应用聚合酶链单链构象多态技术检测葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变
作者：许卫明 王 菁 华小云 陈路明 杜传书
单位：510089 中山医科大学医学遗传教研室
关键词：葡糖磷酸脱氢酶缺乏；基因；突变；聚合酶链反应
940111.htm 摘要 为了探索一种快速、灵敏及准确的检测红细胞葡荡糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因点突变方法，我们采用单链构象多态技术(SSCP)，对20例G6PD变异型基因外显子2进行分析。发现有4例息者双链DNA中有一条链出现泳动变位，明显慢于正常人及其他患者，用PCR直接测序表明在cDNA第95位核昔酸发生碱基置换(T→C)。结果说明SSCP技术检测点突变具有广泛的应用前景，比现行的点突变检测方法简便易行。作者还对PCR-SSCP的优点和所检测突变的特点进行了探讨。
葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是导致蚕豆病、药物性溶血、新生儿黄疸及慢性非球形细胞溶血性贫血的主要原因之一，该病是由于G6PD基因发生突变而引起，不同部位和性质的突变引起生化学上不同的突变类型，即变异型。杜传书川在中国人G6PD变异型中发现至少有6种以上的点突变，为了快速筛查点突变所在外显子，减少测序的盲目性，节省66PD变异型DNA测序时间，我们采用近年来发展起来单链构象多态(single-strand con-fonnation polymorphism，SSCP)新技术[2]，检测G6PD基因外显子2中的Ch6突变，并用PCR直接测序加以证实。
, http://www.100md.com
对象和方法
一、对象
研究对象均来自中山医科大学第一附属医院产科遗传咨询门诊，经我室鉴定为G6PD缺乏的男性患者，共20例，年龄21～37岁，原籍为广东省。
二、方法
1.G6PD变异型鉴定与DNA提取：取外周静脉血10ml，肝素抗凝，溶血后离心，沉淀的白细胞提取DNA，溶血液按WHO标准方法进行G6PD部分纯化，最后得到的酶液经透析后进行变异型鉴定，鉴定指标为：酶活性、电泳迁移率、脱氧葡糖-6-磷酸钠盐(2dG-6-P)利用率、脱氨基辅酶II(D一NADP)利用率、半乳糖-6-磷酸(Gal-6-P利用率、热稳定性及G6P米氏常数(KmG6P)。白细胞DNA提取参照文献[3]。
2.PCR扩增外显子2：引物设计为：PE2L-5＇TGTCACCCTGGTGTGAGA-3、PE2R--5＇GCCCTGCAATTAGTTGGAA-3＇。50pIPCR反应体系含0.2mmol/L的脱氧三磷酸腺督(dATP)，脱氧三磷酸鸟昔(dGTP)，脱氧三磷酸胞昔(dCTP)，脱氧三磷酸胸音(dTTP)，100pmol/L引物，0.5llg基因组DNA，2.5单位的TaqDNA聚合酶(Promega)，93C变性60秒，55℃复性60秒，72℃延伸60秒，35个循环(PerkinElmer一Cetus热循环仪)。
, 百拇医药
3.SSCP分析：PCR反应体系同上述，dNTP浓度减至70mol/L，反应体积减少至10，并加入32PdCTPIpCi(福瑞公司，比活度为3oo0Ci/mmol)。扩增后反应物加入8pl的变性染料(含95%甲酞胺，5mmol/LNaOH，0.l%澳酚蓝，0.l%二甲苯氰醇)，置95C加热5分钟，冰浴，取4pl加置含5%甘油的5%聚丙烯酞胺凝胶垂直电泳槽，电泳缓冲液为0.5xTBE，室温电泳12～16小时(10mA)，然后放射自显影，观察结果。
4.pCR直接测序：参照Chiu[5]所推荐的方法，用不对称PCR(AsymmetricPCR)扩增单链模板DNA，PCR产物加入50的7.5mol/L醋酸胺，150l1l无水乙醇沉淀DNA,双脱氧未端终止法测序。
结 果
一、G6PD基国外显子2的扩增与SSCP分析
, 百拇医药 用上述引物扩增外显子2，大小为303bp)，无非特异扩增带，表明扩增效果良好。图1为SSCP分析，显示电泳16小时后，20例G6PD变异型中有4例患者二条单链DNA有一条泳动比正常较明显减慢，这4例标本分别为7、9、13和20号，该4例患者变异型生化鉴定结果见附表。为了鉴别这4例患者G6PD基因外显子2确实存在点突变，我们取这4例患者和随机抽取另外4例SSCP泳动正常患者及正常人标本作外显子2DNAPCR直接测序。
二、PCR直接测序结果
图2显示其中4例患者外显子2序列及正常人外显子2序列比较图，4例SSCP显示泳动减慢的标本，PCR直接测序结果与正常人和已报道的基因组DNA序列比较，显示在cDNA的第95位核普酸由T突变为C,而作为对照的其余4例SSCP泳动正常的患者并未发现这个位点的突变，与SSCP结果相一致。
附表 4例G6PD缺乏症患者的G6PD变异型生化鉴定结果 病例序号
, 百拇医药
酶活性
(%)
电泳迁移率
(%)
G6P米氏常数
(µmol/L)
底物同类物利用率(%)
热稳定性
变异类型
2dG-6-P
d-NADP
Gal-6-P
, http://www.100md.com
7
0.6
98.6
45.3
6.6
64.0
