分化相关基因的染色体荧光原位杂交定位
作者：郑文岭 傅明 王秀琴 王明荣 吴旻
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所细胞生物分子肿瘤学国家重点实验室
关键词：食管肿瘤；染色体，人；荧光原位杂交
中华医学杂志960420
目的 为提高标记效率基因定位的准确性，将维甲酸诱导食管癌细胞系EC8712通过消减杂交获得的一个能抑制食管癌细胞生长的cDNA RA538克隆，并将其定位于人染色体8q区。方法 采用改良的非内同素标记方法，使生物素标记程度提高，对染色体原位杂交信号检出率有明显的影响。结果 采用两次标记的探针进行染色体原位杂交，可见明显的杂交信号，观察60个中期分裂相，两条染色单体上均出现阳性信号的核型有18个，检出率达30%，而仅用单次标记的探针进行杂交时，信号检出率明显降低，观察60个分裂相，出现杂交信号的分裂相仅有7个，且多位于染色体的一条单体上。结论 使用双标记荧光原位杂交技术，啬了标记分子的掺入率，提高了检测的成功率，将分化相关基因RA538定位于8号染色体的长臂2区。
, 百拇医药
Assinment of differentiation-relevant cDNA RA538 on human chromosomes by fluorescence in situ hybridization Zheng Wenling, Fu Ming, Wang Xiuqin, et al. Cancer Institute, CAMS/PUMC, National Laboratory of Molecular Oncology, Beijing 100021
Objective To localiza the differentiation-relevant cDNA RA538 (3.8kb) onto the human chromosome 8q2 Methods A modified non-isotopic labeling technique was used. Results The cDNA RA538 was obtained by subtraction hybridization from human esophageal cancer cell line EC8712 induced by retinoic acid. Fluorescence in situ hybridization (FISH) using double-labeled probes showed clear and paired hybridization signals at the corresponding regions of both two chromatids in 18 out of 60 metaphases examined. While by single-labeling, only 7 were positive in 60 metaphases observed and the fluorescent spots were seen only at one chromatid. Conclusion The modified FISH protocol is useful for mapping cDNA sequences of a few kilobases.
, 百拇医药
Key words Esophageal neoplasms Chromosomes, human Fluorescence in situ hybridization
肿瘤细胞发生是一个复杂的生物学过程，在此过程中，癌基因与肿瘤抑制基因相互作用，决定了肿瘤细胞的发生与发展[1]。冯骆等[2]用维甲酸诱导食管癌细胞系EC8712通过消减杂交获得一个在分化细胞中表达抑制食管癌细胞生长的cDNA克隆，定名为RA538。经DNA测序和计算机分析，RA538含有一段可能的开放读码框，该框区与GenBank基因数据库中的序列无同源性，提出该序列是一新的未知基因。
荧光原位杂交(FISH)是在染色体上定位基因的新技术[3]。它与相应的同位素方法相比，具有快速、安全、直观和灵敏等特点，但在定位来自cDNA的基因片段时，由于cDNA一般较短，杂交信号常常很弱，从而影响检测[4]。我们对探针标记过程加以改良，使标记分子的掺入率明显增加，提高了检测的成功率，在人类染色体上定位了分化相关基因RA538。
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材料和方法
一、材料
RA538为我室用维甲酸诱导食管癌细胞系EC8712，通过消减杂交获得的一个能抑制食管癌细胞生长的cDNA片段。
二、方法
1.染色体标本的制备：采用我室常规微量外周血空气干燥法进行中期染色体标本制备。经室温干燥24小时后，密封于塑料袋中，置-20℃保存备用。
2.探针标记：将RA538质粒Pst与BamHI酶解后，电沪回收插入片段3.2kb，以常规酚/氯仿抽提，乙醇沉淀及空气干燥。取0.1µg进行随机引物反应20µl不经终止，直接进行缺口平移标记，使Biotin-14-dATP掺入探针链中，待15℃1小时后，将离心柱层析，去除未标记的dUTP，二位体积乙醇沉淀，干燥，然后溶于10µl去离子水口。
