培养前后垂体细胞唾液酸含量对其免疫原性的影响
作者：史继新 刘承基 王伟芳
单位：210002南京军区总医院神经外科
关键词：垂体；细胞，培养的；抗原，免疫反应；唾液酸类
中华医学杂志940519.htm 摘要 已证实组织或细胞经过培养后抗原性减低，将培养组织或细胞移植到同种或异种受体均能成活。本研究从细胞表面糖链人手，通过测定BALB/C小鼠垂体细胞培养前后未端糖唾液酸含量，以及培养前后垂体细胞的免疫原性改变，观察细胞表面唾液酸含量对其免疫原性的影响。结果发现培养后的垂体细胞唾液酸含量显著高于未培养细胞；细胞唾液酸含量增高后，其刺激异基因大鼠脾细胞增殖的能力降低。用唾液酸酶去除培养细胞表面部分唾液酸后，可大大恢复其刺激异基因脾细胞增殖的能力。提示培养细胞唾液酸表达增加是导致其免疫原性降低的重要分子学基础。
1973年， Summerlin[1]用培养6周的人体皮肤移植治疗4例创口不愈的病人，术后3个月又取成活的移植皮肤移植到另一受者，移植物仍然成活。而取自同一供体未经培养的皮肤则在移植后2～4周被排斥。之后，许多作者相继证实，用经过培养的组织或细胞进行同种甚至异种移植，移植物均能成活[2-5]。为了探讨培养细胞免疫原性降低的原因以及寻找降低移植物免疫原性的方法，我们从易受环境因素影响的细胞表面糖链入手，观察培养垂体细胞末端糖唾液酸含量的变化，并利用混合淋巴细胞培养原理，在体外对垂体细胞培养前后的免疫原性进行研究，同时用唾液酸酶作为工具，检查垂体细胞表面唾液酸含量的改变对其免疫原性的影响。
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资料和方法
1.垂体细胞的培养：取BALB/C小鼠垂体(H-2d品系)，剪碎后置入0.15%胰蛋白酶溶液中消化(4℃，20小时)，分散细胞，接种于玻璃培养瓶或24孔培养板中，用含20%小牛血清的1640培养液或Eagle's基础培养基(MEM)/F12混合培养液，置37℃5%CO2孵箱中培养。
2.垂体细胞的纯化：细胞培养时，成纤维细胞呈优势生长，如不经纯化，3～4周后垂体细胞数量即显著减少。利用培养后成纤维细胞先贴壁及其对胰蛋白酶消化较上皮细胞敏感的原理对垂体细胞进行纯化，用电镜及免疫组化染色证实垂体细胞含量。
3.垂体细胞唾液酸含量测定：取培养7、14、21天的垂体细胞及未培养的垂体细胞，0.25%胰蛋白酶消化分散后，磷酸缓冲盐液(PBS)洗3次，用PBS调至107/ml细胞，取0.1ml用化学结合比色法测定细胞唾液酸含量，根据吸光值换算成μg/100万细胞。
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4.培养液内唾液酸含量对培养细胞唾液酸含量的影响：将培养液内分别加入800、600、400及200μg/ml唾液酸，于培养第7天测定各瓶培养液及培养细胞的唾液酸含量变化。
5.单向混合淋巴细胞培养：(1)制备反应细胞：用新鲜的BALB/C小鼠垂体细胞悬液(107/ml)1ml，多点注射于250g体重的SD大鼠背部皮下，第5及7天用0.5ml细胞悬液加强注射1次。首次免疫后第14天，取SD大鼠脾脏，在150目不锈钢滤网上研磨制成脾细胞悬液。用淋巴细胞分离液梯度分离淋巴细胞(2000r/min，20分钟)，PBS洗1次。1640培养液洗2次后，用含20%混合小牛血清的1640培养液调成1×107/ml细胞悬液。(2)制备刺激细胞：刺激细胞采用未培养的垂体细胞，培养7、14、21天的垂体细胞以及培养14天经唾液酸酶处理的垂体细胞。刺激细胞均经丝裂霉素C处理(50μg/m1，37℃30分钟)，用含20%混合小牛血清的培养液调细胞浓度为5×105/ml。另取培养14天并经丝裂霉素C处理的垂体细胞用含50mU/ml的唾液酸酶(CP)在37℃，5%CO2下消化20分钟，调细胞浓度为5×l05/ml。(3)培养：取96孔培养板，每孔加入0.1ml反应细胞与不同数量的刺激细胞，37℃、5%CO2，培养96小时后加入3H-TdR 1μCi/孔，继续培养16小时，收集细胞于49型玻璃纤维滤膜上，抽滤，20ml生理盐水洗脱，5%三氯醋酸固定，80℃烘烤30分钟，置入液体闪烁计数器计数。
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6.实验数据采用完全随机设计资料的方差分析，组间均数间的差异采用New-man-Keuls检验。
结 果