3.6
87.5
Anant
9
0.0
94.1
48.7
, 百拇医药
7.0
63.8
2.8
81.5
Gaohe
13
0.2
99.6
50.2
5.0
60.9
2.6
39.4
, http://www.100md.com
Kaiping
20
0.0
101.9
53.1
7.0
62.4
4.4
51.2
Haad Yai-like
注:表内由左至右的正常值为:100;100±1.6;54±12;3.0±1.9;57.3±8.5;2.3±1.6;66.0~99.0
, 百拇医药
电泳条件：10mA，16小时，箭头所示7号、9号、13号和20号标本其中一条单链DNA游动减慢
图1 20例G6PD变异型SSCP电泳分析图
箭头所示外显子2第95位T突变为C
图2 正常人和4例患者DNA序列图
讨 论
C6PD缺乏症是由于G6PD基因突变所臻,其基因定位于X染色体长臂2区8带,由13个外显子和12个内含子组成,覆盖在X染色体上的长度约20kb,外显子的大小在38-685bp。由于红细胞中GPD含量甚微尤其当患者是G6PD缺乏时更是如此。因此，不能象血红蛋白那样去分析酶蛋白一级结构组成及突变，只能从DNA水平去进行逆向研究。1988年Hirono和Beutler[6]报道G6PD(A+)和(A-)分别是cDNA的A367→G和G202一A。至今，已报道40多种点突变和一种缺失型突变，杜传书等[1]报道用9对引物扩增全部外显子，然后套叠PCR法得到PCR产物，非对称PCR扩增单链DNA并直接测序，发现中国人G6PD基因突变共有6和类型，其中C6突变占15.4%。由于G6PD基因外显子多，逐个外显子测序，工作量大并带有盲目性，选择疑有突变的外显子测序显得尤其重要，采用PCR-SSCP技术来筛选带有突变的外显子不失为一种有用的研究方法。
, http://www.100md.com
PCR-SSCP技术能广泛应用到遗传病和肿瘤基因点突变的检测，它是一种快速、灵敏、和有效的新技术。其原理是：在不含变性剂的中性聚丙烯酞胺凝胶中，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更取决于DNA单链所形成的空间结构，它可自身折叠形成具有一定空间结构的立体构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差别，所形成的构象就会不同。PCR扩增产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，双链DNA被解开，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失，重复或单个碱基置换时就会出现泳动变位(mobility shift)，从而提示该片段有基因突变存在。
我们的结果证实了C6突变在中国人G6PD变异型是很常见。Chao等M报道8例中国人G6PD变异型外显子2第95位核昔酸A一6突变。我们测定的是其互补链同一位置上T突变为C,属同一种突变。本实验结果表明PCR-SSCP技术比现有的筛查点突变方法具有以下优点：(1)PCR一SSCP技术不仅可检测已知突变，还可检测未知突变所在的部位。(2)靶DNA在扩增的同时就已被标记上，PCR产物变性后无需处理就可直接电泳。(3)实验周期短，方法简便，准确性高，一次可筛查许多标本，在DNA测序前，如能采用此法预先筛选出需测序的靶DNA，可加快DNA测序工作，节省时间。这在鉴定已知或未知G6PD变异型基因突变中具有重要的意义。
, 百拇医药
目前认为点突变与生化鉴定指标改变并无一致关系，只有点突变发生在G6P和DADP结合部位或其附近时，其相应的酶动力学指标可能会有影响，现认为cDNA第605位核昔酸附近的区域可能是底物G6P的结合部位，第1089-1361之间的核苷酸序列可能是另一底物NADP结合部位，例如G6PDMediterranean的基因突变为C563→T导致G6P亲和力增加，G6PD Nashvile和Anahein的基因突变为G1178→A导致NADP的米氏常数增加。从本组这4例变异型生化鉴定指标看来，外显子2突变与酶动力学指标改变无关，原因是C6突变距上述两个部位较远，不影响G6P和NADP结合。酶动力学特征改变较明显有13号标本的热稳定性降低，9号标本的电泳迁移率明显减慢，这些提示突变可致酶结构不稳定，目前仍不清楚C6突变导致酶活性降低的机理，需进一步深入研究。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
, http://www.100md.com 1 杜传书。遗传性红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症。中山医科大学学报1992.13：l
2 Orita M, Iwahana H, Kanazawa H. et al. Detection ofpolymorphisms of human DNA by gelelctrophoresis assingle strand conformation polymorphisms. Genetics.1989.86 : 2776.
