重症烧伤大鼠白细胞粘附特性的变化
作者：武湘兵 赵克森 黄绪亮
单位：510515广州，第一军医大学病理生理教研室
关键词：灼伤；休克；白细胞粘连抑制试验
中华医学杂志940520.htm 摘要 用细胞液流室和显微录像技术观察重症烧伤大鼠白细胞在不同切应力下与鼠肺血管内皮细胞粘附特性的变化。发现重症烧伤后3小时，白细胞粘附子内皮细胞的数目明显增多，粘附曲线上移，而且，白细胞粘附率与动物存活时间明显相关。给予虎杖4号可明显降低白细胞粘附率，粘附特性曲线恢复正常，动物存活时间显著延长。本实验结果证明，重症烧伤后大鼠的白细胞粘附特性有明显增强，它是导致微循环紊乱和影响动物存活的重要因素之一。
近年来，白细胞与血管内皮细胞间的相互作用已受到越来越多的学者的重视。在活体观察中，我们曾证明早在烧伤休克代偿期，就已出现白细胞贴壁粘着于细静脉，其数量随着病程的发展逐渐增多。烧伤后白细胞附壁粘着可使毛细血管后阻力增大，促进毛细血管血流瘀滞，在烧伤性休克患者微循环紊乱的发生中起重要作用[1，2]。为了进一步探讨烧伤时白细胞贴壁粘着机理，我们建立了细胞液流室技术(cell flow chamber)，离体观察了大鼠重症烧伤后白细胞与内皮细胞之间粘附性质的变化、虎杖4号的作用以及白细胞粘附与动物存活时间的关系，现报告如下。
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材料及方法
一、重症烧伤模型的复制
24只雄性Wistar大鼠，体重190～260g，分为正常组、单纯烧伤组、烧伤+虎杖治疗组(n=8)。用13.3%乌拉坦-1%氯醛醣麻醉动物(0.6ml/100g腹腔注射)，一侧颈动脉插入PE50聚乙烯管，用以放血和给药。用80℃热水烫伤大鼠腰部以下肢体30秒钟(约占体表面积35%～45%)，复制重症烧伤模型[1]。烫伤后半小时虎杖组由动脉导管注入虎杖4号1mg/100g体重。
二、粒细胞悬液的制备
烫伤后3小时，取血3m1(肝素抗凝)，并注入等量生理盐水使动物存活。外周血以Ficoll液在800×g下，梯度离心20分钟，取红细胞表层的白细胞，加入5ml红细胞裂解液裂解2分钟后，300×g离心5分钟，去上清，以DMEM培养液洗2次，计数，并配制成2×l06/ml的粒细胞悬液。
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三、鼠肺血管内皮细胞的培养
无菌条件下放血至动物死亡，立即无菌取出鼠肺，Hank's液冲洗血迹，将鼠肺周边组织剪下，并剪成1mm×1mm×1mm的小块，用含20%小牛血清DMEM培养液培养子培养皿内，皿中放有载玻片， 5%CO2孵箱培养60小时，换液，再继续培养4天，载玻片上可覆满鹅卵石样的肺血管内皮细胞，用VIII因子抗体间接免疫荧光染色证明为血管内皮细胞[3]。
四、液流室制作
液流室按Hochmuth等设计加以改良[4]。它长9.7cm，宽5.5cm，高1.2cm，由上、下两层有机玻璃制成。下层中间含有长7.8cm、宽2.7cm、高0.2cm的槽，此槽可放置长满细胞的载玻片。上下两层间有一外长7.4cm、外宽2.7cm、内长6.0cm、内宽12cm的乳胶垫圈，使载玻片与上层有一空隙，形成液流通道。液流室两端及其两侧各有一通道，可由此注入液体，并可测出压力变化(图1)。
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液流通道高度h按下式计算：
(1)
其中L为液流通道长(垫圈内长)，η为流过的液体粘度，Q为每秒流量，W为液流通道宽(垫圈内宽)，ΔP为液流通道两端的压力差。
液流通道的壁切应力(Pa)τ按下式计算：
(2)
五、粒细胞粘附特性测定方法
将已长满鼠肺血管内皮细胞的载玻片放入液流室，放置垫圈，盖好上层并用螺丝钉旋紧，将分离的粒细胞悬液注入液流室，静置15分钟后计数。用灌流系统RDB-7B蠕动泵在不同的切应力下灌流1分钟，计数各种切应力灌流后所剩粘附的粒细胞数，计算粘附率。观察过程是将液流室放入Olympus倒置显微镜的观察室中进行的，该室保持恒温37℃，视野放大100倍，用MTV彩色摄像机、National监视器显像及JVC录像机灵像记录。
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1.有机玻璃 2.载玻片 3.接口 4.液流通道 5.入口 6.出口
图1 液流室结构示意图
结 果
