外源基因在大鼠体内不同组织的表达
作者：朱小君 姚阿卿 刘勃 俞炜源 温进坤 李岱宗 周爱儒 汤健
单位：100083北京医科大学心血管基础研究所(朱小君，姚阿卿，李岱宗，周爱儒，汤健)，北京医科大学第一临床医学院心内科(刘勃)，河北医学院(温进坤)，军事医学科学院(俞炜源)
关键词：基因疗法；心血管疾病；实验，动物
中华医学杂志940310
摘要 将逆转录病毒载体(pN2-LacZ)或pN2-CMV-ProUK质粒，直接导入Wistar大鼠股四头肌、心肌或动脉管内壁，证明外源性基因可以在上述组织中表达出相应的蛋白质。外源基因在注射人股四头肌后7天表达水平最高，约可持续1～3个月以上。将带有外源基因的医用缝合线，缝合于肌肉组织中，亦可于肌肉组织中表达出相应的蛋白质，其表达效率远高于直接注射法。
, 百拇医药
目前，基因治疗的主要途径是将外源性基因导入培养的体细胞，再将这种基因修饰的细胞反输回机体内，从而达到治疗的目的[1]。已经证明，应用逆转录病毒载体转染培养的血管平滑肌细胞，可以成功地表达出相应的蛋白质，提出血管平滑肌细胞(VSMC)亦可以作为一种基因治疗的中介或靶细胞。但是，这种方法需要在体外培养大量的中介细胞，所需时间较长，花费较大。本工作将外源性基因直接导入体内，证明通过体内直接转基因的方法，外源性基因可以在体内相应的组织中得到表达。
材料与方法
一、质粒的提取和纯化
应用的质粒为带有标记基因LacZ或尿激酶原(ProUK)基因的逆转录病毒载体(pN2-LacZ)和pN2-CMV-ProUK。质粒的构建见文献[2]。质粒的提取与纯化依据Sambrook等[3]的方法进行，以大规模碱裂解法提取质粒，经氯化铯密度梯度离心，以Bio-Rad公司的Econo-POCTM10DG柱去除CsCl。依据260nm和280nm的光吸收和琼脂糖凝胶电脉进行质粒DNA的鉴定和定量测定。
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二、体内直接基因转移
选用雄性180～200克的正常Wistar大鼠，以0.6%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉。分别按Wolff等[4]的方法进行股四头肌和心肌内注射质粒DNA。DNA溶于含5%蔗糖的PBS溶液中，浓度为2μg/μl。每只大鼠股四头肌或心肌分两点注射，注射总量为80μgDNA。用同样方法、剂量注谢pN2质粒作为对照。
动脉壁内转移DNA参照Nabel等[5]方法进行，将30μgpN2-LacZ质粒DNA与90μg Lipofectin(BRL公司)混匀，室温下静置30分钟加入DMEM培养液至1ml，即为灌注液。将球囊导管经股动脉插入，拉伤腹主动脉及胸主动脉内皮细胞后，暂时阻断肾动脉下方至髂动脉分叉处血流，用生理盐水冲洗血管管腔3次，将灌注液注入至血管管腔充盈，保留20分钟后恢复血流。每只大鼠动脉管腔内约导入DNA20μg。动脉管腔内注入Lipofectin包囊pN2质粒作为对照。
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为提高肌肉内基因转移的效率，本实验应用4号医用缝合线(上海医用缝合线厂)，浸泡在2μg/μl的pN2-LacZ质粒溶液中，吹干后缝合于Wistar大鼠股四头股上，每厘米缝合线约含质粒DNA6μg。每只大鼠股四头号股约缝入缝合线5～10cm，约含质粒DNA30～60μg。以同样量的质粒DNA直接注射于股四头股作为对照。
三、基因表达产物的检测
LacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶活性应用美国Promega公司提供的药盒进行检测。同时取肌肉、心肌或动脉组织进行冰冻切片，用X-gal进行组织化学染色[6]。Pro-UK基因表达产物由军事医学科学院协助检测。
结 果
一、外源性基因在骨骼肌中的表达
分别取注射80μg pN2-LacZ质粒后 2、7、14、21天大鼠的股四头股提取蛋白质，测定β-半乳糖苷酶的活性，结果如图1所示。可以看出注射pN2-LacZ质粒后2天，LacZ基因即有明显表达，7天时达高峰，每克组织的表达量可达2.48×10-4单位，且可维持3周以上。单纯注射pN2质粒，则不能检测到β-半乳糖苷酶活性。组织化学染色显示，注射点附近的骨骼肌细胞呈现蓝色，对照组则未见蓝染(图5)。
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图1 注射pN2-LacZ后外源基因在股四头肌的表达
