系统性红斑狼疮病人中CD2介导的T淋巴细胞增殖反应
作者：唐福林 David.Horwitz
单位：100730北京协和医院(唐福林)；美国南加州大学医学院(David A.Horwitz)
关键词：红斑狼疮，全身性；单核细胞；受体，抗原，T-细胞
中华医学杂志931108 摘要 对18例系统性红斑狼疮病人和正常人的外周单个核细胞(PBMC)，在体外经植物血凝素、抗CD2和抗CD3单克隆抗体刺激后，并以3H标记的胸腺嘧啶测定其增殖反应，结果发现，系统性红斑狼疮病人PBMC对抗CD2的增殖反应(9257±8543cpm)明显低於正常人(20619±15279cpm),这种低反应尤在8例未经治疗的活动期病人更为突出。还对4例活动期病人的纯化T细胞进行了体外增殖反应观察，发现去除单核细胞后的T细胞在辅助细胞(EBV-B)和抗体CD2作用下，其增殖反应(72697±22876cpm)亦低于正常人(114575±43110cpm)(P＝0.05)。两组相比，PBMC和T细胞对抗CD3的反应差异无显著意义。结果说明，系统性红斑狼疮病人的T细胞对抗CD2的低反应并不受单核细胞的影响，而可能是其内在的缺陷。
, http://www.100md.com
系统性红斑狼疮(SLE)是一种伴有多种自身抗体，临床上以多系统受累的自身免疫性疾病。随着对T淋巴细胞亚型研究的日趋深入，业已发现，CD3受体是T淋巴细胞表面抗原占优势的受体；CD2受体是成熟T淋巴细胞和胸腺细胞的激活信号，在胸腺细胞分化中有重要作用〔1，2〕。用环磷酰胺静脉冲击治疗的SLE病人，其T淋巴细胞在体外对抗CD2抗体的增殖反应下降〔3〕。Fox等〔4〕发现，抗CD2抗体介导的外周血单个核细胞(PBMC)在体外增殖反应下降同疾病的活动性无关。由于CD2在T淋巴细胞对抗原刺激的激活中有复合刺激的功能，故研究CD2受体，对了解依赖T细胞的B细胞调节异常有着重要意义。
对象和方法
一、病例选择
, 百拇医药
18例SLE病人，全部符合1982年美国风湿病学会修订的分类标准〔5〕。其中男2例，女16例。年龄20～56岁，平均年龄34岁。8例活动期〔6〕病人采血前一周均未使用肾上腺皮质激素及环磷酰胺等免疫抑制剂。10例缓解期病人采血前皮质激素用量均在20mg/日以下。18名正常人的年龄、性别、种族均与病人相匹配。
二、细胞制备〔7〕
1.PBMC制备：采用聚葡糖泛影葡胺密度梯度离心分离法。
2.T细胞纯化：分离出的PBMC经尼龙柱吸附后，悬浮非吸附细胞，再经绵羊红细胞E玫瑰花结分离出E(+)细胞。E(+)细胞进一步与抗人类白细胞抗原-DR(L243，IgG2a)，抗CD16(3G8，IgG1)，抗CD11b(OKM1，IgG2b)结合，再与抗鼠Ig的磁化珠作用后，负选择得到T细胞，经细胞流式仪测定，T细胞纯度>98%。
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3.B细胞纯化：分离后的PBMC经尼龙柱吸附后，悬浮吸附细胞，选用E(-)细胞，再与抗CD3(Ortho,Pharmactimlar.Raritan,NJ)抗CD11b和抗CD16结合，经抗鼠Ig的磁化珠负选择，分离出的B细胞经细胞流式仪测定纯度>98%。
4.EBV-B细胞：纯化的B细胞与B95-8细胞株，37C孵育1小时，经2%小牛血清培养液洗涤后在培养液中培养生长。
三、PBMC和T细胞的体外增殖反应
PBMC(1×105/孔)或T细胞(5×104/孔)在96孔平底培养板，分别与不同的刺激剂：PHA(1μg/ml，英国贝克曼公司出品)，抗CD2(GT21∶50，Bethesda,MD)，抗CD3(454，100ng/ml)孵育96小时后，加入18.5kBq(1kBq＝0.027μCi)3H标记的胸腺嘧啶(ICN，Irivine,CA;111GBq/mol,SP active)18小时后，收集细胞，液闪计数。对于T细胞的增殖反应，除加入不同刺激剂外，可加入辅助细胞(EBV-B2×104/孔)。
, 百拇医药
结 果
一、正常人和SLE病人的PBMC体外增殖反应(表1)
表1 正常人和SLE病人PBMC体外增殖反应(cpm,
±S) 组别
n
PHA
抗CD2
抗CD2
正常人
18
82403±58470
, 百拇医药
20619±15279
25893±23866
SLE
18
59882±48490
9257±8543
21371±20306
P值
0.139
0.005
0.444