一、液流室流变参数的测定
用两个电压力换能器和生理记录仪测定蠕动泵在不同刻度液流时液流室两端侧孔的压力即液流室内的压力差ΔP，并自液流室出口准确测流出量Q，所流过的液体粘度η由锥板式粘度计测定为0.010poise。根据公式(1)和(2)计算出h和τ值，结果如附表。
二、重症烧伤后粒细胞粘附特性的变化
在壁切应力0.196和0.341Pa时，正常动物粒细胞与内皮细胞粘附率分别为58.8±4.6%和46.5±4.3%，烧伤组粘附率上升至81.2±4.1%和63.4±5.1%，比正常组动物明显增多(P<0.05)。虎杖4号治疗后使粒细胞粘附恢复至正常(图2)。
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壁切应力(kPa)
图2 壁切应力对白细胞粘附内皮细胞的影响
图3示在不同切应力时粒细胞-内皮细胞的粘附特性曲线。可见烧伤组大鼠粒细胞粘附曲线上移。即使在高切应力1.47Pa时仍有30±6.5%的白细胞粘着于内皮细胞。而此时正常组和虎杖4号治疗组大鼠已减至19.5±3.2%和13.2±1.8%。
壁切应力(kPa)
图3 重症烧伤大鼠粒细胞-内皮细胞粘附特性曲线
单纯烧伤组动物平均存活6.2±6.8小时，8只动物中只有1只存活24小时，虎杖治疗组8只动物5只存活24小时以上，平均存活23.2±11.8小时，比单纯烧伤组明显延长(P<0.01)。有趣的是单纯烧伤组有1只鼠存活24小时，其粒细胞粘附率和粘附曲线均与正常组或虎杖治疗组接近。统计学处理表明，烧伤后粒细胞～内皮细胞粘附率的增高与动物存活时间呈负相关(r=0.66，P<0.01)。
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附表 细胞液流动力学参数
泵刻数
压力降(cmH2O)*
流量(ml/s)*
小室高度(cm)*
切应力(Pa)
0.2
0.57±0.09
0.0075±0.0004
0.024
0.103
0.4
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0.97±0.05
0.0189±0.0005
0.024
0.196
0.8
1.74±0.03
0.0327±0.0003
0.024
0.341
1.6
3.85±0.05
0.0687±0.0002
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0.024
0.716
2.0
4.59±0.04
0.0863±0.0005
0.024
0.899
2.8
6.38±0.02
0.1200±0.0003
0.024
1.250
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3.2
7.50±0.03
0.1410±0.0004
0.024
1.470
注：1cmH2O=0.098kPa n=5 *
±S讨 论
白细胞与血管内皮细胞的关系是目前人们十分关心的课题，两者之间的相互作用介导了许多生理、病理的变化。利用超高倍放大技术活体观察血管内皮细胞各种变化的方法已得到广泛运用[5、6]。液流室是国外近几年来才发展起来的一种新技术[4、7]。它的优点在于能使所研究的对象单一化，处置的条件如切应力、不同血细胞成分、各种体液因子等可人为加以控制，使研究深入到细胞和分子水平。我们自制的液流室参考Hochmuth等人设计的构图，稍加改进，将铝制的框架改为有机玻璃，易于取材和加工。本实验将此技术运用到烧伤休克的研究，观察重症烧伤时白细胞与内皮细胞的关系，排除了血液中各种体液因子、血压、血管的舒缩变化等因素的影响。从细胞流变学的角度分析，白细胞贴壁粘着受两种力的影响[1，5]，一为血液流动在管壁引起的切应力(shear stress)或切变率(shear rate)，它阻碍白细胞附壁；另一为白细胞和血管内皮之间的粘着力(adhesion force)，它促进白细胞贴壁。目前在整体研究中切变率可以通过测定流速和口径计算出来，而活体测定白细胞粘着力尚无成熟方法。我室曾报告，在烧伤早期血压无明显下降，血流速度和壁切变率无明显变化时，细静脉中已有多量白细胞贴壁粘着，估计有粘附力的增加[1、2]。本研究用细胞液流室技术证明，在同一切应力条件下，烧伤动物白细胞粘附率比正常明显增高，整个白细胞一内皮细胞粘附曲线上移，它说明烧伤后确有白细胞-内皮细胞间粘附力的增加。已知粘附蛋白在白细胞和内皮细胞表达增多是粘附力增加的重要原因，TNF、IL-1等体液因子又有促进粘附蛋白表达的作用，烧伤后是否有上述物质的作用，尚侍进一步证明。