股四头肌注射pN2-CMV-ProUK质粒80μg，注射后2天、7天、1月、2月、3月后处死大鼠，测定肌肉组织中尿激酶原的含量(图2)。由图可以看出，注射后2天就有Pro-UK的高表达，7天后表达量最高，可达550ng/g组织，并可持续3个月以上。
二、外源性基因在心肌组织中的表达
给大鼠心肌内注射80μg pN2-LacZ质粒DNA，在注射后10天和30天，处死大鼠，测定心肌组织中的β-半乳糖苷酶含量，并与股四头肌内注射同样剂量的pN2-LacZ进行比较(图3)。由图可以看出，心肌内注射pN2-LacZ后10天和30天都有β-半乳糖苷酶的表达，其表达量约较股四头肌内注射高15～20倍。结照组无β-半乳糖苷酶表达。组织化学染色显示，在心肌注射局部的心肌细胞被蓝染(图5)。
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图2 注射pN2-CMV-ProUK后外源基因在股四头肌中的表达
1.心肌注射pN2-LacZ质粒；2.心肌注射5%蔗糖PBS溶液；3.股四头肌注射pN2-LacZ质粒；4.股四头肌注射5%蔗糖PBS溶液
图3 直接心肌或股四头股注射pN2-LacZ后β-galactosidase的表达
三、外源性基因在血管壁内的表达
应用动脉导管向大鼠腹主动脉内注入Lipofectin包囊的pN2-LacZ质粒20μg，4天后处死大鼠，测定动脉壁内β-半乳糖苷酶的表达，表达量为1.5×10-3U/g组织。组织化学染色显示，在动脉壁部分平滑肌细胞中呈现蓝色。对照组则无β-半乳糖苷酶的表达。
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四、一种新的体内转基因的方法(图5)
将含有pN2-LacZ质粒的缝合线缝于大鼠股四头肌内，基DNA含量为60μg，并与股四头肌直接注射60μg pN2-LacZ质粒DNA进行比较。结果发现缝线组的表达量可达3.1×10-3U/g组织，直接注射组仅有1.8×10-4U/g组织，前者β-半乳糖苷酶的活性约为后者的10倍以上。
1.直接注射法；2.缝线法；3.对照
图4 缝线法与直接注射法转移基因的比较
图5 组织化学染色结果(1)对照(骨骼肌)×25(2)股四头肌直接注射PN2-Lacz×50(3)心肌直接注射PN2-Lacz×50(4)对照(动脉)(5)动脉转染PN2-Lacz×50(6)缝线法股四头肌转移PN2-Lacz×50
, 百拇医药
讨 论
曾有报告，外源性基因可以在体外培养的心血管细胞中表达[2]。现又发现外源性基因可以直接导入心肌、骨骼肌和血管壁中并长期稳定地表达出相应的蛋白质，这为心血管疾病的基因治疗提供了重要的实验依据。鉴于许多心血管病都有基因结构和表达异常，我们设想，应用某些具有治疗意义的蛋白质基因如低密度脂蛋白受体(LDLR)基因、尿激酶原基因或抑制血管平滑肌细胞增殖的基因，可以治疗高脂血症、血栓形成和血管再狭窄等心血管疾病。
我们首次采用了一种新的体内直接基因转移的方法—缝线法。它不仅可以使外源基因在局部组织得到表达，而且可以依据组织的形状、大小，采用多层、蛇形或环状缝合，增加基因的表达范围和表达量，提高体内转基因的效率。
参考文献
1 Fredimann T. Progress toward human gene therapy, Science, 1989,244:1275.
, 百拇医药
2 姚阿卿，孙双丹，朱小君等，外源性基因在大鼠血管平滑肌细胞中的表达，中华医学杂志，1994，4。
3 Sambrook J, Fritch EF, Maniiatis T, Molecular Cloning. 2nd ed, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
4 Wolff JA, Wilhams P, Acsadi G, et al Conditions affecting direct gene transfer into rodent muscle in vivo. Biotechniques. 1991,11:474.
5 Nabel EG, Plautz G, Nabel GJ, Site-specific gene exeression in vivo by direct gene transfer into the arterial wall. Science, 1990, 249:1285.
