乳腺癌病人不同染色体位点上杂合缺失的研究
作者：邓国仁 何洛文 林本耀 李吉友 孙素莲 徐光伟
单位：100034 北京市肿瘤研究所
关键词：乳腺肿瘤；染色体；聚合酶链反应；限制片段长短的多态现象
940110.htm 摘要 应用聚合酶链反应(pCR)技术，井配合限制片段长短的多态现象(RFLP)及CA重复顺序多态性分析，对15例乳腺癌病人3号染色体短臂3p24，7号染色体长臂7q31，16号染色体长臂16q24，3和17号染色体短臂17pl3.1杂合缺失(LOH)进行了测定。在上述位点分别发现36%、36%、2/4和5/9的信息个体呈现LOH。其中3p24和7q31位点的LOH大多发生在临床II、III期、淋巴转移阳性和雌激素受体阴性的肿瘤中。提示3p24和7q31位点LOH的测定有可能成为乳腺癌病人预后评价的指标。此外，上述四个位点所呈现的较高的LOH阳性率也提示乳腺癌抑癌基因在这些位点存在的可能性。
, http://www.100md.com
染色体上某一特定位点(包括基因或无意义的DNA片段)的碱基组成的差异造成了这一位点的多态性。如果同一细胞中某个位点的两个等位基因或DNA片段显示多态性，遗传学上就称之为这个位点的杂合体。对同一病人的正常组织和肿瘤组织DNA进行分析，如果正常组织显示杂合，而肿瘤组织中杂合的两个DNA的一个全部或部分缺失，就可根据这种杂合缺失(LOH)推测在这一位点存在基因或DNA片段的缺失[11，2]。我们用一种简易的方法，可对0.lgDNA进行分析。其基本原理是使用聚合酶链反应(PCR)对DNA在含多态性位点的区域进行扩增，扩增后的DNA片段的多态性可被限制性内切酶识别。比较正常及肿瘤的限制片段长短的多态现象(RFLP)就可测定出肿瘤的LOH。所以，将此方法称之为PCR-RFLP。
MelZer等在1991年使用这个方法首次对食道癌LOH作测定[3]。本组实验对15例乳腺癌在3号染色体短臂(3p)、7号染色体长臂(7q)和17号染色体短臂(17p)LOH进行了分析。最近，在人类基因组研究中发现基因组中经常出现双碱基CA的重复顺序，由于重复的数目不同而形成多态性。随着人类基因组研究的进展，这种CA重复顺序(即微小卫星结构)已越来越多地定位于不同染色体上。我们可利用这些结构进行LOH的测定。所以，本文还介绍了使用PCR后通过分析多态的CA重复顺序对LOH进行测定的方法，以及使用这个方法对以上15例乳腺癌在16号染色体长臂(16q)进行LOH测定的结果。
, 百拇医药
材料和方法
一、材料
从本所乳腺癌病人的癌组织及正常皮肤组织中，按shih等[4]的方法提取DNA。
二、方法
，1.PCK：将0.1vgDNA加人。25PCR反应液中(含10mmol/LTris-HCI缓冲液，pH8.3，50mmol/LKCI，1.5mmol/LMgCl)，0.l%白明胶，25pmol上游及下游引物，dATp，dTTP,dCTPdGTP各200pmol/L，以及TaqDNA聚合酶(PerkinelmercetusIU)。于94保温3分钟后，使反应物进行30个循环的变性(94C，30秒)，复性(60，64或71℃，30秒见表1，)和延伸反应(72C，30秒)。在最后一个循环后，试管仍置于72，继续反应10分钟。为了更精确地测定缺失的百分比，也可将上述PCR反应液中加人1Ci(α-32P)dCTP(3000x37GBq/mmol)，此时可将4种三磷酸脱氧核苷的浓度减至20µmol/L。
, 百拇医药
2.RFLP分析：取5PIPCR产物，用过曼的(20U)限制性内切酶(表1)酶解2小时，消化后的DNA片段在2%琼脂糖凝胶(大于150bp的片段)或6%聚内烯醚胺凝胶(小于150bp)的片段)中进行电泳分离。对非同位素标记DNA的LOH测定，可在澳化乙锭染色后进行；对同位素标记的DNA则需用x光片在凝胶上曝光1～2小时(-70℃)后再进行LOH的测定。
表1 LOH测定中使用的引物 名称
染色体位点
复性温度
(°C)
片段长度
(bp)
酶
, 百拇医药 MD-1
MD-4
3p24
64
210/123+87
Msp I
H-3
H-4
3p24
64
208/135+73