18例正常人和18例SLE病人，PBMC对PHA和抗CD3的增殖反应，差异均无显著意义，而对抗CD2介导的增殖反应，SLE病人明显低于正常人(P＝0.005)。
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二、正常人和活动期SLE病人的PBMC体外增殖反应(表2)
表2 正常人和活动期SLE病人PBMC体外增殖反应(cpm,±S) 组别
n
PHA
抗CD2
抗CD2
正常人
8
83848±54244
24389±15615
, 百拇医药
32431±28624
SLE
8
73301±58846
10246±9752
27007±21830
P值
0.597
0.016
0.595
抗CD2介导的增殖反应在活动期SLE病人中明显低于正常人(P＝0.016)。而由PHA和抗CD3，诱导的增殖反应在活动期SLE病人和正常人中差异无显著意义。
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三、正常人和非活动期SLE病人的PBMC在体外的增殖反应(表3)
表3 正常人和非活动期SLE病人PBMC体外增殖反应(cpm,±S) 组别
n
PHA
抗CD2
抗CD2
正常人
10
80596±62177
19144±15567
, 百拇医药
17721±13875
SLE
10
43108±26062
9735±7640
14327±16928
P值
0.136
0.219
0.527
尽管非活动期SLE病人的PBMC对PHA、抗CD2和抗CD3增殖反应均低于正常人，但差异无显著意义(表3)。
, 百拇医药
四、纯化T细胞在体外增殖反应(表4)
表4 正常人和活动期SLE病人T细胞体外增殖反应(cpm,±S) 组别
n
抗CD2
抗CD2
正常人
4
114575±43110
28340±12267
SLE
, 百拇医药
4
72697±22876
16679±7664
P值
0.05
0.241
为了解T细胞增殖反应的缺陷，是否受其他辅助细胞的影响，在分离后的PBMC中清除NK细胞、单核细胞和B细胞，而在加入EBV-B辅助细胞作用下，观察纯化的T细胞增殖反应。从表4中可见T细胞在CD2介导的增殖反应中，SLE病人低于正常人(P=0.05)，而对抗CD3和PHA刺激的增殖反应，二者之间差异无显著意义，这表明T细胞的增殖反应缺陷并不受辅助细胞的影响。
讨 论
, http://www.100md.com
SLE是以对自身抗原耐受禁锢的破坏和T细胞数量、功能异常，B细胞过度反应为特征的自身免疫性疾病〔1，2〕。其发病机制至今仍不清楚。随着细胞免疫学和分子免疫学的发展，已知T淋巴细胞表面受体和表面抗原在其激活、增殖中起重要作用。T淋巴细胞可被Ti/CD3复合物或CD2分子所激活〔8〕。CD2调节不依赖抗原激活的通道反应〔9〕，经由CD2传递的激活信号是特异性抗原道反应中的组成部分〔10〕。SLE病人中，T淋巴细胞有多种表面抗原的异常〔3～6〕。本研究发现，虽然SLE病人经由PHA、抗CD3的增殖反应比正常人低，但无统计学意义，而对抗CD2介导的增殖反应则有明显的缺陷，而且在活动期SLE病人中更为突出。Fox等〔4〕近来的研究发现，SLE病人中PBMC在体外对CD2介导的低反应同疾病的活动性及药物应用，如免疫抑制剂无关，并发现少数SLE病人，尤其缓解期的病人，对CD2介导的增殖反应可高天正常人，这表明SLE病人T淋巴细胞表面受体的激活十分个体化，即存在异质性。选择的病人不同，病期不同，T淋巴细胞激活增殖反应可有差异它受多种因素的影响。Meucer等〔9〕指出，SLE病人T淋巴细胞对CD2介导的增殖反应在缺乏IL1和吸附细胞时，则发生缺陷。我们对4例活动期SLE病人的T细胞，在加入(EBV-B)辅助细胞和抗CD2、抗CD3激活后，观察到T细胞的增殖反应在CD3介导时基本上是完整的，而对CD2介导的增殖反应则明显低于正常人。这表明T淋巴细胞的增殖反应并不受辅助细胞(如单核细胞的影响，即CD2介导的T淋巴细胞增殖反应并不依赖辅助细胞，而是T淋巴细胞内在的缺陷。CD2介导的增殖反应是可溶性的抗CD2与细胞表面CD2分子结合后，使选择性蛋白磷酸化激酶增高，细胞浆内Ca〔2+〕水平迅速增高，而导致增殖反应〔10，11〕。T淋巴细胞对CD2介导的增殖反应缺陷，一种可能的解释是：SLE病人中T淋巴细胞数目正常，而其表面分子CD2受体表达减少，或T淋巴细胞数目减少，从而CD2分子受体表达减少。这尚待进一步研究。Gerli等〔12〕对原发干燥综合征病人的PBMC在体外对CD2介导的增殖反应研究后指出：CD2介导的PBMC低反应，并非继发于转移膜上激活信号的变异，而是由于IL2和IL2受体mRNA表达减少。Fox等〔4〕发现SLE病人中PBMC在体外对CD2介导的低反应可以在加入醋酸肉豆寇后而得到纠正，所以对CD2介导的本质尚待进一步深入研究。