6 Price J, Turner D, Cepko C. Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. PNAS, 1987,84:156., 百拇医药
单位：100083北京医科大学心血管基础研究所(朱小君，姚阿卿，李岱宗，周爱儒，汤健)，北京医科大学第一临床医学院心内科(刘勃)，河北医学院(温进坤)，军事医学科学院(俞炜源)
关键词：基因疗法；心血管疾病；实验，动物
中华医学杂志940310
摘要 将逆转录病毒载体(pN2-LacZ)或pN2-CMV-ProUK质粒，直接导入Wistar大鼠股四头肌、心肌或动脉管内壁，证明外源性基因可以在上述组织中表达出相应的蛋白质。外源基因在注射人股四头肌后7天表达水平最高，约可持续1～3个月以上。将带有外源基因的医用缝合线，缝合于肌肉组织中，亦可于肌肉组织中表达出相应的蛋白质，其表达效率远高于直接注射法。
, 百拇医药
目前，基因治疗的主要途径是将外源性基因导入培养的体细胞，再将这种基因修饰的细胞反输回机体内，从而达到治疗的目的[1]。已经证明，应用逆转录病毒载体转染培养的血管平滑肌细胞，可以成功地表达出相应的蛋白质，提出血管平滑肌细胞(VSMC)亦可以作为一种基因治疗的中介或靶细胞。但是，这种方法需要在体外培养大量的中介细胞，所需时间较长，花费较大。本工作将外源性基因直接导入体内，证明通过体内直接转基因的方法，外源性基因可以在体内相应的组织中得到表达。
材料与方法
一、质粒的提取和纯化
应用的质粒为带有标记基因LacZ或尿激酶原(ProUK)基因的逆转录病毒载体(pN2-LacZ)和pN2-CMV-ProUK。质粒的构建见文献[2]。质粒的提取与纯化依据Sambrook等[3]的方法进行，以大规模碱裂解法提取质粒，经氯化铯密度梯度离心，以Bio-Rad公司的Econo-POCTM10DG柱去除CsCl。依据260nm和280nm的光吸收和琼脂糖凝胶电脉进行质粒DNA的鉴定和定量测定。
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二、体内直接基因转移
选用雄性180～200克的正常Wistar大鼠，以0.6%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉。分别按Wolff等[4]的方法进行股四头肌和心肌内注射质粒DNA。DNA溶于含5%蔗糖的PBS溶液中，浓度为2μg/μl。每只大鼠股四头肌或心肌分两点注射，注射总量为80μgDNA。用同样方法、剂量注谢pN2质粒作为对照。
动脉壁内转移DNA参照Nabel等[5]方法进行，将30μgpN2-LacZ质粒DNA与90μg Lipofectin(BRL公司)混匀，室温下静置30分钟加入DMEM培养液至1ml，即为灌注液。将球囊导管经股动脉插入，拉伤腹主动脉及胸主动脉内皮细胞后，暂时阻断肾动脉下方至髂动脉分叉处血流，用生理盐水冲洗血管管腔3次，将灌注液注入至血管管腔充盈，保留20分钟后恢复血流。每只大鼠动脉管腔内约导入DNA20μg。动脉管腔内注入Lipofectin包囊pN2质粒作为对照。
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为提高肌肉内基因转移的效率，本实验应用4号医用缝合线(上海医用缝合线厂)，浸泡在2μg/μl的pN2-LacZ质粒溶液中，吹干后缝合于Wistar大鼠股四头股上，每厘米缝合线约含质粒DNA6μg。每只大鼠股四头号股约缝入缝合线5～10cm，约含质粒DNA30～60μg。以同样量的质粒DNA直接注射于股四头股作为对照。
三、基因表达产物的检测
LacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶活性应用美国Promega公司提供的药盒进行检测。同时取肌肉、心肌或动脉组织进行冰冻切片，用X-gal进行组织化学染色[6]。Pro-UK基因表达产物由军事医学科学院协助检测。
结 果
一、外源性基因在骨骼肌中的表达
分别取注射80μg pN2-LacZ质粒后 2、7、14、21天大鼠的股四头股提取蛋白质，测定β-半乳糖苷酶的活性，结果如图1所示。可以看出注射pN2-LacZ质粒后2天，LacZ基因即有明显表达，7天时达高峰，每克组织的表达量可达2.48×10-4单位，且可维持3周以上。单纯注射pN2质粒，则不能检测到β-半乳糖苷酶活性。组织化学染色显示，注射点附近的骨骼肌细胞呈现蓝色，对照组则未见蓝染(图5)。
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图1 注射pN2-LacZ后外源基因在股四头肌的表达
