肥厚心肌提取物心肌细胞生长及其作用机制的研究
作者：王 玮 崔致贤 苏成芝 李兰荪 李 源 龚卫琴 张珊红 张阳阳
单位：710032西安，第四军医大学西京医院(王 玮 崔致贤 李兰荪 李 源 龚卫琴 张珊红 张阳阳)，生化教研室(苏成芝)
关键词：
中华医学杂志931017 应用培养新生SD仔鼠心肌细胞模型，观察自发性高血压大鼠(SHR)肥厚心肌匀浆提取物对心肌细胞核酸合成、蛋白质含量、细胞体积与原癌基因C-myc表达的影响，并观察Ca2+通道阻滞剂维拉帕米对其作用的干预，探讨该活性因子的可能的作用机制。
一、材料与方法
1.SHR肥厚心肌匀浆上清液的制备：20周龄SHR大鼠15只(中国医学科学院阜外医院提供)。同样方法制备WKY对照大鼠心肌匀浆上清液[1]。
, http://www.100md.com
2.心肌细胞培养：采用生后1～3天的SD仔鼠(第四军医大学实验动物中心提供)[2]。
3.培养心肌细胞核酸合成：心肌细胞培养24小时后加入刺激物，定时加入3H-UR0.5μCi/孔(上海原子所研究所)，继续培养6小时。PBS洗3次，0.25%胰蛋白酶加乙二胺四乙酸二钠盐消化细胞，收集于滤纸，液闪计数仪计算细胞H-UR渗入量。
培养心肌细胞蛋白质含量：按上述方法培养、清洗3次后加入1%十二烷基硫酸钠(SDS)溶解细胞，DU-7紫外分光光度计(Sigma公司)测定吸光度215、225值，按公式求出蛋白质含量，除以样本细胞数，得出单个心肌细胞平均蛋白质含量。
心肌细胞体积：按上述方法培养并制成单细胞悬液，取0.1ml滴于细胞池内，倒置显微镜下选3个不同视野拍照，TAS- Plus图像分析仪(德国)求出单个心肌细胞平均体积。
, 百拇医药
4.C-myc质粒DNA提取与探针制备：C-myc质粒由美国麻省理工学院Jay Mavgerstern教授惠赠。碱变性法提取质粒DNA[3]，经EcoRI和HindⅢ酶解，低融点琼脂糖法回收约8kb的C-myc基因片段。随机引物延伸法[4]制备ɑ-32P-dATP(北京福瑞公司)标记的C-myc探针，探针比活性为5×107cpm/ugDNA。
5.心肌细胞总RNA提取：培养与清洗后，用自制橡皮刮下贴壁心肌细胞，盐酸胍一步法[5]取细胞总RNA。
6.RNA打点杂交：RNA样品中加入等体积变性液，50℃水浴变性一小时后用0.1%SDS从10μg开始倍比稀释，点于20×SSC预处理的硝酸纤维膜上，80℃烘烤3小时。杂交前用20mmol/L Tris Cl(pH8.0)煮沸10分钟，室温下晾干，按Hames法[6]杂交，杂交后将膜漂洗、晾干，包以新鲜膜，-79℃放射自显影7天。
, 百拇医药
7.杂交信号定量测定：用TAS-Plus图像分析仪测定C-myc癌基因探针与培养心肌细胞总RNA打点杂交信号灰度值。
8.统计学处理：实验数据以均数及标准差表示，组间均数对比用t检验或方差分析。
二、结果与讨论
本实验采用成年SHR大鼠心肌匀浆上清液刺激培养SD仔鼠心肌细胞，可明显促进心肌细胞3H-UR渗入，不同刺激物对3H-UR渗入率的影响见表1。SHR心肌匀浆提取物加维拉帕米组3H-UR渗入率明显高于对照组， 但低于单用SHR心肌提取物组。持续刺激则心肌细胞蛋白质含量增加，细胞体积增大(表2，3)。对心肌细胞上述三项指标的作用呈明显剂量、时间依赖关系，进一步证明SHR心肌提取物存在明显促进培养心肌细胞生长的可溶性活性因子。用Ca2+通道阻滞剂维拉帕米干预，发现在一定程度上可抑制该因子的促进心肌细胞生长的作用，并呈剂量依赖关系，但药物剂量增至一定时，抑制作用不再增加，并随作用时间延长，抑制作用渐趋减弱，7天时对心肌细胞蛋白质含量、细胞体积的抑制作用近消失。Ca2+通道阻滞剂可能部分介导子该活性因子促进心肌细胞生长的作用。SHR肥厚心肌中活性因子促进心肌细胞生长与C-myc mRNA高表达有关，C-myc癌基因可能参与介导该活性因子促进心肌细胞生长的作用。生理状态下C-myc基因仅在胚胎期或生后不久的心肌中表达。然而在压力负荷、去甲肾上腺素(NE)、血管紧张素Ⅱ(AgⅡ)及SHR心肌活性因子等外来刺激可诱导心肌肥厚及C-myc基因的再表达，提示(1)C-myc表达增高不仅与心肌细胞分裂有关，且与心肌肥厚关系密切；(2)外来因素诱导的心肌细胞肥大与心肌细胞增殖具有共同的机制；(3)SHR心肌活性因子与NE、AgⅡ及压力负荷等作用可能具有一个传递肥大反应信号的共同通路。本组结果提示SHR心肌中存在的可溶性活性因子可能作为一种局部生长因子，通过旁分泌或自分泌方式发挥作用。
, 百拇医药
表1 肥原心肌提取物对培养心肌细胞3H-UR掺入率的影响(
±s,cpm) 组别
24h
48h
72h
对照组
2236±547
3496±714
415±821
WKY
2384±601△
, http://www.100md.com
3775±694△
5071±688△
WHR
3168±662*
5737±830*
7329±704*
SHR+Ver
2745±582*△
4711±682*△
6132±811*△
, http://www.100md.com
