人胎肝低分子天然抑瘤物体外培养净化自体骨髓移植治疗急性白血病
作者：杨科 滕爱萍 裴雪涛 吴祖泽 王金才 席延荣 吴安玉 何学鹏 王立生 唐晓东 梅巍
单位：100700北京军区总医院血液科(杨科、滕爱萍、王金才、席延荣、何学鹏、唐晓东、梅巍)，放疗科(吴安玉)军事医学科学院放射医学研究所(裴雪涛、吴祖泽、王立生)
关键词：骨髓移植；白血病，急性
中华医学杂志940512.htm 摘要 对17例急性白血病患者在完全缓解期，采用低分子天然肿瘤抑制物体外培养净化后进行了自体骨髓移植，其中急性髓细胞白血病14例，急性淋巴细胞白血病3例，预处理以环磷酰胺和全身照射为主。移植后未接受抗白血病治疗，随访观察15至45个月，11例无病生存15个月以上，8例24个月以上，5例30个月以上，最长1例为43个月。5例在6～22个月复发，1例在6个月猝死。统计3.5年无病生存率为62.7%×15.0%.
, 百拇医药 骨髓移植已广泛用于治疗急性白血病，异基因骨髓移植(ALLO-BMT)由于供髓者的缺乏，使大多数病人不能进行。自体骨髓移植(ABMT)白血病的复发率较高[1]，因此，近年来许多学者为减少白血病的复发，正在探索净化残留在骨髓中的白血病细胞，然后行ABMT的方法。目前净化方法尚不成熟，近年来，吴祖泽等[2，3]的研究表明，人类胎肝中存在一种低分子量的天然肿瘤抑制物(LMW-NTS)，它能选择性地抑制肿瘤细胞的生长，当体外液体长期培养体系中加入LMW-NTS的浓度达到200-400mg/L时，可完全抑制小鼠和人的多种白血病细胞以及原代白血病祖细胞(AML-CFu)的生长，而对正常造血细胞的生长却影响很小。因此我们对23例急性白血病患者在完全缓解期，采用LMW-NTS体外培养净化后进行了ABMT，取得了较好效果，现将移植后随访1年以上的17例患者的情况报道如下。
对象与方法
一、临床资料
17例中男7例，女10例。年龄为9～35岁平均年龄27岁。包括急性非淋巴细胞白血病(ANLL)14例(含M11例、M24例、M33例、M44例、M52例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)3例(均为L1型)，均经临床、血象、骨髓象确诊。诊断标准均符合血液病诊断及疗效标准[4]。本组病例完全缓解后，均经过原方案或类似方案巩固治疗2个疗程以上，氨甲喋呤鞘内注射4次以上，大剂量阿糖胞苷(HD-Ara-C)强化治疗2～4次。ALL中有1例处于CR3，期，ANLL中有1例处于CR2期，余15例均处于CRl期进行的ABMT。缓解至移植的时间：2～29个月，中位数7个月。随访时间最短者15个月，最长者45个月，随访时间统计截止至1993年8月。
, 百拇医药
二、预处理方案
以环磷酰胺(CY)+全身照射(TBI)为主，CY用量2例为50mg/kg×2，15例为60mg /kg × 2。TBI采用8mev-X直线加速器于移植前1天下午和移植当天上午分两次照射，剂量有3例分别为6.5Gy、7.0Gy和7.5Gv，14例均为8.0Gy，剂量率为0.038～0.044Gv/min。此外有2例TBI为6.5Gy和7.5Gy患者分别加用Ara-C300mg和500mg。
三、骨髓采集与长期骨髓培养体外净化体系[5]
粒单祖细胞(CFU-GM)和AML-CFU培养法见文献[6]。本组病例培养4天者6例，培养5天者5例，培养9天者5例，培养10天者1例。
结 果
, 百拇医药
一、骨髓净化处理前后造血细胞的变化
17例患者骨髓经沉淀分离后所得有核细胞数平均为2.0±0.8×108/kg，CFU-GM为6.7±5.6× 104/kg经4～10天净化培养后，回输的有核细胞数平均为1.4±0.7×108/kg， CFU-GM为5.1±4.0 ×l04/kg，二者回收率分别为66±21%和91±60%。少数病例净化培养后有核细胞数和CFU-GM数较净化培养前有所增加，说明LMW一NTS对正常造血细胞的影响较小17例中有12例在净化处理前后进行AML-CFU检测，其中5例净化处理前AML-CFU为0.02～1.58/2×105MNC(单个核细胞)经净化处理4天后均达到检测不出的水平，其余患者净化处理前后均未检测出AML-CFU生长，表明这一净化体系有较好的净化效果。