3 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T, et al eds. MolecularCloning: a laboratory manual. Znd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
4 Spinardi L, Mazars R, Theillet C. et al. Protocols for animproved detection of point mutations by SSCP. NucleicAcids Res, 1991 , 19 : 4009.
, 百拇医药
5 Chiu DTY, Zuo L, Chen E, et al. Two commonly occurring nuclcotide base substitutions in Chinese G6PD vari-ants. Biochem Biophy Res Cornm. 1991 .180 : 988.
6 Hirono A. Beutler E. Molecular cloning and nucleotidesequence of cDNA for human glucose6phosphatedehydrogenase variant Af). Proc Natl Acad Sci USA,1988.85 : 3951.
7 Chao L, Du CS. Louie E. et al. A to G substitution identi-fied in exon 2 of the G6PD gene among G6PD deficientChinese. Nucleic Acids Res. 1991 . 19 : 6056
(收稿：1992-11-07 修回：1993-08-10), 百拇医药
单位：510089 中山医科大学医学遗传教研室
关键词：葡糖磷酸脱氢酶缺乏；基因；突变；聚合酶链反应
940111.htm 摘要 为了探索一种快速、灵敏及准确的检测红细胞葡荡糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因点突变方法，我们采用单链构象多态技术(SSCP)，对20例G6PD变异型基因外显子2进行分析。发现有4例息者双链DNA中有一条链出现泳动变位，明显慢于正常人及其他患者，用PCR直接测序表明在cDNA第95位核昔酸发生碱基置换(T→C)。结果说明SSCP技术检测点突变具有广泛的应用前景，比现行的点突变检测方法简便易行。作者还对PCR-SSCP的优点和所检测突变的特点进行了探讨。
葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是导致蚕豆病、药物性溶血、新生儿黄疸及慢性非球形细胞溶血性贫血的主要原因之一，该病是由于G6PD基因发生突变而引起，不同部位和性质的突变引起生化学上不同的突变类型，即变异型。杜传书川在中国人G6PD变异型中发现至少有6种以上的点突变，为了快速筛查点突变所在外显子，减少测序的盲目性，节省66PD变异型DNA测序时间，我们采用近年来发展起来单链构象多态(single-strand con-fonnation polymorphism，SSCP)新技术[2]，检测G6PD基因外显子2中的Ch6突变，并用PCR直接测序加以证实。
, http://www.100md.com
对象和方法
一、对象
研究对象均来自中山医科大学第一附属医院产科遗传咨询门诊，经我室鉴定为G6PD缺乏的男性患者，共20例，年龄21～37岁，原籍为广东省。
二、方法
1.G6PD变异型鉴定与DNA提取：取外周静脉血10ml，肝素抗凝，溶血后离心，沉淀的白细胞提取DNA，溶血液按WHO标准方法进行G6PD部分纯化，最后得到的酶液经透析后进行变异型鉴定，鉴定指标为：酶活性、电泳迁移率、脱氧葡糖-6-磷酸钠盐(2dG-6-P)利用率、脱氨基辅酶II(D一NADP)利用率、半乳糖-6-磷酸(Gal-6-P利用率、热稳定性及G6P米氏常数(KmG6P)。白细胞DNA提取参照文献[3]。
2.PCR扩增外显子2：引物设计为：PE2L-5＇TGTCACCCTGGTGTGAGA-3、PE2R--5＇GCCCTGCAATTAGTTGGAA-3＇。50pIPCR反应体系含0.2mmol/L的脱氧三磷酸腺督(dATP)，脱氧三磷酸鸟昔(dGTP)，脱氧三磷酸胞昔(dCTP)，脱氧三磷酸胸音(dTTP)，100pmol/L引物，0.5llg基因组DNA，2.5单位的TaqDNA聚合酶(Promega)，93C变性60秒，55℃复性60秒，72℃延伸60秒，35个循环(PerkinElmer一Cetus热循环仪)。