1.垂体细胞的生长与纯化：经低浓度胰蛋白酶冷消化的成年小鼠垂体细胞有较强的分裂增殖能力，未经纯化的细胞在24小时内开始贴壁，多于第3天进入对数生长期，7天左右即长满瓶底，需进行传代，但传至第3代(4周左右)垂体细胞含量已明显减少，电镜下仅约1/4为垂体细胞。经纯化的细胞则经3代培养(约30天左右)垂体细胞经免疫组化证实仍保持在70%左右。
2.垂体细胞唾液酸含量的变化：培养前与培养后7、14、21天的垂体细胞唾液酸含量比较，培养后的细胞唾液酸含量明显增高(P<0.01)，但增高程度与培养时间并不呈正相关(图1)，且其含量也不随培养液中唾液酸含量增加而增加。
3.垂体细胞培养前后免疫原性的改变：单向混合淋巴细胞反应结果(图2)，未经培养的BALB/C小鼠垂体细胞具有显著刺激异基因大鼠脾细胞增殖的能力；此种细胞经7天培养后，刺激能力即显著降低(P<0.01)。用唾液酸酶去除培养细胞表面部分唾液酸后，其刺激脾细胞增殖的能力又现提高，但仍低于未培养细胞(P<0.05)。
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图1 垂体细胞培养前后唾液酸含量变化(每组为5次结果的均值)
刺激细胞数(×10-5)
图2 单向混合淋巴细胞培养显示的垂体细胞培养前后免疫原性变化
讨 论
T细胞能否识别靶细胞有赖于两种细胞表面分子的结构与构型，虽然主要组织相容性复合体基因编码的细胞表面分子对T细胞的识别起重要作用，但已证实，细胞表面糖链分子对淋巴细胞之间的相互作用也起调节作用[6-8]。细胞表面糖链由1～10数个单糖或单糖衍生物组成，其末端常为带强负电荷的唾液酸，唾液酸具有重要的生物作用，尤其对细胞表面抗原决定簇的掩盖作用已日益受到重视。它可阻止受体被相应配基识别以及配基被相应受体识别，也可阻断抗原部位被免疫防御系统识别[7]。用唾液酸酶处理去除红细胞表面10%～20%的唾液酸，红细胞即迅速与肝、脾等单核巨噬细胞结合而被吞噬清除，重新唾液酸化则可阻止这种结合[7]。唾液酸在免疫识别中的生物掩盖作用也见于肿瘤的生长与播散[9，10]。
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经过培养的组织与细胞移植到不同基因受体后能够成活，提示其免疫原性降低。是何种原因使受体免疫系统不再能识别经过培养的组织与细胞？本研究首先从易受环境改变影响的糖链入手，测定培养细胞的末端糖唾液酸的含量变化。为避免培养后细胞成分改变失去可比性，先对垂体细胞进行纯化，至培养后30天，垂体细胞仍可达70%以上。电镜检查发现，培养后的垂体细胞表面突起明显增加，这无疑增加了细胞表面积，同时可能也随之增加了细胞表面可唾液酸化部位，在培养后7天唾液酸含量已显著高于未培养组，但此种增高并不随培养时间延长而呈线性增高，也不随培养液中唾液酸含量增加而增加。
本组采用单向体外混合淋巴细胞反应原理，将培养前后的垂体细胞刺激异基因大鼠脾细胞增殖的能力作为免疫原性指标。采用已经BALB/C小鼠垂体细胞免疫的SD大鼠脾细胞作为反应细胞，作为刺激细胞的垂体细胞经丝裂霉素C处理，使之失去增殖能力。结果提示，与未培养垂体细胞混合培养的大鼠脾细胞3H-TdR掺入量明显增加，说明未培养垂体细胞具有很强的刺激脾细胞转化能力，垂体细胞经7天培养后，其刺激脾细胞转化的能力即显著减弱，但并不随培养时间的延长而进一步减弱。这种改变与细胞唾液酸含量的变化基本一致。
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为了进一步证实培养垂体细胞唾液酸含量增加对其免疫原性降低的作用，用唾液酸酶对经培养14天的垂体细胞处理20分钟，其唾液酸水平降低约15%左右，处理后的垂体细胞刺激SD大鼠脾细胞转化的能力显著高于未用酶处理的细胞。因此有理由假定，经过培养的垂体细胞由于生长环境的变化，细胞表面糖链表达随之发生改变，尤其是能供唾液酸化的部位增加使唾液酸含量增加，细胞表面抗原决定簇被掩盖，因而明显失去了刺激异基因淋巴细胞增殖的能力。但由于其刺激SD大鼠脾细胞转化的能力仍低干未培养的垂体细胞，因此培养细胞免疫原性降低的原因除细胞表面唾液酸水平增高引起的生物掩盖作用外，是否还存在着细胞表面抗原表达改变尚需进一步研究。
参 考 文 献
1.Summerlin WT. Allogeneic transplantation of organ cultures of adult human skin. Clin Immunol Immunopathol, 1973, 1 : 372.