, 百拇医药
二、移植后造血功能的恢复情况
移植后血象中红细胞和血红蛋白波动较小。白细胞在移植后5(1～8)天降至0～0.05×109/L，持续8(1～11)天，恢复至≥1.0×109/L的时间为22(14～50)天。血小板降至≤20×109/L的时间为9(5～16)天，持续9(2～24)天，升至≥40×109/L的时间为42(18～103)天。 17例骨髓象除1例患者在移植后第4天余16例息者均在移植后第7或第8天变为增生重度减低，有核细胞极少，骨髓呈空虚状态；一般在移植后21(11～50)天增生程度有所进步，移植后29(21～56)天恢复至增生活跃状态。骨髓CFU-GM培养在骨髓增生重度减低期均为0/2×l05MNC，在骨髓增生减低期或增生活跃期开始逐渐生长，移植后28天时为9.9(0～67.5/2×105MNC， 42天时为29(l.0～142.5)/2×105MNC，但大多数病例在移植后42天时还未恢复至移植前的水平。
, 百拇医药
三、治疗效果
本组17例患者移植后未进行抗白血病药物治疗，随访观察15～45个月，其中11例无病生存在15个月以上，8例在24个月以上，5例在30个月以上，最长的1例为43个月，病情均保持稳定，血象和骨髓象正常，恢复了正常生活与工作。经Kap1an-Meier曲线分析，本组病例3.5年无病生存率为63±15%。另外6例中5例移植后6～22个月复发，l例移植后6个月在夜间猝死。
四、合并症
最常见的是感染和发热，本组17例中合并感染发热在38.5℃以上者12例，其中绿脓杆菌败血症2例，肺炎3例，口腔粘膜或其周围软组织感染5例，肛周脓肿或其软组织感染2例，阴道口溃疡1例，出血性膀胱炎2例。其次为ALT升高6例，便血者3例，带状疱疹和皮肤药物疹各1例，蛛网膜下腔出血1例，双下肢皮下结节状坏死和皮下脓肿各1例。还有2例患者移植前HBsAg阴性，移植后17天和21天转为阳性。在随访观察中有2例于移植后3个月发生急性黄疸型肝炎，其中1例移植前HBsAg阳性，后多次复查仍为阳性，抗HCV阴性，诊断为慢性迁延性乙性肝炎，均经过保肝治疗l～2个月后黄疸消退，ALT恢复正常。此乙型肝炎患者黄疸消退1年后，于93年6月又出现黄疸， ALT升高，现仍在随访治疗中。
, 百拇医药
讨 论
骨髓净化技术的研究，正在推进自体骨髓移植的发展。净化后自体骨髓移植(PABMT)存在的主要问题，仍然是移植后白血病复发率较高，因此，寻找具有选择性清除各种白血病细胞的净化方法已成为采用自体骨髓移植治疗白血病的重要课题。
体外长期骨髓细胞培养体系不利于白血病细胞的生存，因此，这一方法可用于体外净化白血病细胞，在实验研究的基础上。Chang等[7]首次将培养后的骨髓用于治疗急性髓细胞白血病复发期的ABMT，6个月后患者仍处于缓解状态且具有正常核型。
进一步研究结果表明，体外骨髓细胞长期培养体系虽能选择性地去除白血病细胞，但不能净化所有的白血病细胞[6-8]。因此，我们在体外骨髓细胞长期培养体系的基础上，加入LMW-NTS净化白血病细胞，可明显加速骨髓中残留白血病细胞的消失，净化处理后的骨髓AML-CFU达到完全检测不出的水平，同时对正常造血祖细胞的影响很小[5]。本组17例急性白血病缓解后采用此法进行PABMT，统计3.5年的无病生存率为62.7%，接近或相当于ALLO-BMT的效果，进一步证明LMW-NTS在白血病自体骨髓体外净化中的优越性，不仅适用于急性髓细胞白血病，而且对急性淋巴细胞白血病也有相类似的效果。由于治疗的病例较少，随访观察的时间尚短，确切疗效评价还需进一步积累病例和长期随访。
, 百拇医药
参 考 文 献
1.Gorin NC, Aegerter P. Autologous bone marrow transplantation for acute leukemia in remission. Bone Marrow Transplant, 1987, 2[Suppl 1] : 320.