HindIII
GH390
, 百拇医药
GH391
7q31
64
291/160+131
Taq I
9L
9R
7q31
64
377/204+173
Msp I
6.26F
6.26R
, 百拇医药
16q24.3
71
113
5-1
5-2
17p13.1
60
196/100+96
BstU I
6-1
6-2
17p13.1
60
, 百拇医药
107/63+44
Msp I
8-1
8-2
17p13.1
60
90/45+45
BamH I
3.CA重复顺序多态性的测定：将同位素标记的PCR产物1加热变性后在含7mol/L尿素的6%聚丙烯醚胺凝胶中进行电冰分离，x光片曝光后可显示CA重复顺序的多态性。
三、分析方法
正常组织DNA进行PCR扩增，经限制性内切酶消化及电泳后，如形成两条区带，是由于样品中含有两个不同的等位基因片段，其中一个可被酶解，另一个则不能。这个标本可称为信息个体。如只呈现一个区带，这是由于它们在这一位点呈纯合状态。对信息个体癌组织DNA以同样的引物进行PCR-RFLP分析，比较同一病人正常及癌组织DNA电泳片段大小以及量的差异，就可推算出它是否存在LOH。为了提高信息个体的比例，我们在染色体的同一位点选择2～3组引物。
, 百拇医药
结果
本组引物所产生的信息个体比例均在30%～50%左右。
一、乳腺癌在染色体3p、7q和17p不同位点上的LOH。
图1、图2显示用PCR～RFLP对乳腺癌DNA进行LOH测定结果。15例病人的临床、病理及生化检测结果，以及在3p24，7q3l及17pl3.1位点LOH的实验结果见表2。在这15例乳腺癌中，在ll个信息个体中有4例呈现3p24位点的LOH；在ll个信息个体中有4例呈现7q3l位点的LOH；而在9个信息个体中有5例呈现17pl3.1位点的LOH。
表2 15例乳腺癌病人在不同染色体位点上的LOH 序号
年龄
(岁)
, http://www.100md.com
临床
分期
淋巴
转移
ER
PR
LOH
3p24
7q31
3p/7q
16q24.3
17p13.1
1
, 百拇医药
53
I
-
-
-
-
-
-
+
+
2
41
II
+
, 百拇医药
-
-
+
NI*
+
NI
NI
3
49
III
+
+
+
-
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-
-
-
+
4
42
II
-
-
-
NI
-
-
NI
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NI
5
59
II
-
+
+
-
-
-
+
-
6
56
, 百拇医药
II
+
-
-
+
+
+
NI
+
7
49
III
+
-
, 百拇医药
+
-
+
+
NI
-
8
49
II
-
-
+
NI
+
, 百拇医药
+
NI
-
9
48
II
+
+
+
-
NI
-
NI
-
, 百拇医药
10
37
I
-
-
-
NI
-
-
-
NI
11
37
II
, 百拇医药
+
+
+
NI
-
-
NI
+
12
58
I
-
+
+
, 百拇医药
-
NI
-
NI
+
13
70
II
-
+
+
+
+
+
, 百拇医药
NI
NI
14
40
II
-
+
+
-
-
-
NI
NI
15
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46
II
+
+
+
+
NI
+
NI
NI
*NI非信息个体表3 不同染色体位点的LOH与临床参数的关系(例数) 临床参数
LOH/信息个体
3p24
, http://www.100md.com
7q31
3p/7q
16q24.3
17p13.1
临床分期
I
0/2
0/2
0/3
1/2
2/2
II/III
4/9
, http://www.100md.com
4/9
6/12
1/2
3/7
淋巴转移
-
1/5
2/7
2/8
2/3
2/4
+
3/6
, 百拇医药
2/4
4/7
0/1
3/5
雌激素受体
+
2/7
1/5
2/8
1/2