, 百拇医药
注：本工作完成于美国南加州大学医学院
参考文献
1 Huet S,Wakasugi H,Sterkers,G,et al:T cell activationvia CD2(T,gp50):the role of accessory cells in activating resting T cells via CD2。J Immunol,1986,137∶1420.
2 Huet S,Boumsell L,Dauset J,et al.The reqiredinteraction between monocytes and peripheral blood Tlymphocytes(T-PBL)upon activation via CDor CD3,Role of HLA class I molecules from accessory cells and the differential response of T-PBL subsets.Eur JImmunol,1988,18∶1187。
, 百拇医药
3 McCune WJ,Golbus J,Zeldes W,et al.Clinical andimmunologic effects of monthly anministration of intravenous cyclophosphamide in severe eystemic lupuserythematosus.N Engl J Med,1988,318∶1423
4 Fox DA,Millard JA,Treisman J,et al.Deffective CD2 pathway T cell activation in systemic lupus erythematosus.Atrhritis Rheum,1991,34∶561
5 Tan EM,Cohen AS,Fries JF,et al.The 1982 revisedcriteria for the classification of systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1982,25∶1271.
, 百拇医药
6 Urowitz MB,Gladman DD,Tozman E C S,et al.The lupus activity criteria count(LACC).J Rheumatol,1984,11∶783
7 Shiiba K,Stohi W,Gray D,et al.A novel role for acces-sory cells in Tcell-dependent B cell differentiation.Cell Immunol,1990,127∶458
8 Rudd CE,Anderson P,Morimoto,C,et al.Molecularinteractions,T-cell subsets and a role of the CD4/CD8：p56 complex in human T cell activation.Immunol Rev,1989,111∶225
, 百拇医药
9 Meuer SC,Hussey RE,Fabbi M,et al.An alternation pathway of T-cell activation.A functional role for the 50 kd T11sheep erythrocyte receptor protein.Cell,1984,36∶897
10 Brertmeyer JB,Daley JF,Levine HB,et al.The T11(CD2)molecule is functionally linked to the T3/Ti Tcell receptor in the majority of T cells.J Immunol,1987,139∶2899.