注：△与对照组比较P〈0.05，*与SHR组比较P〈0.05。对照组：磷酸缓冲液：WKY：WKY大鼠心肌提取物，SHR：SHR大鼠心肌提取物SHR+Ver:SHR大鼠心肌提取物加维拉帕米。下同
表2 肥厚心肌提取物对心肌细胞平均蛋白质含量的影响(±s, pg/cell) 组别
4d
7d
对照组
945±93
1049±96
WKY
, 百拇医药
987±81△
1115±90△
WHR
1183±104*
1398±113*
SHR+Ver
1037±84*△
1338±108*
表3 肥厚心提取物对培养心肌细胞平均体积的影响(±s, pg/cell) 组别
, http://www.100md.com
4d
7d
对照组
1309±19
1501±24
WKY
1458±28△
1612±35△
WHR
1725±28*
2107±32*
SHR+Ver
, http://www.100md.com
1521±23*△
2049±39*
参考文献
1 Sen S. Factors regulating myocardial hypertrophy in hypertension. Circulation 1987, 75(1 Pt 2):181.
2 Actor RT, Lynn JD. Cell Culture and its Application. New York Academic Press 1977:729.
3 Maniatis T, Fritsch EF, sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1982:86～88.
, 百拇医药
4 Feinberg AP, Vogelstein B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragnants to high specific acfivity. Anal Biochem 1983, 132:6.
5 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidnum thiocyanate-phenol-choroform extraction. Anal Biochem 1987, 162:156.
6 Williams JG, Mason PJ. Hybridisation in the analysis of RNA. In: Hames BD, Hinggins ST eds. Nucleic acid hybridisation. Oxford IRL Press 1985:143～144.
(收稿：1992-11-10 修回：1993-05-22), 百拇医药
单位：710032西安，第四军医大学西京医院(王 玮 崔致贤 李兰荪 李 源 龚卫琴 张珊红 张阳阳)，生化教研室(苏成芝)
关键词：
中华医学杂志931017 应用培养新生SD仔鼠心肌细胞模型，观察自发性高血压大鼠(SHR)肥厚心肌匀浆提取物对心肌细胞核酸合成、蛋白质含量、细胞体积与原癌基因C-myc表达的影响，并观察Ca2+通道阻滞剂维拉帕米对其作用的干预，探讨该活性因子的可能的作用机制。
一、材料与方法
1.SHR肥厚心肌匀浆上清液的制备：20周龄SHR大鼠15只(中国医学科学院阜外医院提供)。同样方法制备WKY对照大鼠心肌匀浆上清液[1]。
, http://www.100md.com
2.心肌细胞培养：采用生后1～3天的SD仔鼠(第四军医大学实验动物中心提供)[2]。
3.培养心肌细胞核酸合成：心肌细胞培养24小时后加入刺激物，定时加入3H-UR0.5μCi/孔(上海原子所研究所)，继续培养6小时。PBS洗3次，0.25%胰蛋白酶加乙二胺四乙酸二钠盐消化细胞，收集于滤纸，液闪计数仪计算细胞H-UR渗入量。
培养心肌细胞蛋白质含量：按上述方法培养、清洗3次后加入1%十二烷基硫酸钠(SDS)溶解细胞，DU-7紫外分光光度计(Sigma公司)测定吸光度215、225值，按公式求出蛋白质含量，除以样本细胞数，得出单个心肌细胞平均蛋白质含量。
心肌细胞体积：按上述方法培养并制成单细胞悬液，取0.1ml滴于细胞池内，倒置显微镜下选3个不同视野拍照，TAS- Plus图像分析仪(德国)求出单个心肌细胞平均体积。
, 百拇医药
4.C-myc质粒DNA提取与探针制备：C-myc质粒由美国麻省理工学院Jay Mavgerstern教授惠赠。碱变性法提取质粒DNA[3]，经EcoRI和HindⅢ酶解，低融点琼脂糖法回收约8kb的C-myc基因片段。随机引物延伸法[4]制备ɑ-32P-dATP(北京福瑞公司)标记的C-myc探针，探针比活性为5×107cpm/ugDNA。
5.心肌细胞总RNA提取：培养与清洗后，用自制橡皮刮下贴壁心肌细胞，盐酸胍一步法[5]取细胞总RNA。
6.RNA打点杂交：RNA样品中加入等体积变性液，50℃水浴变性一小时后用0.1%SDS从10μg开始倍比稀释，点于20×SSC预处理的硝酸纤维膜上，80℃烘烤3小时。杂交前用20mmol/L Tris Cl(pH8.0)煮沸10分钟，室温下晾干，按Hames法[6]杂交，杂交后将膜漂洗、晾干，包以新鲜膜，-79℃放射自显影7天。
, 百拇医药