2.Wu CT, Pei XT, Cong PJ. Effect of human fetal liver extract on the growth of HL-60 cells. Exp Hematol, 1989, 17 : 304.
3.Wu CT, Liu FL, Bai H, et al. The existence of a low molecular weight natural tumor suppressor in human fetal tissues. J Cancer, 1990, 3 : 354.
, 百拇医药
4.张之南主编.血液病诊断及疗效标准.天津科学技术出版社.1991,152-171.
5.杨科,滕爱萍,裴雪涛,等.用人类低分子抑瘤物净化白血病细胞后自体骨髓移植2例.中华内科杂志,1991,30:495.
6.Pei XT, Wu CT. Preferential suppression of low molecular weight natural tumor suppressor of human fetal liver origin on the growth of leukemic cells in vitro. Exp Hematol, 1990, 18 : 927.
7.Chang J, Coutinho LH, Morgenstern GR, et al. Recostitution of haemopoietic system with autologous marrow taken during repalse of acute myeloblastic leukemia and grown in long-term culture. Lancet, 1986, 1 : 294.
8.Chang J, Morgenstern GR, Coutinho LH, et al. The use of bone marrow cells grown in long-term culture for autologous bone marrow transplantation in acute myeloid leukemia : an update. Bone Marrow Transplant, 1989, 4 : 5.
(收稿：1993-10-16 修回：1994-01-20), 百拇医药
单位：100700北京军区总医院血液科(杨科、滕爱萍、王金才、席延荣、何学鹏、唐晓东、梅巍)，放疗科(吴安玉)军事医学科学院放射医学研究所(裴雪涛、吴祖泽、王立生)
关键词：骨髓移植；白血病，急性
中华医学杂志940512.htm 摘要 对17例急性白血病患者在完全缓解期，采用低分子天然肿瘤抑制物体外培养净化后进行了自体骨髓移植，其中急性髓细胞白血病14例，急性淋巴细胞白血病3例，预处理以环磷酰胺和全身照射为主。移植后未接受抗白血病治疗，随访观察15至45个月，11例无病生存15个月以上，8例24个月以上，5例30个月以上，最长1例为43个月。5例在6～22个月复发，1例在6个月猝死。统计3.5年无病生存率为62.7%×15.0%.