11 Imboden JB,Stobo JD.Transmembrane signalling by the T cellantign receptor.Pertubation of the T3-antigen receptor complex generates inositol phosphates and re-leases calcium ions from intracellular stores.J Exp Med,1985,161∶446
12 Gerli R,Bertotto A,Agea E,et al.Basic for derective proliferation peripheral blood T cells to anti-CD2 antibodies in primary sjogren's syndrome.J Clin Invest,1990,86∶1870
(收稿：1993-02-15 修回：1993-07-30), 百拇医药
单位：100730北京协和医院(唐福林)；美国南加州大学医学院(David A.Horwitz)
关键词：红斑狼疮，全身性；单核细胞；受体，抗原，T-细胞
中华医学杂志931108 摘要 对18例系统性红斑狼疮病人和正常人的外周单个核细胞(PBMC)，在体外经植物血凝素、抗CD2和抗CD3单克隆抗体刺激后，并以3H标记的胸腺嘧啶测定其增殖反应，结果发现，系统性红斑狼疮病人PBMC对抗CD2的增殖反应(9257±8543cpm)明显低於正常人(20619±15279cpm),这种低反应尤在8例未经治疗的活动期病人更为突出。还对4例活动期病人的纯化T细胞进行了体外增殖反应观察，发现去除单核细胞后的T细胞在辅助细胞(EBV-B)和抗体CD2作用下，其增殖反应(72697±22876cpm)亦低于正常人(114575±43110cpm)(P＝0.05)。两组相比，PBMC和T细胞对抗CD3的反应差异无显著意义。结果说明，系统性红斑狼疮病人的T细胞对抗CD2的低反应并不受单核细胞的影响，而可能是其内在的缺陷。
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系统性红斑狼疮(SLE)是一种伴有多种自身抗体，临床上以多系统受累的自身免疫性疾病。随着对T淋巴细胞亚型研究的日趋深入，业已发现，CD3受体是T淋巴细胞表面抗原占优势的受体；CD2受体是成熟T淋巴细胞和胸腺细胞的激活信号，在胸腺细胞分化中有重要作用〔1，2〕。用环磷酰胺静脉冲击治疗的SLE病人，其T淋巴细胞在体外对抗CD2抗体的增殖反应下降〔3〕。Fox等〔4〕发现，抗CD2抗体介导的外周血单个核细胞(PBMC)在体外增殖反应下降同疾病的活动性无关。由于CD2在T淋巴细胞对抗原刺激的激活中有复合刺激的功能，故研究CD2受体，对了解依赖T细胞的B细胞调节异常有着重要意义。
对象和方法
一、病例选择
, 百拇医药
18例SLE病人，全部符合1982年美国风湿病学会修订的分类标准〔5〕。其中男2例，女16例。年龄20～56岁，平均年龄34岁。8例活动期〔6〕病人采血前一周均未使用肾上腺皮质激素及环磷酰胺等免疫抑制剂。10例缓解期病人采血前皮质激素用量均在20mg/日以下。18名正常人的年龄、性别、种族均与病人相匹配。
二、细胞制备〔7〕
1.PBMC制备：采用聚葡糖泛影葡胺密度梯度离心分离法。
2.T细胞纯化：分离出的PBMC经尼龙柱吸附后，悬浮非吸附细胞，再经绵羊红细胞E玫瑰花结分离出E(+)细胞。E(+)细胞进一步与抗人类白细胞抗原-DR(L243，IgG2a)，抗CD16(3G8，IgG1)，抗CD11b(OKM1，IgG2b)结合，再与抗鼠Ig的磁化珠作用后，负选择得到T细胞，经细胞流式仪测定，T细胞纯度>98%。
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3.B细胞纯化：分离后的PBMC经尼龙柱吸附后，悬浮吸附细胞，选用E(-)细胞，再与抗CD3(Ortho,Pharmactimlar.Raritan,NJ)抗CD11b和抗CD16结合，经抗鼠Ig的磁化珠负选择，分离出的B细胞经细胞流式仪测定纯度>98%。
4.EBV-B细胞：纯化的B细胞与B95-8细胞株，37C孵育1小时，经2%小牛血清培养液洗涤后在培养液中培养生长。
三、PBMC和T细胞的体外增殖反应
PBMC(1×105/孔)或T细胞(5×104/孔)在96孔平底培养板，分别与不同的刺激剂：PHA(1μg/ml，英国贝克曼公司出品)，抗CD2(GT21∶50，Bethesda,MD)，抗CD3(454，100ng/ml)孵育96小时后，加入18.5kBq(1kBq＝0.027μCi)3H标记的胸腺嘧啶(ICN，Irivine,CA;111GBq/mol,SP active)18小时后，收集细胞，液闪计数。对于T细胞的增殖反应，除加入不同刺激剂外，可加入辅助细胞(EBV-B2×104/孔)。
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结 果
一、正常人和SLE病人的PBMC体外增殖反应(表1)