3/5
-
2/4
, http://www.100md.com
3/6
4/7
1/2
2/4
孕激素受体
+
2/8
3/7
4/10
1/2
3/7
-
2/3
, 百拇医药
1/4
2/5
1/2
2/2
二、乳腺癌在染色体16q24.3位点的LOH
在4个信息个体中发现2例呈现LOH(表2)。图3显示了利用CA重复顺序多态性对乳腺癌进行LOH测定的结果。
三、乳腺癌不同染色体的LOH与临床、病理、生化检查结果的关系
按15例乳腺癌病人的临床分期，淋巴结转移情况及与术后病人预后有关的雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)的不同状况分组，统计不同组在3p24，7q31,16q24.3和17p13.1各位点的LOH(表3)，可以看出染色体在3p24及7q31的丢失与临床分期、淋巴结转移和ER存在相关关系。表3表明3p24和7q3l位点的LOH明显较多地发生在临床II，III期，淋巴结转移阳性及ER阴性的乳腺癌病人中，它们在以上各组的发生率分别占总发生率的6/6、4/6和4/6。
, 百拇医药
N:乳腺癌病人正常组织DNA,T:乳腺癌病人肿瘤组织DNA。1、2、3和4分别为1710、1878、1621和1901号样品
图1 乳腺癌病人在3P24位点的LOH测定
N:乳腺癌病人正常组织DNA,T:乳腺癌病人肿瘤组织DNA。1、2、3和4分别为975、1591、1675、和1750号样品
图2 乳腺癌病人在17P13.1位点的LOH测定
N:乳腺癌病人正常组织DNA,T:乳腺癌病人肿瘤组织DNA。1、2、3和4分别为975、1447、1591和1621号样品
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图3 乳腺癌病人在16q24、3位点的LOH测定
讨 论
本实验的结果显示3p24，7q31及17pl3.1位点LOH的阳性率分别为4/ll、4/ll和5/9。我们在其它染色体位点上(如lp，lq，2p，llp，1lq，18p，22q号染色体)没有发现如此高的LOH阳性率。上述位点LOH测定有可能成为乳腺癌早期诊断和预后的分子标志。本实验使用的PCR方法与常规分子生物学方法相比，有以下优点：(1)技术简单，快速。(2)DNA用量很小，有利于对早期、原位癌及癌前病变的研究。(3)由于PCR后扩增出的DNA片段长度只有100～400bp左右，对DNA的质量要求不高，石蜡包埋的标本也可检测。一张石蜡切片提出的DNA可以用来进行10次PCR反应(资料另文发表)。对石蜡包埋肿瘤组织的LOH测定是回顾研究，这将大大加快染色体缺失与乳腺癌病人预后关系的研究。
由表3可见看17nl3.1位点的LOH与淋巴转移及ER无关。但在临床1期的2例信息个体中，均可发现LOH。说明17nl3.1的LOH有可能发生在乳腺癌的早期。17pl3.1是抑癌基因p53存在的位点。p53基因的失活方式包括点突变和缺失。p53基因的失活方式究竟发生在肿瘤形成的哪一阶段现在尚无定论，所以如果在更多的l期(甚至原位癌及癌前病变)病例中能发现这一位点的丢失，就将对p53基因的作用机理研究起推动作用，而且还有可能找到乳腺癌早期诊断的一个分子标志。
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表3中16q24.3位点的研究例数较少，但仍显示淋巴转移阴性组中含有较高的LOH阳性率。这一趋势在另一组病例中(共57个信息个体)也得到了验证(资料另行发表)。这-关系现在还不能解释。由于16q现在是国际上继17q位点后另一个与乳腺癌遗传家族有关的研究热点，这一奇特的关系等人们对16q上与乳腺癌有关的基因认识得比较清楚才能得到解释。
本课题为国家“八五”课题资助项目
参考文献
l Sato T. Allelotype of breast cancer cumulative allellosses promote tumor progression in pnmary breast caicer. Cancer Res, 1990.50 : 7184.