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3.生物素探针的检测：探针经生物素标记后，一般需经检测以确定其标记效率。检查方法是将生物素化的探针按比例稀释后，点样在硝酸纤维素膜上，80℃真空烤炉中干燥1小时后，用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭10分钟，直接与1：10稀释的Strepatvidin-碱性磷酸酶孵育20分钟；彻底清洗后，用碱性缓冲液(10mmol/L Tris·HCl pH 9.5, 100mmol/L NaCl)预处理后，滤膜于NBT/BCTP底物液中进行显色反应。
4.染色体荧光原位杂交：(1)玻片于50℃加热1~2小时，经100µg/ml的RNase 37℃孵育1小时后，2XSSC清洗，顺序乙醇脱水，空气干燥。(2)将玻片放于预热至70℃的70%甲酰胺-2XSSC变性液中5分钟，然后迅速移入冷的70%乙醇中，并顺序乙醇脱水、干燥。(3)取标记并检测后的探针，按探针DNA 2µg/ml，50%甲酰受、2XSSC、10%硫酸葡聚糖以及变性的鱼精DNA 500µg/ml配制杂交混合液，70℃变性3~5分钟，迅速放于冰浴5分钟。将变性后的探针加至上述变性的染色钵标本表面，封片并用氯丁胺封边，于37℃湿盒杂交12~24小时。(4)杂交结束后，将玻片浸于45℃、50%甲酰胺-2XSSC中清洗5次，每次3分钟，在45℃的2XSSC中清洗3次，每次5分钟，最后浸于0.1mol/L PBS、pH 8.0、5%NP40缓冲液中室温10分钟，然后5µg/ml的FITC-卵白素DCS，室温30~60分钟。反应后放于磷酸缓冲液中清洗5次，每次5分钟。再用5%脱脂奶粉室温封闭5分钟，然后滴加5mg/L生物素化的抗体，室温孵育30~60分钟。重复上述过程2~3次，使荧光信号逐级放大。玻片经彻底清洗，滴加甘油封片液体，在Zeiss ICM落射式荧光显微镜下观察，并摄影启示。
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结果
生物素化探针点样后检测的结果见附图。经随机引物法标记后，再经缺口标记的探针，较单纯用随机引物法标记的探针，生物素化程度大为提高。这对染色体荧光原位杂交信号检出率有明显的影响。
注：1~5为标记探针，1：10稀释后点样；A.仅经过单
一随机引物法标记的RA538；B.经过随机引物法与缺口
平移法两次标记的RA538；C.未经标记的RA538
附图 探针生物素化程度的检测
仅采用随机引物单次标记的探针进行杂交时，虽经FICT-卵白素及生物素化的抗卵白素抗体数次信号放大，仍不易检出杂交信号，即使检出其杂交信号，也多位于染色体的一条单体上，且检出率较低，计数60个分裂相，染色体出理单一杂交信号的分裂相有7个。同一分裂相的DAPI复染结果，对比分析虽可发现8号染色体长臂(8q)2区常出现单一的阳性位点，但由于不是在两条8号染色体长臂(8q)2区常出现单一的阳性位点，但由于不是在两条8号染色体上同时检测到成对出现的杂交信号，作为确切定位的依据不足。
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以两次标记的探针荧光原行杂交，观察到8q2区可见两条染色单体的相应区域上均显现出清晰及成对的杂交信号。计数60个中期分裂相，两条染色单体上均出现阳性信号的有18个，检出率30%；在两个9号染色体上都能检测到单一阳性位点的有9个，且均位于8q2区，RA538基因被被定位于人类染色体8q2区。
讨论
我们采用改良的探针标记方法，利用随机引物与缺口平移两次标记，使探针的生物素化程度大为提高，然后进行染色体荧光原位杂交，将RA538定位于人染色体的8q2区。
一般认为，短片段(1~5kb)DNA不易用于FISH方法定位[4]。Trask[5]统计了采用不同长度的DNA标记探针进行原位杂交的结果，显示信号检出率与DNA长度直接相关。来自cDNA或短片段基因组序列(1~5kb)，杂交信号检出率为5%~20%，来自Cosmid噬菌体克隆的基因组片段(10~40kb)，检出率可提高至80%以上，而采用YAC文库的大片段DNA(100~500kb或更长)，检出率可达95%以上。
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然而，某些特殊基因不易被常用的基因组文库载体所克隆，致使某些cDNA片段难以筛出其相应的基因组序列。因此，探索稳定有效的短片DNA FISH方法，已成为基因定位技术亟待开发的课题[6]。
Koch等[7]采用原位延伸法，又称引物介导的原位标记法(primed in situ labelling PRINS)，先使引物附着于特殊靶序列位置，然后在高质量DNA聚合酶作用下，使引物原位延伸，在延伸的过程中，高效掺入多量的生物素之后进行荧光检测。该技术可能成为一种有效的原位研究DNA性质的方法[8]。但目前研究仍然限于寡核苷酸引物介导，而采用cDNA片段介导的研究尚未报道。Scherthan等[4]先用缺口平移标记探针，然后再用未端标记使探针两次标记，使其生物素化有所提高。但由于未端标记酶时，常非特异地在探针未端标记上相同的多聚核苷酸(poly dA或poly dU)，后者在进行杂交时易与基因组中的重复序列发生结合，而产生较强的非特异信号。我们则采用2种常用的标记方法；缺口平移与随机引物法进行两次标记，使标记效率增加。经染色体FISH检测，并未见明显的背景，而定位的准确性明显提高。