, 百拇医药
3.SSCP分析：PCR反应体系同上述，dNTP浓度减至70mol/L，反应体积减少至10，并加入32PdCTPIpCi(福瑞公司，比活度为3oo0Ci/mmol)。扩增后反应物加入8pl的变性染料(含95%甲酞胺，5mmol/LNaOH，0.l%澳酚蓝，0.l%二甲苯氰醇)，置95C加热5分钟，冰浴，取4pl加置含5%甘油的5%聚丙烯酞胺凝胶垂直电泳槽，电泳缓冲液为0.5xTBE，室温电泳12～16小时(10mA)，然后放射自显影，观察结果。
4.pCR直接测序：参照Chiu[5]所推荐的方法，用不对称PCR(AsymmetricPCR)扩增单链模板DNA，PCR产物加入50的7.5mol/L醋酸胺，150l1l无水乙醇沉淀DNA,双脱氧未端终止法测序。
结 果
一、G6PD基国外显子2的扩增与SSCP分析
, 百拇医药 用上述引物扩增外显子2，大小为303bp)，无非特异扩增带，表明扩增效果良好。图1为SSCP分析，显示电泳16小时后，20例G6PD变异型中有4例患者二条单链DNA有一条泳动比正常较明显减慢，这4例标本分别为7、9、13和20号，该4例患者变异型生化鉴定结果见附表。为了鉴别这4例患者G6PD基因外显子2确实存在点突变，我们取这4例患者和随机抽取另外4例SSCP泳动正常患者及正常人标本作外显子2DNAPCR直接测序。
二、PCR直接测序结果
图2显示其中4例患者外显子2序列及正常人外显子2序列比较图，4例SSCP显示泳动减慢的标本，PCR直接测序结果与正常人和已报道的基因组DNA序列比较，显示在cDNA的第95位核普酸由T突变为C,而作为对照的其余4例SSCP泳动正常的患者并未发现这个位点的突变，与SSCP结果相一致。
附表 4例G6PD缺乏症患者的G6PD变异型生化鉴定结果 病例序号
, 百拇医药
酶活性
(%)
电泳迁移率
(%)
G6P米氏常数
(µmol/L)
底物同类物利用率(%)
热稳定性
变异类型
2dG-6-P
d-NADP
Gal-6-P
, http://www.100md.com
7
0.6
98.6
45.3
6.6
64.0
3.6
87.5
Anant
9
0.0
94.1
48.7
, 百拇医药
7.0
63.8
2.8
81.5
Gaohe
13
0.2
99.6
50.2
5.0
60.9
2.6
39.4
, http://www.100md.com
Kaiping
20
0.0
101.9
53.1
7.0
62.4
4.4
51.2
Haad Yai-like
注:表内由左至右的正常值为:100;100±1.6;54±12;3.0±1.9;57.3±8.5;2.3±1.6;66.0~99.0
, 百拇医药
电泳条件：10mA，16小时，箭头所示7号、9号、13号和20号标本其中一条单链DNA游动减慢
图1 20例G6PD变异型SSCP电泳分析图
箭头所示外显子2第95位T突变为C
图2 正常人和4例患者DNA序列图
讨 论
C6PD缺乏症是由于G6PD基因突变所臻,其基因定位于X染色体长臂2区8带,由13个外显子和12个内含子组成,覆盖在X染色体上的长度约20kb,外显子的大小在38-685bp。由于红细胞中GPD含量甚微尤其当患者是G6PD缺乏时更是如此。因此，不能象血红蛋白那样去分析酶蛋白一级结构组成及突变，只能从DNA水平去进行逆向研究。1988年Hirono和Beutler[6]报道G6PD(A+)和(A-)分别是cDNA的A367→G和G202一A。至今，已报道40多种点突变和一种缺失型突变，杜传书等[1]报道用9对引物扩增全部外显子，然后套叠PCR法得到PCR产物，非对称PCR扩增单链DNA并直接测序，发现中国人G6PD基因突变共有6和类型，其中C6突变占15.4%。由于G6PD基因外显子多，逐个外显子测序，工作量大并带有盲目性，选择疑有突变的外显子测序显得尤其重要，采用PCR-SSCP技术来筛选带有突变的外显子不失为一种有用的研究方法。
, http://www.100md.com
PCR-SSCP技术能广泛应用到遗传病和肿瘤基因点突变的检测，它是一种快速、灵敏、和有效的新技术。其原理是：在不含变性剂的中性聚丙烯酞胺凝胶中，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更取决于DNA单链所形成的空间结构，它可自身折叠形成具有一定空间结构的立体构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差别，所形成的构象就会不同。PCR扩增产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，双链DNA被解开，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失，重复或单个碱基置换时就会出现泳动变位(mobility shift)，从而提示该片段有基因突变存在。