表1 正常人和SLE病人PBMC体外增殖反应(cpm,
±S) 组别n
PHA
抗CD2
抗CD2
正常人
18
82403±58470
, 百拇医药
20619±15279
25893±23866
SLE
18
59882±48490
9257±8543
21371±20306
P值
0.139
0.005
0.444
18例正常人和18例SLE病人，PBMC对PHA和抗CD3的增殖反应，差异均无显著意义，而对抗CD2介导的增殖反应，SLE病人明显低于正常人(P＝0.005)。
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二、正常人和活动期SLE病人的PBMC体外增殖反应(表2)
表2 正常人和活动期SLE病人PBMC体外增殖反应(cpm,
±S) 组别n
PHA
抗CD2
抗CD2
正常人
8
83848±54244
24389±15615
, 百拇医药
32431±28624
SLE
8
73301±58846
10246±9752
27007±21830
P值
0.597
0.016
0.595
抗CD2介导的增殖反应在活动期SLE病人中明显低于正常人(P＝0.016)。而由PHA和抗CD3，诱导的增殖反应在活动期SLE病人和正常人中差异无显著意义。
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三、正常人和非活动期SLE病人的PBMC在体外的增殖反应(表3)
表3 正常人和非活动期SLE病人PBMC体外增殖反应(cpm,
±S) 组别n
PHA
抗CD2
抗CD2
正常人
10
80596±62177
19144±15567
, 百拇医药
17721±13875
SLE
10
43108±26062
9735±7640
14327±16928
P值
0.136
0.219
0.527
尽管非活动期SLE病人的PBMC对PHA、抗CD2和抗CD3增殖反应均低于正常人，但差异无显著意义(表3)。
, 百拇医药
四、纯化T细胞在体外增殖反应(表4)
表4 正常人和活动期SLE病人T细胞体外增殖反应(cpm,
±S) 组别n
抗CD2
抗CD2
正常人
4
114575±43110
28340±12267
SLE
, 百拇医药
4
72697±22876
16679±7664
P值
0.05
0.241
为了解T细胞增殖反应的缺陷，是否受其他辅助细胞的影响，在分离后的PBMC中清除NK细胞、单核细胞和B细胞，而在加入EBV-B辅助细胞作用下，观察纯化的T细胞增殖反应。从表4中可见T细胞在CD2介导的增殖反应中，SLE病人低于正常人(P=0.05)，而对抗CD3和PHA刺激的增殖反应，二者之间差异无显著意义，这表明T细胞的增殖反应缺陷并不受辅助细胞的影响。
讨 论
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SLE是以对自身抗原耐受禁锢的破坏和T细胞数量、功能异常，B细胞过度反应为特征的自身免疫性疾病〔1，2〕。其发病机制至今仍不清楚。随着细胞免疫学和分子免疫学的发展，已知T淋巴细胞表面受体和表面抗原在其激活、增殖中起重要作用。T淋巴细胞可被Ti/CD3复合物或CD2分子所激活〔8〕。CD2调节不依赖抗原激活的通道反应〔9〕，经由CD2传递的激活信号是特异性抗原道反应中的组成部分〔10〕。SLE病人中，T淋巴细胞有多种表面抗原的异常〔3～6〕。本研究发现，虽然SLE病人经由PHA、抗CD3的增殖反应比正常人低，但无统计学意义，而对抗CD2介导的增殖反应则有明显的缺陷，而且在活动期SLE病人中更为突出。Fox等〔4〕近来的研究发现，SLE病人中PBMC在体外对CD2介导的低反应同疾病的活动性及药物应用，如免疫抑制剂无关，并发现少数SLE病人，尤其缓解期的病人，对CD2介导的增殖反应可高天正常人，这表明SLE病人T淋巴细胞表面受体的激活十分个体化，即存在异质性。选择的病人不同，病期不同，T淋巴细胞激活增殖反应可有差异它受多种因素的影响。Meucer等〔9〕指出，SLE病人T淋巴细胞对CD2介导的增殖反应在缺乏IL1和吸附细胞时，则发生缺陷。我们对4例活动期SLE病人的T细胞，在加入(EBV-B)辅助细胞和抗CD2、抗CD3激活后，观察到T细胞的增殖反应在CD3介导时基本上是完整的，而对CD2介导的增殖反应则明显低于正常人。这表明T淋巴细胞的增殖反应并不受辅助细胞(如单核细胞的影响，即CD2介导的T淋巴细胞增殖反应并不依赖辅助细胞，而是T淋巴细胞内在的缺陷。CD2介导的增殖反应是可溶性的抗CD2与细胞表面CD2分子结合后，使选择性蛋白磷酸化激酶增高，细胞浆内Ca〔2+〕水平迅速增高，而导致增殖反应〔10，11〕。T淋巴细胞对CD2介导的增殖反应缺陷，一种可能的解释是：SLE病人中T淋巴细胞数目正常，而其表面分子CD2受体表达减少，或T淋巴细胞数目减少，从而CD2分子受体表达减少。这尚待进一步研究。Gerli等〔12〕对原发干燥综合征病人的PBMC在体外对CD2介导的增殖反应研究后指出：CD2介导的PBMC低反应，并非继发于转移膜上激活信号的变异，而是由于IL2和IL2受体mRNA表达减少。Fox等〔4〕发现SLE病人中PBMC在体外对CD2介导的低反应可以在加入醋酸肉豆寇后而得到纠正，所以对CD2介导的本质尚待进一步深入研究。