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本课题为国家“八六三”高技术发展计划、中国人民解放军总后勤部卫生部科研基金、中国医学科学院基金资助项目
参考文献
1 吴旻.抑癌基因研究发展.基础医学与临床,1991,11:1.
2 冯骆,王秀琴,吴旻,等.从人食管癌细胞系分离分化基因的新方法.中国科学.1991,10:1060.
3 郑文岭,郑杰,吴秉铨,等.高转移人肺细胞癌系克隆DNA片段的染色体初步定位.中华病理学杂志,1991,19:245.
4 Scherthan H, Kohler M, Vogt K, et al. chromosomal in situ hybridization with human chromosome specfic DNA libraries. Chromosoma, 1992, 10:265.
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5 Trask BJ. fluorescence in situ hybridization. Trent GEnet, 1991, 7: 149.
6 Korenberg JR, YangF T, Schreck R, et al. Using fluorescent in situ hybridization in genome mapping. TIBTECH, 1992, 10:27.
7 Koch JE, Kolvraa S, Petersen KB, et al. Oligonu-cleotideprimed methods for the chromosome-specific labelling of alphasetellite DNA in situ. Chromosoma 1989, 98: 156.
8 Koch J, Mogensen S, et al. Fast one-step procedure for the detection of nucleic acids in situ by primer induced sequence specific labelling with fluorescein-12-dUTP. Cytogenet Cell Genet, 1992, 60: 1.
(收稿：1995-04-24 修回：1996-01-09), http://www.100md.com
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所细胞生物分子肿瘤学国家重点实验室
关键词：食管肿瘤；染色体，人；荧光原位杂交
中华医学杂志960420
目的 为提高标记效率基因定位的准确性，将维甲酸诱导食管癌细胞系EC8712通过消减杂交获得的一个能抑制食管癌细胞生长的cDNA RA538克隆，并将其定位于人染色体8q区。方法 采用改良的非内同素标记方法，使生物素标记程度提高，对染色体原位杂交信号检出率有明显的影响。结果 采用两次标记的探针进行染色体原位杂交，可见明显的杂交信号，观察60个中期分裂相，两条染色单体上均出现阳性信号的核型有18个，检出率达30%，而仅用单次标记的探针进行杂交时，信号检出率明显降低，观察60个分裂相，出现杂交信号的分裂相仅有7个，且多位于染色体的一条单体上。结论 使用双标记荧光原位杂交技术，啬了标记分子的掺入率，提高了检测的成功率，将分化相关基因RA538定位于8号染色体的长臂2区。
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Objective To localiza the differentiation-relevant cDNA RA538 (3.8kb) onto the human chromosome 8q2 Methods A modified non-isotopic labeling technique was used. Results The cDNA RA538 was obtained by subtraction hybridization from human esophageal cancer cell line EC8712 induced by retinoic acid. Fluorescence in situ hybridization (FISH) using double-labeled probes showed clear and paired hybridization signals at the corresponding regions of both two chromatids in 18 out of 60 metaphases examined. While by single-labeling, only 7 were positive in 60 metaphases observed and the fluorescent spots were seen only at one chromatid. Conclusion The modified FISH protocol is useful for mapping cDNA sequences of a few kilobases.