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本实验还表明，重症烧伤后大鼠白细胞粘附性的高低直接关系到动物的存活时间，粘附性越低存活时间越长，粘附性越高存活时间越短。虎杖4号使烧伤动物白细胞粘附率明显降低，动物存活时间是单纯烧伤组的4倍，这进一步证明本室以前的结沦，即白细胞粘着嵌塞是导致重症体克患者微循环紊乱发生的重要因素，降低白细胞贴壁粘着对重症休克的防治有重要的意义[1，8]。
参 考 文 献
1.赵克森,吴坤莹,朱佐江,等.白细胞在休克微循环紊乱中的作用.中华医学杂志,1986,66:722.
2.赵克森,朱佐江,吴坤莹,等.微循环紊乱在烧伤休克发病中的意义.解放军医学杂志,1984,9:18.
3.陈思锋.一种可避免化学和机械损伤的简便的分离微血管内皮细胞的新方法.中国病理生理杂志,1992,8:556.
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4.Gallik S, Usami S, Jan KM, et al. Shear stress-induced detachment of human polymorphonuclear leukocytes from endothelial cell monlayers. Biorheology, 1989, 26 : 823.
5.赵克森,黄绪亮,吴坤莹,等.失血性休克时白细胞附壁粘着机理.微循环学杂志,1991,1:7.
6.朱佐江,赵克森,吴坤莹,等.虎杖4号对休克大鼠脉压差和微循环灌流量的影响.中华医学杂志,1989,69:279.
7.Lawrence MB, Smith CW, Eskin SG, et al. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood, 1990, 75 : 227.
8.Zhao KS, Zhu ZJ, Wu KY, et al. Effect of naloxone on microcirculatory behavior during irreversible hemorrhagic shock. Microvas Res, 1987, 9 : 18.
(收稿：1993-03-30 修回：1993-12-15)
本课题为国家自然科学基金资助项目, 百拇医药
单位：510515广州，第一军医大学病理生理教研室
关键词：灼伤；休克；白细胞粘连抑制试验
中华医学杂志940520.htm 摘要 用细胞液流室和显微录像技术观察重症烧伤大鼠白细胞在不同切应力下与鼠肺血管内皮细胞粘附特性的变化。发现重症烧伤后3小时，白细胞粘附子内皮细胞的数目明显增多，粘附曲线上移，而且，白细胞粘附率与动物存活时间明显相关。给予虎杖4号可明显降低白细胞粘附率，粘附特性曲线恢复正常，动物存活时间显著延长。本实验结果证明，重症烧伤后大鼠的白细胞粘附特性有明显增强，它是导致微循环紊乱和影响动物存活的重要因素之一。
近年来，白细胞与血管内皮细胞间的相互作用已受到越来越多的学者的重视。在活体观察中，我们曾证明早在烧伤休克代偿期，就已出现白细胞贴壁粘着于细静脉，其数量随着病程的发展逐渐增多。烧伤后白细胞附壁粘着可使毛细血管后阻力增大，促进毛细血管血流瘀滞，在烧伤性休克患者微循环紊乱的发生中起重要作用[1，2]。为了进一步探讨烧伤时白细胞贴壁粘着机理，我们建立了细胞液流室技术(cell flow chamber)，离体观察了大鼠重症烧伤后白细胞与内皮细胞之间粘附性质的变化、虎杖4号的作用以及白细胞粘附与动物存活时间的关系，现报告如下。
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材料及方法
一、重症烧伤模型的复制
24只雄性Wistar大鼠，体重190～260g，分为正常组、单纯烧伤组、烧伤+虎杖治疗组(n=8)。用13.3%乌拉坦-1%氯醛醣麻醉动物(0.6ml/100g腹腔注射)，一侧颈动脉插入PE50聚乙烯管，用以放血和给药。用80℃热水烫伤大鼠腰部以下肢体30秒钟(约占体表面积35%～45%)，复制重症烧伤模型[1]。烫伤后半小时虎杖组由动脉导管注入虎杖4号1mg/100g体重。