, 百拇医药 骨髓移植已广泛用于治疗急性白血病，异基因骨髓移植(ALLO-BMT)由于供髓者的缺乏，使大多数病人不能进行。自体骨髓移植(ABMT)白血病的复发率较高[1]，因此，近年来许多学者为减少白血病的复发，正在探索净化残留在骨髓中的白血病细胞，然后行ABMT的方法。目前净化方法尚不成熟，近年来，吴祖泽等[2，3]的研究表明，人类胎肝中存在一种低分子量的天然肿瘤抑制物(LMW-NTS)，它能选择性地抑制肿瘤细胞的生长，当体外液体长期培养体系中加入LMW-NTS的浓度达到200-400mg/L时，可完全抑制小鼠和人的多种白血病细胞以及原代白血病祖细胞(AML-CFu)的生长，而对正常造血细胞的生长却影响很小。因此我们对23例急性白血病患者在完全缓解期，采用LMW-NTS体外培养净化后进行了ABMT，取得了较好效果，现将移植后随访1年以上的17例患者的情况报道如下。
对象与方法
一、临床资料
17例中男7例，女10例。年龄为9～35岁平均年龄27岁。包括急性非淋巴细胞白血病(ANLL)14例(含M11例、M24例、M33例、M44例、M52例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)3例(均为L1型)，均经临床、血象、骨髓象确诊。诊断标准均符合血液病诊断及疗效标准[4]。本组病例完全缓解后，均经过原方案或类似方案巩固治疗2个疗程以上，氨甲喋呤鞘内注射4次以上，大剂量阿糖胞苷(HD-Ara-C)强化治疗2～4次。ALL中有1例处于CR3，期，ANLL中有1例处于CR2期，余15例均处于CRl期进行的ABMT。缓解至移植的时间：2～29个月，中位数7个月。随访时间最短者15个月，最长者45个月，随访时间统计截止至1993年8月。
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二、预处理方案
以环磷酰胺(CY)+全身照射(TBI)为主，CY用量2例为50mg/kg×2，15例为60mg /kg × 2。TBI采用8mev-X直线加速器于移植前1天下午和移植当天上午分两次照射，剂量有3例分别为6.5Gy、7.0Gy和7.5Gv，14例均为8.0Gy，剂量率为0.038～0.044Gv/min。此外有2例TBI为6.5Gy和7.5Gy患者分别加用Ara-C300mg和500mg。
三、骨髓采集与长期骨髓培养体外净化体系[5]
粒单祖细胞(CFU-GM)和AML-CFU培养法见文献[6]。本组病例培养4天者6例，培养5天者5例，培养9天者5例，培养10天者1例。
结 果
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一、骨髓净化处理前后造血细胞的变化
17例患者骨髓经沉淀分离后所得有核细胞数平均为2.0±0.8×108/kg，CFU-GM为6.7±5.6× 104/kg经4～10天净化培养后，回输的有核细胞数平均为1.4±0.7×108/kg， CFU-GM为5.1±4.0 ×l04/kg，二者回收率分别为66±21%和91±60%。少数病例净化培养后有核细胞数和CFU-GM数较净化培养前有所增加，说明LMW一NTS对正常造血细胞的影响较小17例中有12例在净化处理前后进行AML-CFU检测，其中5例净化处理前AML-CFU为0.02～1.58/2×105MNC(单个核细胞)经净化处理4天后均达到检测不出的水平，其余患者净化处理前后均未检测出AML-CFU生长，表明这一净化体系有较好的净化效果。
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二、移植后造血功能的恢复情况
移植后血象中红细胞和血红蛋白波动较小。白细胞在移植后5(1～8)天降至0～0.05×109/L，持续8(1～11)天，恢复至≥1.0×109/L的时间为22(14～50)天。血小板降至≤20×109/L的时间为9(5～16)天，持续9(2～24)天，升至≥40×109/L的时间为42(18～103)天。 17例骨髓象除1例患者在移植后第4天余16例息者均在移植后第7或第8天变为增生重度减低，有核细胞极少，骨髓呈空虚状态；一般在移植后21(11～50)天增生程度有所进步，移植后29(21～56)天恢复至增生活跃状态。骨髓CFU-GM培养在骨髓增生重度减低期均为0/2×l05MNC，在骨髓增生减低期或增生活跃期开始逐渐生长，移植后28天时为9.9(0～67.5/2×105MNC， 42天时为29(l.0～142.5)/2×105MNC，但大多数病例在移植后42天时还未恢复至移植前的水平。
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三、治疗效果
本组17例患者移植后未进行抗白血病药物治疗，随访观察15～45个月，其中11例无病生存在15个月以上，8例在24个月以上，5例在30个月以上，最长的1例为43个月，病情均保持稳定，血象和骨髓象正常，恢复了正常生活与工作。经Kap1an-Meier曲线分析，本组病例3.5年无病生存率为63±15%。另外6例中5例移植后6～22个月复发，l例移植后6个月在夜间猝死。