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Key words Esophageal neoplasms Chromosomes, human Fluorescence in situ hybridization
肿瘤细胞发生是一个复杂的生物学过程，在此过程中，癌基因与肿瘤抑制基因相互作用，决定了肿瘤细胞的发生与发展[1]。冯骆等[2]用维甲酸诱导食管癌细胞系EC8712通过消减杂交获得一个在分化细胞中表达抑制食管癌细胞生长的cDNA克隆，定名为RA538。经DNA测序和计算机分析，RA538含有一段可能的开放读码框，该框区与GenBank基因数据库中的序列无同源性，提出该序列是一新的未知基因。
荧光原位杂交(FISH)是在染色体上定位基因的新技术[3]。它与相应的同位素方法相比，具有快速、安全、直观和灵敏等特点，但在定位来自cDNA的基因片段时，由于cDNA一般较短，杂交信号常常很弱，从而影响检测[4]。我们对探针标记过程加以改良，使标记分子的掺入率明显增加，提高了检测的成功率，在人类染色体上定位了分化相关基因RA538。
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材料和方法
一、材料
RA538为我室用维甲酸诱导食管癌细胞系EC8712，通过消减杂交获得的一个能抑制食管癌细胞生长的cDNA片段。
二、方法
1.染色体标本的制备：采用我室常规微量外周血空气干燥法进行中期染色体标本制备。经室温干燥24小时后，密封于塑料袋中，置-20℃保存备用。
2.探针标记：将RA538质粒Pst与BamHI酶解后，电沪回收插入片段3.2kb，以常规酚/氯仿抽提，乙醇沉淀及空气干燥。取0.1µg进行随机引物反应20µl不经终止，直接进行缺口平移标记，使Biotin-14-dATP掺入探针链中，待15℃1小时后，将离心柱层析，去除未标记的dUTP，二位体积乙醇沉淀，干燥，然后溶于10µl去离子水口。
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3.生物素探针的检测：探针经生物素标记后，一般需经检测以确定其标记效率。检查方法是将生物素化的探针按比例稀释后，点样在硝酸纤维素膜上，80℃真空烤炉中干燥1小时后，用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭10分钟，直接与1：10稀释的Strepatvidin-碱性磷酸酶孵育20分钟；彻底清洗后，用碱性缓冲液(10mmol/L Tris·HCl pH 9.5, 100mmol/L NaCl)预处理后，滤膜于NBT/BCTP底物液中进行显色反应。
4.染色体荧光原位杂交：(1)玻片于50℃加热1~2小时，经100µg/ml的RNase 37℃孵育1小时后，2XSSC清洗，顺序乙醇脱水，空气干燥。(2)将玻片放于预热至70℃的70%甲酰胺-2XSSC变性液中5分钟，然后迅速移入冷的70%乙醇中，并顺序乙醇脱水、干燥。(3)取标记并检测后的探针，按探针DNA 2µg/ml，50%甲酰受、2XSSC、10%硫酸葡聚糖以及变性的鱼精DNA 500µg/ml配制杂交混合液，70℃变性3~5分钟，迅速放于冰浴5分钟。将变性后的探针加至上述变性的染色钵标本表面，封片并用氯丁胺封边，于37℃湿盒杂交12~24小时。(4)杂交结束后，将玻片浸于45℃、50%甲酰胺-2XSSC中清洗5次，每次3分钟，在45℃的2XSSC中清洗3次，每次5分钟，最后浸于0.1mol/L PBS、pH 8.0、5%NP40缓冲液中室温10分钟，然后5µg/ml的FITC-卵白素DCS，室温30~60分钟。反应后放于磷酸缓冲液中清洗5次，每次5分钟。再用5%脱脂奶粉室温封闭5分钟，然后滴加5mg/L生物素化的抗体，室温孵育30~60分钟。重复上述过程2~3次，使荧光信号逐级放大。玻片经彻底清洗，滴加甘油封片液体，在Zeiss ICM落射式荧光显微镜下观察，并摄影启示。