, 百拇医药
2.La Rosa FG. Abrogation of mouse pancreatic island allograft rejection by a four day culture. Transplantation, 1988, 46 : 330.
3.Kamo H, Kim SU, McGeer PL, et al. Transplantation of cultured human spinal cord cells into the rat motor cortes: use of Phaseolus vulgaris leucocoagglutinin as a cell marker. Neurosci Lett, 1987, 76 : 163.
4.许海东,,裘明德,刘玲,等.超低温保存的人胎垂体植入兔嗅球:超微结构和放免研究.兰州医学院学报,1990,16:2.
, 百拇医药 5.Lacy PE, Davie JM, Finke EH, et al. Prolongation of islet allograft survival. Transplantation, 1979, 27 : 171.
6.Powell LD, Whiteheart SW, Hart GW. Cell surface sialic acid influences tumor cell uecognition in the mixed lymphocyte reaction. J Immunol, 1987, 139 : 262.
7.Schauer R. Sialic acid and their role as biological masks. TIBS 1985, 10 : 357.
8.Pimlott NJ, Miller RG. The use of tunicamycin to study the role of cell surface olligosaccharides in lymphocyte recognition. J Immunol, 1986, 137 : 2455.
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9.Collard JG, Schijven JF, Bikker A, et al. Cell surface sialic acid and the invasive and metastatic potential of T-cell hybridomas. Cancer Research, 1986, 46 : 3521.
10. Passaniti A, Hart GW. Cell surface sialylation and tumor metastasis. Metastatic potential of B16 melanoma variants correlates with their relative numbers of specific penultimate digosaccharide structures. J Biol Chem, 1988, 263 : 7591.
(收稿：1993-10-13 修回：1994-01-29), 百拇医药
单位：210002南京军区总医院神经外科
关键词：垂体；细胞，培养的；抗原，免疫反应；唾液酸类
中华医学杂志940519.htm 摘要 已证实组织或细胞经过培养后抗原性减低，将培养组织或细胞移植到同种或异种受体均能成活。本研究从细胞表面糖链人手，通过测定BALB/C小鼠垂体细胞培养前后未端糖唾液酸含量，以及培养前后垂体细胞的免疫原性改变，观察细胞表面唾液酸含量对其免疫原性的影响。结果发现培养后的垂体细胞唾液酸含量显著高于未培养细胞；细胞唾液酸含量增高后，其刺激异基因大鼠脾细胞增殖的能力降低。用唾液酸酶去除培养细胞表面部分唾液酸后，可大大恢复其刺激异基因脾细胞增殖的能力。提示培养细胞唾液酸表达增加是导致其免疫原性降低的重要分子学基础。
1973年， Summerlin[1]用培养6周的人体皮肤移植治疗4例创口不愈的病人，术后3个月又取成活的移植皮肤移植到另一受者，移植物仍然成活。而取自同一供体未经培养的皮肤则在移植后2～4周被排斥。之后，许多作者相继证实，用经过培养的组织或细胞进行同种甚至异种移植，移植物均能成活[2-5]。为了探讨培养细胞免疫原性降低的原因以及寻找降低移植物免疫原性的方法，我们从易受环境因素影响的细胞表面糖链入手，观察培养垂体细胞末端糖唾液酸含量的变化，并利用混合淋巴细胞培养原理，在体外对垂体细胞培养前后的免疫原性进行研究，同时用唾液酸酶作为工具，检查垂体细胞表面唾液酸含量的改变对其免疫原性的影响。
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资料和方法
1.垂体细胞的培养：取BALB/C小鼠垂体(H-2d品系)，剪碎后置入0.15%胰蛋白酶溶液中消化(4℃，20小时)，分散细胞，接种于玻璃培养瓶或24孔培养板中，用含20%小牛血清的1640培养液或Eagle's基础培养基(MEM)/F12混合培养液，置37℃5%CO2孵箱中培养。