2 Chen LC. Loss of heterozygosity on the short arm ofchrornosomel7 is associated with high proliferative capac-ity and DNA aneuploidy in primary buman breast cancer.Proc Natl Acad SciUSA. 1991 . 88 : 3847
, 百拇医药
3 Meltzer SJ. Reduction to homozygosity involving p53 inesophageal cancers demonstrated by the polymcrase chainreaction. Proc Natl Acad Sci USA. 1991.88 : 4976.
4 Shih C, Weinberg RA. lsolation of a transforming sequence from a hunian hladder carcinoma cell ]ine. Cell,1982. 29:61.
(收稿：1993-03-09 修回：1993-07-17), http://www.100md.com
单位：100034 北京市肿瘤研究所
关键词：乳腺肿瘤；染色体；聚合酶链反应；限制片段长短的多态现象
940110.htm 摘要 应用聚合酶链反应(pCR)技术，井配合限制片段长短的多态现象(RFLP)及CA重复顺序多态性分析，对15例乳腺癌病人3号染色体短臂3p24，7号染色体长臂7q31，16号染色体长臂16q24，3和17号染色体短臂17pl3.1杂合缺失(LOH)进行了测定。在上述位点分别发现36%、36%、2/4和5/9的信息个体呈现LOH。其中3p24和7q31位点的LOH大多发生在临床II、III期、淋巴转移阳性和雌激素受体阴性的肿瘤中。提示3p24和7q31位点LOH的测定有可能成为乳腺癌病人预后评价的指标。此外，上述四个位点所呈现的较高的LOH阳性率也提示乳腺癌抑癌基因在这些位点存在的可能性。
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染色体上某一特定位点(包括基因或无意义的DNA片段)的碱基组成的差异造成了这一位点的多态性。如果同一细胞中某个位点的两个等位基因或DNA片段显示多态性，遗传学上就称之为这个位点的杂合体。对同一病人的正常组织和肿瘤组织DNA进行分析，如果正常组织显示杂合，而肿瘤组织中杂合的两个DNA的一个全部或部分缺失，就可根据这种杂合缺失(LOH)推测在这一位点存在基因或DNA片段的缺失[11，2]。我们用一种简易的方法，可对0.lgDNA进行分析。其基本原理是使用聚合酶链反应(PCR)对DNA在含多态性位点的区域进行扩增，扩增后的DNA片段的多态性可被限制性内切酶识别。比较正常及肿瘤的限制片段长短的多态现象(RFLP)就可测定出肿瘤的LOH。所以，将此方法称之为PCR-RFLP。
MelZer等在1991年使用这个方法首次对食道癌LOH作测定[3]。本组实验对15例乳腺癌在3号染色体短臂(3p)、7号染色体长臂(7q)和17号染色体短臂(17p)LOH进行了分析。最近，在人类基因组研究中发现基因组中经常出现双碱基CA的重复顺序，由于重复的数目不同而形成多态性。随着人类基因组研究的进展，这种CA重复顺序(即微小卫星结构)已越来越多地定位于不同染色体上。我们可利用这些结构进行LOH的测定。所以，本文还介绍了使用PCR后通过分析多态的CA重复顺序对LOH进行测定的方法，以及使用这个方法对以上15例乳腺癌在16号染色体长臂(16q)进行LOH测定的结果。
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材料和方法
一、材料
从本所乳腺癌病人的癌组织及正常皮肤组织中，按shih等[4]的方法提取DNA。
二、方法