7.杂交信号定量测定：用TAS-Plus图像分析仪测定C-myc癌基因探针与培养心肌细胞总RNA打点杂交信号灰度值。
8.统计学处理：实验数据以均数及标准差表示，组间均数对比用t检验或方差分析。
二、结果与讨论
本实验采用成年SHR大鼠心肌匀浆上清液刺激培养SD仔鼠心肌细胞，可明显促进心肌细胞3H-UR渗入，不同刺激物对3H-UR渗入率的影响见表1。SHR心肌匀浆提取物加维拉帕米组3H-UR渗入率明显高于对照组， 但低于单用SHR心肌提取物组。持续刺激则心肌细胞蛋白质含量增加，细胞体积增大(表2，3)。对心肌细胞上述三项指标的作用呈明显剂量、时间依赖关系，进一步证明SHR心肌提取物存在明显促进培养心肌细胞生长的可溶性活性因子。用Ca2+通道阻滞剂维拉帕米干预，发现在一定程度上可抑制该因子的促进心肌细胞生长的作用，并呈剂量依赖关系，但药物剂量增至一定时，抑制作用不再增加，并随作用时间延长，抑制作用渐趋减弱，7天时对心肌细胞蛋白质含量、细胞体积的抑制作用近消失。Ca2+通道阻滞剂可能部分介导子该活性因子促进心肌细胞生长的作用。SHR肥厚心肌中活性因子促进心肌细胞生长与C-myc mRNA高表达有关，C-myc癌基因可能参与介导该活性因子促进心肌细胞生长的作用。生理状态下C-myc基因仅在胚胎期或生后不久的心肌中表达。然而在压力负荷、去甲肾上腺素(NE)、血管紧张素Ⅱ(AgⅡ)及SHR心肌活性因子等外来刺激可诱导心肌肥厚及C-myc基因的再表达，提示(1)C-myc表达增高不仅与心肌细胞分裂有关，且与心肌肥厚关系密切；(2)外来因素诱导的心肌细胞肥大与心肌细胞增殖具有共同的机制；(3)SHR心肌活性因子与NE、AgⅡ及压力负荷等作用可能具有一个传递肥大反应信号的共同通路。本组结果提示SHR心肌中存在的可溶性活性因子可能作为一种局部生长因子，通过旁分泌或自分泌方式发挥作用。
, 百拇医药
表1 肥原心肌提取物对培养心肌细胞3H-UR掺入率的影响(
±s,cpm) 组别24h
48h
72h
对照组
2236±547
3496±714
415±821
WKY
2384±601△
, http://www.100md.com
3775±694△
5071±688△
WHR
3168±662*
5737±830*
7329±704*
SHR+Ver
2745±582*△
4711±682*△
6132±811*△
, http://www.100md.com
注：△与对照组比较P〈0.05，*与SHR组比较P〈0.05。对照组：磷酸缓冲液：WKY：WKY大鼠心肌提取物，SHR：SHR大鼠心肌提取物SHR+Ver:SHR大鼠心肌提取物加维拉帕米。下同
表2 肥厚心肌提取物对心肌细胞平均蛋白质含量的影响(
±s, pg/cell) 组别4d
7d
对照组
945±93
1049±96
WKY
, 百拇医药
987±81△
1115±90△
WHR
1183±104*
1398±113*
SHR+Ver
1037±84*△
1338±108*
表3 肥厚心提取物对培养心肌细胞平均体积的影响(
±s, pg/cell) 组别, http://www.100md.com
4d
7d
对照组
1309±19
1501±24
WKY
1458±28△
1612±35△
WHR
1725±28*
2107±32*
SHR+Ver
, http://www.100md.com
1521±23*△
2049±39*
参考文献
1 Sen S. Factors regulating myocardial hypertrophy in hypertension. Circulation 1987, 75(1 Pt 2):181.
2 Actor RT, Lynn JD. Cell Culture and its Application. New York Academic Press 1977:729.
3 Maniatis T, Fritsch EF, sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1982:86～88.
, 百拇医药
4 Feinberg AP, Vogelstein B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragnants to high specific acfivity. Anal Biochem 1983, 132:6.
5 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidnum thiocyanate-phenol-choroform extraction. Anal Biochem 1987, 162:156.
6 Williams JG, Mason PJ. Hybridisation in the analysis of RNA. In: Hames BD, Hinggins ST eds. Nucleic acid hybridisation. Oxford IRL Press 1985:143～144.
(收稿：1992-11-10 修回：1993-05-22), 百拇医药