2.垂体细胞的纯化：细胞培养时，成纤维细胞呈优势生长，如不经纯化，3～4周后垂体细胞数量即显著减少。利用培养后成纤维细胞先贴壁及其对胰蛋白酶消化较上皮细胞敏感的原理对垂体细胞进行纯化，用电镜及免疫组化染色证实垂体细胞含量。
3.垂体细胞唾液酸含量测定：取培养7、14、21天的垂体细胞及未培养的垂体细胞，0.25%胰蛋白酶消化分散后，磷酸缓冲盐液(PBS)洗3次，用PBS调至107/ml细胞，取0.1ml用化学结合比色法测定细胞唾液酸含量，根据吸光值换算成μg/100万细胞。
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4.培养液内唾液酸含量对培养细胞唾液酸含量的影响：将培养液内分别加入800、600、400及200μg/ml唾液酸，于培养第7天测定各瓶培养液及培养细胞的唾液酸含量变化。
5.单向混合淋巴细胞培养：(1)制备反应细胞：用新鲜的BALB/C小鼠垂体细胞悬液(107/ml)1ml，多点注射于250g体重的SD大鼠背部皮下，第5及7天用0.5ml细胞悬液加强注射1次。首次免疫后第14天，取SD大鼠脾脏，在150目不锈钢滤网上研磨制成脾细胞悬液。用淋巴细胞分离液梯度分离淋巴细胞(2000r/min，20分钟)，PBS洗1次。1640培养液洗2次后，用含20%混合小牛血清的1640培养液调成1×107/ml细胞悬液。(2)制备刺激细胞：刺激细胞采用未培养的垂体细胞，培养7、14、21天的垂体细胞以及培养14天经唾液酸酶处理的垂体细胞。刺激细胞均经丝裂霉素C处理(50μg/m1，37℃30分钟)，用含20%混合小牛血清的培养液调细胞浓度为5×105/ml。另取培养14天并经丝裂霉素C处理的垂体细胞用含50mU/ml的唾液酸酶(CP)在37℃，5%CO2下消化20分钟，调细胞浓度为5×l05/ml。(3)培养：取96孔培养板，每孔加入0.1ml反应细胞与不同数量的刺激细胞，37℃、5%CO2，培养96小时后加入3H-TdR 1μCi/孔，继续培养16小时，收集细胞于49型玻璃纤维滤膜上，抽滤，20ml生理盐水洗脱，5%三氯醋酸固定，80℃烘烤30分钟，置入液体闪烁计数器计数。
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6.实验数据采用完全随机设计资料的方差分析，组间均数间的差异采用New-man-Keuls检验。
结 果
1.垂体细胞的生长与纯化：经低浓度胰蛋白酶冷消化的成年小鼠垂体细胞有较强的分裂增殖能力，未经纯化的细胞在24小时内开始贴壁，多于第3天进入对数生长期，7天左右即长满瓶底，需进行传代，但传至第3代(4周左右)垂体细胞含量已明显减少，电镜下仅约1/4为垂体细胞。经纯化的细胞则经3代培养(约30天左右)垂体细胞经免疫组化证实仍保持在70%左右。
2.垂体细胞唾液酸含量的变化：培养前与培养后7、14、21天的垂体细胞唾液酸含量比较，培养后的细胞唾液酸含量明显增高(P<0.01)，但增高程度与培养时间并不呈正相关(图1)，且其含量也不随培养液中唾液酸含量增加而增加。
3.垂体细胞培养前后免疫原性的改变：单向混合淋巴细胞反应结果(图2)，未经培养的BALB/C小鼠垂体细胞具有显著刺激异基因大鼠脾细胞增殖的能力；此种细胞经7天培养后，刺激能力即显著降低(P<0.01)。用唾液酸酶去除培养细胞表面部分唾液酸后，其刺激脾细胞增殖的能力又现提高，但仍低于未培养细胞(P<0.05)。
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图1 垂体细胞培养前后唾液酸含量变化(每组为5次结果的均值)
刺激细胞数(×10-5)
图2 单向混合淋巴细胞培养显示的垂体细胞培养前后免疫原性变化
讨 论
T细胞能否识别靶细胞有赖于两种细胞表面分子的结构与构型，虽然主要组织相容性复合体基因编码的细胞表面分子对T细胞的识别起重要作用，但已证实，细胞表面糖链分子对淋巴细胞之间的相互作用也起调节作用[6-8]。细胞表面糖链由1～10数个单糖或单糖衍生物组成，其末端常为带强负电荷的唾液酸，唾液酸具有重要的生物作用，尤其对细胞表面抗原决定簇的掩盖作用已日益受到重视。它可阻止受体被相应配基识别以及配基被相应受体识别，也可阻断抗原部位被免疫防御系统识别[7]。用唾液酸酶处理去除红细胞表面10%～20%的唾液酸，红细胞即迅速与肝、脾等单核巨噬细胞结合而被吞噬清除，重新唾液酸化则可阻止这种结合[7]。唾液酸在免疫识别中的生物掩盖作用也见于肿瘤的生长与播散[9，10]。
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经过培养的组织与细胞移植到不同基因受体后能够成活，提示其免疫原性降低。是何种原因使受体免疫系统不再能识别经过培养的组织与细胞？本研究首先从易受环境改变影响的糖链入手，测定培养细胞的末端糖唾液酸的含量变化。为避免培养后细胞成分改变失去可比性，先对垂体细胞进行纯化，至培养后30天，垂体细胞仍可达70%以上。电镜检查发现，培养后的垂体细胞表面突起明显增加，这无疑增加了细胞表面积，同时可能也随之增加了细胞表面可唾液酸化部位，在培养后7天唾液酸含量已显著高于未培养组，但此种增高并不随培养时间延长而呈线性增高，也不随培养液中唾液酸含量增加而增加。