二、粒细胞悬液的制备
烫伤后3小时，取血3m1(肝素抗凝)，并注入等量生理盐水使动物存活。外周血以Ficoll液在800×g下，梯度离心20分钟，取红细胞表层的白细胞，加入5ml红细胞裂解液裂解2分钟后，300×g离心5分钟，去上清，以DMEM培养液洗2次，计数，并配制成2×l06/ml的粒细胞悬液。
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三、鼠肺血管内皮细胞的培养
无菌条件下放血至动物死亡，立即无菌取出鼠肺，Hank's液冲洗血迹，将鼠肺周边组织剪下，并剪成1mm×1mm×1mm的小块，用含20%小牛血清DMEM培养液培养子培养皿内，皿中放有载玻片， 5%CO2孵箱培养60小时，换液，再继续培养4天，载玻片上可覆满鹅卵石样的肺血管内皮细胞，用VIII因子抗体间接免疫荧光染色证明为血管内皮细胞[3]。
四、液流室制作
液流室按Hochmuth等设计加以改良[4]。它长9.7cm，宽5.5cm，高1.2cm，由上、下两层有机玻璃制成。下层中间含有长7.8cm、宽2.7cm、高0.2cm的槽，此槽可放置长满细胞的载玻片。上下两层间有一外长7.4cm、外宽2.7cm、内长6.0cm、内宽12cm的乳胶垫圈，使载玻片与上层有一空隙，形成液流通道。液流室两端及其两侧各有一通道，可由此注入液体，并可测出压力变化(图1)。
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液流通道高度h按下式计算：
(1)其中L为液流通道长(垫圈内长)，η为流过的液体粘度，Q为每秒流量，W为液流通道宽(垫圈内宽)，ΔP为液流通道两端的压力差。
液流通道的壁切应力(Pa)τ按下式计算：
(2)五、粒细胞粘附特性测定方法
将已长满鼠肺血管内皮细胞的载玻片放入液流室，放置垫圈，盖好上层并用螺丝钉旋紧，将分离的粒细胞悬液注入液流室，静置15分钟后计数。用灌流系统RDB-7B蠕动泵在不同的切应力下灌流1分钟，计数各种切应力灌流后所剩粘附的粒细胞数，计算粘附率。观察过程是将液流室放入Olympus倒置显微镜的观察室中进行的，该室保持恒温37℃，视野放大100倍，用MTV彩色摄像机、National监视器显像及JVC录像机灵像记录。
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1.有机玻璃 2.载玻片 3.接口 4.液流通道 5.入口 6.出口
图1 液流室结构示意图
结 果
一、液流室流变参数的测定
用两个电压力换能器和生理记录仪测定蠕动泵在不同刻度液流时液流室两端侧孔的压力即液流室内的压力差ΔP，并自液流室出口准确测流出量Q，所流过的液体粘度η由锥板式粘度计测定为0.010poise。根据公式(1)和(2)计算出h和τ值，结果如附表。
二、重症烧伤后粒细胞粘附特性的变化
在壁切应力0.196和0.341Pa时，正常动物粒细胞与内皮细胞粘附率分别为58.8±4.6%和46.5±4.3%，烧伤组粘附率上升至81.2±4.1%和63.4±5.1%，比正常组动物明显增多(P<0.05)。虎杖4号治疗后使粒细胞粘附恢复至正常(图2)。
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壁切应力(kPa)
图2 壁切应力对白细胞粘附内皮细胞的影响
图3示在不同切应力时粒细胞-内皮细胞的粘附特性曲线。可见烧伤组大鼠粒细胞粘附曲线上移。即使在高切应力1.47Pa时仍有30±6.5%的白细胞粘着于内皮细胞。而此时正常组和虎杖4号治疗组大鼠已减至19.5±3.2%和13.2±1.8%。
壁切应力(kPa)
图3 重症烧伤大鼠粒细胞-内皮细胞粘附特性曲线
单纯烧伤组动物平均存活6.2±6.8小时，8只动物中只有1只存活24小时，虎杖治疗组8只动物5只存活24小时以上，平均存活23.2±11.8小时，比单纯烧伤组明显延长(P<0.01)。有趣的是单纯烧伤组有1只鼠存活24小时，其粒细胞粘附率和粘附曲线均与正常组或虎杖治疗组接近。统计学处理表明，烧伤后粒细胞～内皮细胞粘附率的增高与动物存活时间呈负相关(r=0.66，P<0.01)。
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附表 细胞液流动力学参数
泵刻数
压力降(cmH2O)*
流量(ml/s)*
小室高度(cm)*