股四头肌注射pN2-CMV-ProUK质粒80μg，注射后2天、7天、1月、2月、3月后处死大鼠，测定肌肉组织中尿激酶原的含量(图2)。由图可以看出，注射后2天就有Pro-UK的高表达，7天后表达量最高，可达550ng/g组织，并可持续3个月以上。
二、外源性基因在心肌组织中的表达
给大鼠心肌内注射80μg pN2-LacZ质粒DNA，在注射后10天和30天，处死大鼠，测定心肌组织中的β-半乳糖苷酶含量，并与股四头肌内注射同样剂量的pN2-LacZ进行比较(图3)。由图可以看出，心肌内注射pN2-LacZ后10天和30天都有β-半乳糖苷酶的表达，其表达量约较股四头肌内注射高15～20倍。结照组无β-半乳糖苷酶表达。组织化学染色显示，在心肌注射局部的心肌细胞被蓝染(图5)。
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图2 注射pN2-CMV-ProUK后外源基因在股四头肌中的表达
1.心肌注射pN2-LacZ质粒；2.心肌注射5%蔗糖PBS溶液；3.股四头肌注射pN2-LacZ质粒；4.股四头肌注射5%蔗糖PBS溶液
图3 直接心肌或股四头股注射pN2-LacZ后β-galactosidase的表达
三、外源性基因在血管壁内的表达
应用动脉导管向大鼠腹主动脉内注入Lipofectin包囊的pN2-LacZ质粒20μg，4天后处死大鼠，测定动脉壁内β-半乳糖苷酶的表达，表达量为1.5×10-3U/g组织。组织化学染色显示，在动脉壁部分平滑肌细胞中呈现蓝色。对照组则无β-半乳糖苷酶的表达。
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四、一种新的体内转基因的方法(图5)
将含有pN2-LacZ质粒的缝合线缝于大鼠股四头肌内，基DNA含量为60μg，并与股四头肌直接注射60μg pN2-LacZ质粒DNA进行比较。结果发现缝线组的表达量可达3.1×10-3U/g组织，直接注射组仅有1.8×10-4U/g组织，前者β-半乳糖苷酶的活性约为后者的10倍以上。
1.直接注射法；2.缝线法；3.对照
图4 缝线法与直接注射法转移基因的比较
图5 组织化学染色结果(1)对照(骨骼肌)×25(2)股四头肌直接注射PN2-Lacz×50(3)心肌直接注射PN2-Lacz×50(4)对照(动脉)(5)动脉转染PN2-Lacz×50(6)缝线法股四头肌转移PN2-Lacz×50
, 百拇医药
讨 论
曾有报告，外源性基因可以在体外培养的心血管细胞中表达[2]。现又发现外源性基因可以直接导入心肌、骨骼肌和血管壁中并长期稳定地表达出相应的蛋白质，这为心血管疾病的基因治疗提供了重要的实验依据。鉴于许多心血管病都有基因结构和表达异常，我们设想，应用某些具有治疗意义的蛋白质基因如低密度脂蛋白受体(LDLR)基因、尿激酶原基因或抑制血管平滑肌细胞增殖的基因，可以治疗高脂血症、血栓形成和血管再狭窄等心血管疾病。
我们首次采用了一种新的体内直接基因转移的方法—缝线法。它不仅可以使外源基因在局部组织得到表达，而且可以依据组织的形状、大小，采用多层、蛇形或环状缝合，增加基因的表达范围和表达量，提高体内转基因的效率。
参考文献
1 Fredimann T. Progress toward human gene therapy, Science, 1989,244:1275.
, 百拇医药
2 姚阿卿，孙双丹，朱小君等，外源性基因在大鼠血管平滑肌细胞中的表达，中华医学杂志，1994，4。
3 Sambrook J, Fritch EF, Maniiatis T, Molecular Cloning. 2nd ed, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
4 Wolff JA, Wilhams P, Acsadi G, et al Conditions affecting direct gene transfer into rodent muscle in vivo. Biotechniques. 1991,11:474.
5 Nabel EG, Plautz G, Nabel GJ, Site-specific gene exeression in vivo by direct gene transfer into the arterial wall. Science, 1990, 249:1285.
6 Price J, Turner D, Cepko C. Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. PNAS, 1987,84:156., 百拇医药