本组采用单向体外混合淋巴细胞反应原理，将培养前后的垂体细胞刺激异基因大鼠脾细胞增殖的能力作为免疫原性指标。采用已经BALB/C小鼠垂体细胞免疫的SD大鼠脾细胞作为反应细胞，作为刺激细胞的垂体细胞经丝裂霉素C处理，使之失去增殖能力。结果提示，与未培养垂体细胞混合培养的大鼠脾细胞3H-TdR掺入量明显增加，说明未培养垂体细胞具有很强的刺激脾细胞转化能力，垂体细胞经7天培养后，其刺激脾细胞转化的能力即显著减弱，但并不随培养时间的延长而进一步减弱。这种改变与细胞唾液酸含量的变化基本一致。
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为了进一步证实培养垂体细胞唾液酸含量增加对其免疫原性降低的作用，用唾液酸酶对经培养14天的垂体细胞处理20分钟，其唾液酸水平降低约15%左右，处理后的垂体细胞刺激SD大鼠脾细胞转化的能力显著高于未用酶处理的细胞。因此有理由假定，经过培养的垂体细胞由于生长环境的变化，细胞表面糖链表达随之发生改变，尤其是能供唾液酸化的部位增加使唾液酸含量增加，细胞表面抗原决定簇被掩盖，因而明显失去了刺激异基因淋巴细胞增殖的能力。但由于其刺激SD大鼠脾细胞转化的能力仍低干未培养的垂体细胞，因此培养细胞免疫原性降低的原因除细胞表面唾液酸水平增高引起的生物掩盖作用外，是否还存在着细胞表面抗原表达改变尚需进一步研究。
参 考 文 献
1.Summerlin WT. Allogeneic transplantation of organ cultures of adult human skin. Clin Immunol Immunopathol, 1973, 1 : 372.
, 百拇医药
2.La Rosa FG. Abrogation of mouse pancreatic island allograft rejection by a four day culture. Transplantation, 1988, 46 : 330.
3.Kamo H, Kim SU, McGeer PL, et al. Transplantation of cultured human spinal cord cells into the rat motor cortes: use of Phaseolus vulgaris leucocoagglutinin as a cell marker. Neurosci Lett, 1987, 76 : 163.
4.许海东,,裘明德,刘玲,等.超低温保存的人胎垂体植入兔嗅球:超微结构和放免研究.兰州医学院学报,1990,16:2.
, 百拇医药 5.Lacy PE, Davie JM, Finke EH, et al. Prolongation of islet allograft survival. Transplantation, 1979, 27 : 171.
6.Powell LD, Whiteheart SW, Hart GW. Cell surface sialic acid influences tumor cell uecognition in the mixed lymphocyte reaction. J Immunol, 1987, 139 : 262.
7.Schauer R. Sialic acid and their role as biological masks. TIBS 1985, 10 : 357.
8.Pimlott NJ, Miller RG. The use of tunicamycin to study the role of cell surface olligosaccharides in lymphocyte recognition. J Immunol, 1986, 137 : 2455.
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9.Collard JG, Schijven JF, Bikker A, et al. Cell surface sialic acid and the invasive and metastatic potential of T-cell hybridomas. Cancer Research, 1986, 46 : 3521.
10. Passaniti A, Hart GW. Cell surface sialylation and tumor metastasis. Metastatic potential of B16 melanoma variants correlates with their relative numbers of specific penultimate digosaccharide structures. J Biol Chem, 1988, 263 : 7591.
(收稿：1993-10-13 修回：1994-01-29), 百拇医药