切应力(Pa)
0.2
0.57±0.09
0.0075±0.0004
0.024
0.103
0.4
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0.97±0.05
0.0189±0.0005
0.024
0.196
0.8
1.74±0.03
0.0327±0.0003
0.024
0.341
1.6
3.85±0.05
0.0687±0.0002
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0.024
0.716
2.0
4.59±0.04
0.0863±0.0005
0.024
0.899
2.8
6.38±0.02
0.1200±0.0003
0.024
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3.2
7.50±0.03
0.1410±0.0004
0.024
1.470
注：1cmH2O=0.098kPa n=5 *
±S讨 论白细胞与血管内皮细胞的关系是目前人们十分关心的课题，两者之间的相互作用介导了许多生理、病理的变化。利用超高倍放大技术活体观察血管内皮细胞各种变化的方法已得到广泛运用[5、6]。液流室是国外近几年来才发展起来的一种新技术[4、7]。它的优点在于能使所研究的对象单一化，处置的条件如切应力、不同血细胞成分、各种体液因子等可人为加以控制，使研究深入到细胞和分子水平。我们自制的液流室参考Hochmuth等人设计的构图，稍加改进，将铝制的框架改为有机玻璃，易于取材和加工。本实验将此技术运用到烧伤休克的研究，观察重症烧伤时白细胞与内皮细胞的关系，排除了血液中各种体液因子、血压、血管的舒缩变化等因素的影响。从细胞流变学的角度分析，白细胞贴壁粘着受两种力的影响[1，5]，一为血液流动在管壁引起的切应力(shear stress)或切变率(shear rate)，它阻碍白细胞附壁；另一为白细胞和血管内皮之间的粘着力(adhesion force)，它促进白细胞贴壁。目前在整体研究中切变率可以通过测定流速和口径计算出来，而活体测定白细胞粘着力尚无成熟方法。我室曾报告，在烧伤早期血压无明显下降，血流速度和壁切变率无明显变化时，细静脉中已有多量白细胞贴壁粘着，估计有粘附力的增加[1、2]。本研究用细胞液流室技术证明，在同一切应力条件下，烧伤动物白细胞粘附率比正常明显增高，整个白细胞一内皮细胞粘附曲线上移，它说明烧伤后确有白细胞-内皮细胞间粘附力的增加。已知粘附蛋白在白细胞和内皮细胞表达增多是粘附力增加的重要原因，TNF、IL-1等体液因子又有促进粘附蛋白表达的作用，烧伤后是否有上述物质的作用，尚侍进一步证明。
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参 考 文 献
1.赵克森,吴坤莹,朱佐江,等.白细胞在休克微循环紊乱中的作用.中华医学杂志,1986,66:722.
2.赵克森,朱佐江,吴坤莹,等.微循环紊乱在烧伤休克发病中的意义.解放军医学杂志,1984,9:18.
3.陈思锋.一种可避免化学和机械损伤的简便的分离微血管内皮细胞的新方法.中国病理生理杂志,1992,8:556.
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5.赵克森,黄绪亮,吴坤莹,等.失血性休克时白细胞附壁粘着机理.微循环学杂志,1991,1:7.
6.朱佐江,赵克森,吴坤莹,等.虎杖4号对休克大鼠脉压差和微循环灌流量的影响.中华医学杂志,1989,69:279.
7.Lawrence MB, Smith CW, Eskin SG, et al. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood, 1990, 75 : 227.
8.Zhao KS, Zhu ZJ, Wu KY, et al. Effect of naloxone on microcirculatory behavior during irreversible hemorrhagic shock. Microvas Res, 1987, 9 : 18.
(收稿：1993-03-30 修回：1993-12-15)
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