物3，3′-二胺基联苯胺30分钟后洗涤。(3)ELISA法：用纯化的SSA抗原包被96孔聚苯乙烯板，浓度7.5μg/ml，每孔200μl4℃20小时；弃包被液，吐温缓冲液洗涤3次；加明胶阻断液阻断1小时，洗涤，加1：200稀释的待测血清室温2小时，洗涤，加1：4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，室温2小时后加新配底物ABTS200μl，1小时后以410nm波长测各孔吸光度，以大于正常人
±2s＝0.276+0.072为阳性。(4)用经纯化的SSA抗原采用ELISA法和用未经纯化的ENA抗原用免疫双扩散法(ID法)对96例自身免疫病患者和40名正常人血清中SSA抗体进行检测。, 百拇医药
二、结果
1.纯化后的SSA抗原经免疫印迹法检测仅出现一条蛋白多肽带，与同时电泳分离的标准分子量比较证实其分子量为60 000，并且只与抗SSA抗体反应，不与其它自身抗体发生交叉反应。
2.96例自身免疫病患者和40名正常人血清中抗SSA抗体检测结果见附表
附表 ID法和ELISA法检测抗SSA抗体阳性率的比较 疾病名称
检测例数
ID法
ELISA法
阳性例数
阳性率(%)
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阳性例数
阳性率(%)
干燥综合征
32
23
71.8
25
78.1
系统性红斑狼疮
52
23
44.2
25
, 百拇医药
53.8
类风湿关节炎
12
0
0
2
16.6
正常人
40
0
0
1
2.5
用纯化后的SSA抗原进行ELISA法检测较传统的ID法比较，抗SSA抗体的检出率有所提高，但统计学检测差异无显著意义。
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三、讨论
本组纯化的SSA抗原与Slobbe等[3]检测结果比较缺少一条52 000的多肽带，这可能与制备过程中抗原成分的丢失或提取物的来源不同有关。抗SSB抗体多伴随抗SSA抗体同时出现，而SSA和SSB抗原常同时存在于一个蛋白分子中。传统的ID法常因沉淀线分辩不清而造成误差，而我们用单纯抗SSA抗体制备的亲和层析柱可将SSA抗原分离出来，检测证明特异性很强。用ELISA法检测IgG型抗SSA抗体的阳性率国外学者的结果基本一致。证明此方法较ID法敏感、可靠。
参考文献
1 唐福林，董 怡，陈培珍.ENA的提取及抗RNP及抗Sm抗体的测定，全国风湿病专题学术会议论文汇编.1982.
2 武建国.亲和色谱.实用临床免疫学检验，南京：江苏科学技术出版社，1989，38
3 Slobbe, R L, Pruijn G J M, Damen W G M et al. Detection and occurence of the 60-and 52-KD Ro(SS-A)antigens and of autoantibodies against these proteins Clin. Exp. Immunol. 1991, 86:99
(收稿：1993-02-17 修回：1993-07-20), http://www.100md.com