四、合并症
最常见的是感染和发热，本组17例中合并感染发热在38.5℃以上者12例，其中绿脓杆菌败血症2例，肺炎3例，口腔粘膜或其周围软组织感染5例，肛周脓肿或其软组织感染2例，阴道口溃疡1例，出血性膀胱炎2例。其次为ALT升高6例，便血者3例，带状疱疹和皮肤药物疹各1例，蛛网膜下腔出血1例，双下肢皮下结节状坏死和皮下脓肿各1例。还有2例患者移植前HBsAg阴性，移植后17天和21天转为阳性。在随访观察中有2例于移植后3个月发生急性黄疸型肝炎，其中1例移植前HBsAg阳性，后多次复查仍为阳性，抗HCV阴性，诊断为慢性迁延性乙性肝炎，均经过保肝治疗l～2个月后黄疸消退，ALT恢复正常。此乙型肝炎患者黄疸消退1年后，于93年6月又出现黄疸， ALT升高，现仍在随访治疗中。
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讨 论
骨髓净化技术的研究，正在推进自体骨髓移植的发展。净化后自体骨髓移植(PABMT)存在的主要问题，仍然是移植后白血病复发率较高，因此，寻找具有选择性清除各种白血病细胞的净化方法已成为采用自体骨髓移植治疗白血病的重要课题。
体外长期骨髓细胞培养体系不利于白血病细胞的生存，因此，这一方法可用于体外净化白血病细胞，在实验研究的基础上。Chang等[7]首次将培养后的骨髓用于治疗急性髓细胞白血病复发期的ABMT，6个月后患者仍处于缓解状态且具有正常核型。
进一步研究结果表明，体外骨髓细胞长期培养体系虽能选择性地去除白血病细胞，但不能净化所有的白血病细胞[6-8]。因此，我们在体外骨髓细胞长期培养体系的基础上，加入LMW-NTS净化白血病细胞，可明显加速骨髓中残留白血病细胞的消失，净化处理后的骨髓AML-CFU达到完全检测不出的水平，同时对正常造血祖细胞的影响很小[5]。本组17例急性白血病缓解后采用此法进行PABMT，统计3.5年的无病生存率为62.7%，接近或相当于ALLO-BMT的效果，进一步证明LMW-NTS在白血病自体骨髓体外净化中的优越性，不仅适用于急性髓细胞白血病，而且对急性淋巴细胞白血病也有相类似的效果。由于治疗的病例较少，随访观察的时间尚短，确切疗效评价还需进一步积累病例和长期随访。
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参 考 文 献
1.Gorin NC, Aegerter P. Autologous bone marrow transplantation for acute leukemia in remission. Bone Marrow Transplant, 1987, 2[Suppl 1] : 320.
2.Wu CT, Pei XT, Cong PJ. Effect of human fetal liver extract on the growth of HL-60 cells. Exp Hematol, 1989, 17 : 304.
3.Wu CT, Liu FL, Bai H, et al. The existence of a low molecular weight natural tumor suppressor in human fetal tissues. J Cancer, 1990, 3 : 354.
, 百拇医药
4.张之南主编.血液病诊断及疗效标准.天津科学技术出版社.1991,152-171.
5.杨科,滕爱萍,裴雪涛,等.用人类低分子抑瘤物净化白血病细胞后自体骨髓移植2例.中华内科杂志,1991,30:495.
6.Pei XT, Wu CT. Preferential suppression of low molecular weight natural tumor suppressor of human fetal liver origin on the growth of leukemic cells in vitro. Exp Hematol, 1990, 18 : 927.
7.Chang J, Coutinho LH, Morgenstern GR, et al. Recostitution of haemopoietic system with autologous marrow taken during repalse of acute myeloblastic leukemia and grown in long-term culture. Lancet, 1986, 1 : 294.
8.Chang J, Morgenstern GR, Coutinho LH, et al. The use of bone marrow cells grown in long-term culture for autologous bone marrow transplantation in acute myeloid leukemia : an update. Bone Marrow Transplant, 1989, 4 : 5.
(收稿：1993-10-16 修回：1994-01-20), 百拇医药