，1.PCK：将0.1vgDNA加人。25PCR反应液中(含10mmol/LTris-HCI缓冲液，pH8.3，50mmol/LKCI，1.5mmol/LMgCl)，0.l%白明胶，25pmol上游及下游引物，dATp，dTTP,dCTPdGTP各200pmol/L，以及TaqDNA聚合酶(PerkinelmercetusIU)。于94保温3分钟后，使反应物进行30个循环的变性(94C，30秒)，复性(60，64或71℃，30秒见表1，)和延伸反应(72C，30秒)。在最后一个循环后，试管仍置于72，继续反应10分钟。为了更精确地测定缺失的百分比，也可将上述PCR反应液中加人1Ci(α-32P)dCTP(3000x37GBq/mmol)，此时可将4种三磷酸脱氧核苷的浓度减至20µmol/L。
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2.RFLP分析：取5PIPCR产物，用过曼的(20U)限制性内切酶(表1)酶解2小时，消化后的DNA片段在2%琼脂糖凝胶(大于150bp的片段)或6%聚内烯醚胺凝胶(小于150bp)的片段)中进行电泳分离。对非同位素标记DNA的LOH测定，可在澳化乙锭染色后进行；对同位素标记的DNA则需用x光片在凝胶上曝光1～2小时(-70℃)后再进行LOH的测定。
表1 LOH测定中使用的引物 名称
染色体位点
复性温度
(°C)
片段长度
(bp)
酶
, 百拇医药 MD-1
MD-4
3p24
64
210/123+87
Msp I
H-3
H-4
3p24
64
208/135+73
HindIII
GH390
, 百拇医药
GH391
7q31
64
291/160+131
Taq I
9L
9R
7q31
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377/204+173
Msp I
6.26F
6.26R
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16q24.3
71
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17p13.1
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BstU I
6-1
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17p13.1
60
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107/63+44
Msp I
8-1
8-2
17p13.1
60
90/45+45
BamH I
3.CA重复顺序多态性的测定：将同位素标记的PCR产物1加热变性后在含7mol/L尿素的6%聚丙烯醚胺凝胶中进行电冰分离，x光片曝光后可显示CA重复顺序的多态性。
三、分析方法
正常组织DNA进行PCR扩增，经限制性内切酶消化及电泳后，如形成两条区带，是由于样品中含有两个不同的等位基因片段，其中一个可被酶解，另一个则不能。这个标本可称为信息个体。如只呈现一个区带，这是由于它们在这一位点呈纯合状态。对信息个体癌组织DNA以同样的引物进行PCR-RFLP分析，比较同一病人正常及癌组织DNA电泳片段大小以及量的差异，就可推算出它是否存在LOH。为了提高信息个体的比例，我们在染色体的同一位点选择2～3组引物。
, 百拇医药
结果
本组引物所产生的信息个体比例均在30%～50%左右。
一、乳腺癌在染色体3p、7q和17p不同位点上的LOH。
图1、图2显示用PCR～RFLP对乳腺癌DNA进行LOH测定结果。15例病人的临床、病理及生化检测结果，以及在3p24，7q3l及17pl3.1位点LOH的实验结果见表2。在这15例乳腺癌中，在ll个信息个体中有4例呈现3p24位点的LOH；在ll个信息个体中有4例呈现7q3l位点的LOH；而在9个信息个体中有5例呈现17pl3.1位点的LOH。
表2 15例乳腺癌病人在不同染色体位点上的LOH 序号
年龄
(岁)
, http://www.100md.com
临床
分期
淋巴
转移
ER
PR
LOH
3p24
7q31
3p/7q
16q24.3
17p13.1
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*NI非信息个体表3 不同染色体位点的LOH与临床参数的关系(例数) 临床参数
LOH/信息个体
3p24