我们的结果证实了C6突变在中国人G6PD变异型是很常见。Chao等M报道8例中国人G6PD变异型外显子2第95位核昔酸A一6突变。我们测定的是其互补链同一位置上T突变为C,属同一种突变。本实验结果表明PCR-SSCP技术比现有的筛查点突变方法具有以下优点：(1)PCR一SSCP技术不仅可检测已知突变，还可检测未知突变所在的部位。(2)靶DNA在扩增的同时就已被标记上，PCR产物变性后无需处理就可直接电泳。(3)实验周期短，方法简便，准确性高，一次可筛查许多标本，在DNA测序前，如能采用此法预先筛选出需测序的靶DNA，可加快DNA测序工作，节省时间。这在鉴定已知或未知G6PD变异型基因突变中具有重要的意义。
, 百拇医药
目前认为点突变与生化鉴定指标改变并无一致关系，只有点突变发生在G6P和DADP结合部位或其附近时，其相应的酶动力学指标可能会有影响，现认为cDNA第605位核昔酸附近的区域可能是底物G6P的结合部位，第1089-1361之间的核苷酸序列可能是另一底物NADP结合部位，例如G6PDMediterranean的基因突变为C563→T导致G6P亲和力增加，G6PD Nashvile和Anahein的基因突变为G1178→A导致NADP的米氏常数增加。从本组这4例变异型生化鉴定指标看来，外显子2突变与酶动力学指标改变无关，原因是C6突变距上述两个部位较远，不影响G6P和NADP结合。酶动力学特征改变较明显有13号标本的热稳定性降低，9号标本的电泳迁移率明显减慢，这些提示突变可致酶结构不稳定，目前仍不清楚C6突变导致酶活性降低的机理，需进一步深入研究。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
, http://www.100md.com 1 杜传书。遗传性红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症。中山医科大学学报1992.13：l
2 Orita M, Iwahana H, Kanazawa H. et al. Detection ofpolymorphisms of human DNA by gelelctrophoresis assingle strand conformation polymorphisms. Genetics.1989.86 : 2776.
3 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T, et al eds. MolecularCloning: a laboratory manual. Znd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
4 Spinardi L, Mazars R, Theillet C. et al. Protocols for animproved detection of point mutations by SSCP. NucleicAcids Res, 1991 , 19 : 4009.
, 百拇医药
5 Chiu DTY, Zuo L, Chen E, et al. Two commonly occurring nuclcotide base substitutions in Chinese G6PD vari-ants. Biochem Biophy Res Cornm. 1991 .180 : 988.
6 Hirono A. Beutler E. Molecular cloning and nucleotidesequence of cDNA for human glucose6phosphatedehydrogenase variant Af). Proc Natl Acad Sci USA,1988.85 : 3951.
7 Chao L, Du CS. Louie E. et al. A to G substitution identi-fied in exon 2 of the G6PD gene among G6PD deficientChinese. Nucleic Acids Res. 1991 . 19 : 6056
(收稿：1992-11-07 修回：1993-08-10), 百拇医药