, 百拇医药
注：本工作完成于美国南加州大学医学院
参考文献
1 Huet S,Wakasugi H,Sterkers,G,et al:T cell activationvia CD2(T,gp50):the role of accessory cells in activating resting T cells via CD2。J Immunol,1986,137∶1420.
2 Huet S,Boumsell L,Dauset J,et al.The reqiredinteraction between monocytes and peripheral blood Tlymphocytes(T-PBL)upon activation via CDor CD3,Role of HLA class I molecules from accessory cells and the differential response of T-PBL subsets.Eur JImmunol,1988,18∶1187。
, 百拇医药
3 McCune WJ,Golbus J,Zeldes W,et al.Clinical andimmunologic effects of monthly anministration of intravenous cyclophosphamide in severe eystemic lupuserythematosus.N Engl J Med,1988,318∶1423
4 Fox DA,Millard JA,Treisman J,et al.Deffective CD2 pathway T cell activation in systemic lupus erythematosus.Atrhritis Rheum,1991,34∶561
5 Tan EM,Cohen AS,Fries JF,et al.The 1982 revisedcriteria for the classification of systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1982,25∶1271.
, 百拇医药
6 Urowitz MB,Gladman DD,Tozman E C S,et al.The lupus activity criteria count(LACC).J Rheumatol,1984,11∶783
7 Shiiba K,Stohi W,Gray D,et al.A novel role for acces-sory cells in Tcell-dependent B cell differentiation.Cell Immunol,1990,127∶458
8 Rudd CE,Anderson P,Morimoto,C,et al.Molecularinteractions,T-cell subsets and a role of the CD4/CD8：p56 complex in human T cell activation.Immunol Rev,1989,111∶225
, 百拇医药
9 Meuer SC,Hussey RE,Fabbi M,et al.An alternation pathway of T-cell activation.A functional role for the 50 kd T11sheep erythrocyte receptor protein.Cell,1984,36∶897
10 Brertmeyer JB,Daley JF,Levine HB,et al.The T11(CD2)molecule is functionally linked to the T3/Ti Tcell receptor in the majority of T cells.J Immunol,1987,139∶2899.
11 Imboden JB,Stobo JD.Transmembrane signalling by the T cellantign receptor.Pertubation of the T3-antigen receptor complex generates inositol phosphates and re-leases calcium ions from intracellular stores.J Exp Med,1985,161∶446
12 Gerli R,Bertotto A,Agea E,et al.Basic for derective proliferation peripheral blood T cells to anti-CD2 antibodies in primary sjogren's syndrome.J Clin Invest,1990,86∶1870
(收稿：1993-02-15 修回：1993-07-30), 百拇医药