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7q31
3p/7q
16q24.3
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临床分期
I
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2/7
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二、乳腺癌在染色体16q24.3位点的LOH
在4个信息个体中发现2例呈现LOH(表2)。图3显示了利用CA重复顺序多态性对乳腺癌进行LOH测定的结果。
三、乳腺癌不同染色体的LOH与临床、病理、生化检查结果的关系
按15例乳腺癌病人的临床分期，淋巴结转移情况及与术后病人预后有关的雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)的不同状况分组，统计不同组在3p24，7q31,16q24.3和17p13.1各位点的LOH(表3)，可以看出染色体在3p24及7q31的丢失与临床分期、淋巴结转移和ER存在相关关系。表3表明3p24和7q3l位点的LOH明显较多地发生在临床II，III期，淋巴结转移阳性及ER阴性的乳腺癌病人中，它们在以上各组的发生率分别占总发生率的6/6、4/6和4/6。
, 百拇医药
N:乳腺癌病人正常组织DNA,T:乳腺癌病人肿瘤组织DNA。1、2、3和4分别为1710、1878、1621和1901号样品
图1 乳腺癌病人在3P24位点的LOH测定
N:乳腺癌病人正常组织DNA,T:乳腺癌病人肿瘤组织DNA。1、2、3和4分别为975、1591、1675、和1750号样品
图2 乳腺癌病人在17P13.1位点的LOH测定
N:乳腺癌病人正常组织DNA,T:乳腺癌病人肿瘤组织DNA。1、2、3和4分别为975、1447、1591和1621号样品
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图3 乳腺癌病人在16q24、3位点的LOH测定
讨 论
本实验的结果显示3p24，7q31及17pl3.1位点LOH的阳性率分别为4/ll、4/ll和5/9。我们在其它染色体位点上(如lp，lq，2p，llp，1lq，18p，22q号染色体)没有发现如此高的LOH阳性率。上述位点LOH测定有可能成为乳腺癌早期诊断和预后的分子标志。本实验使用的PCR方法与常规分子生物学方法相比，有以下优点：(1)技术简单，快速。(2)DNA用量很小，有利于对早期、原位癌及癌前病变的研究。(3)由于PCR后扩增出的DNA片段长度只有100～400bp左右，对DNA的质量要求不高，石蜡包埋的标本也可检测。一张石蜡切片提出的DNA可以用来进行10次PCR反应(资料另文发表)。对石蜡包埋肿瘤组织的LOH测定是回顾研究，这将大大加快染色体缺失与乳腺癌病人预后关系的研究。
由表3可见看17nl3.1位点的LOH与淋巴转移及ER无关。但在临床1期的2例信息个体中，均可发现LOH。说明17nl3.1的LOH有可能发生在乳腺癌的早期。17pl3.1是抑癌基因p53存在的位点。p53基因的失活方式包括点突变和缺失。p53基因的失活方式究竟发生在肿瘤形成的哪一阶段现在尚无定论，所以如果在更多的l期(甚至原位癌及癌前病变)病例中能发现这一位点的丢失，就将对p53基因的作用机理研究起推动作用，而且还有可能找到乳腺癌早期诊断的一个分子标志。
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表3中16q24.3位点的研究例数较少，但仍显示淋巴转移阴性组中含有较高的LOH阳性率。这一趋势在另一组病例中(共57个信息个体)也得到了验证(资料另行发表)。这-关系现在还不能解释。由于16q现在是国际上继17q位点后另一个与乳腺癌遗传家族有关的研究热点，这一奇特的关系等人们对16q上与乳腺癌有关的基因认识得比较清楚才能得到解释。
本课题为国家“八五”课题资助项目
参考文献
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(收稿：1993-03-09 修回：1993-07-17), http://www.100md.com