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结果
生物素化探针点样后检测的结果见附图。经随机引物法标记后，再经缺口标记的探针，较单纯用随机引物法标记的探针，生物素化程度大为提高。这对染色体荧光原位杂交信号检出率有明显的影响。
注：1~5为标记探针，1：10稀释后点样；A.仅经过单
一随机引物法标记的RA538；B.经过随机引物法与缺口
平移法两次标记的RA538；C.未经标记的RA538
附图 探针生物素化程度的检测
仅采用随机引物单次标记的探针进行杂交时，虽经FICT-卵白素及生物素化的抗卵白素抗体数次信号放大，仍不易检出杂交信号，即使检出其杂交信号，也多位于染色体的一条单体上，且检出率较低，计数60个分裂相，染色体出理单一杂交信号的分裂相有7个。同一分裂相的DAPI复染结果，对比分析虽可发现8号染色体长臂(8q)2区常出现单一的阳性位点，但由于不是在两条8号染色体长臂(8q)2区常出现单一的阳性位点，但由于不是在两条8号染色体上同时检测到成对出现的杂交信号，作为确切定位的依据不足。
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以两次标记的探针荧光原行杂交，观察到8q2区可见两条染色单体的相应区域上均显现出清晰及成对的杂交信号。计数60个中期分裂相，两条染色单体上均出现阳性信号的有18个，检出率30%；在两个9号染色体上都能检测到单一阳性位点的有9个，且均位于8q2区，RA538基因被被定位于人类染色体8q2区。
讨论
我们采用改良的探针标记方法，利用随机引物与缺口平移两次标记，使探针的生物素化程度大为提高，然后进行染色体荧光原位杂交，将RA538定位于人染色体的8q2区。
一般认为，短片段(1~5kb)DNA不易用于FISH方法定位[4]。Trask[5]统计了采用不同长度的DNA标记探针进行原位杂交的结果，显示信号检出率与DNA长度直接相关。来自cDNA或短片段基因组序列(1~5kb)，杂交信号检出率为5%~20%，来自Cosmid噬菌体克隆的基因组片段(10~40kb)，检出率可提高至80%以上，而采用YAC文库的大片段DNA(100~500kb或更长)，检出率可达95%以上。
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然而，某些特殊基因不易被常用的基因组文库载体所克隆，致使某些cDNA片段难以筛出其相应的基因组序列。因此，探索稳定有效的短片DNA FISH方法，已成为基因定位技术亟待开发的课题[6]。
Koch等[7]采用原位延伸法，又称引物介导的原位标记法(primed in situ labelling PRINS)，先使引物附着于特殊靶序列位置，然后在高质量DNA聚合酶作用下，使引物原位延伸，在延伸的过程中，高效掺入多量的生物素之后进行荧光检测。该技术可能成为一种有效的原位研究DNA性质的方法[8]。但目前研究仍然限于寡核苷酸引物介导，而采用cDNA片段介导的研究尚未报道。Scherthan等[4]先用缺口平移标记探针，然后再用未端标记使探针两次标记，使其生物素化有所提高。但由于未端标记酶时，常非特异地在探针未端标记上相同的多聚核苷酸(poly dA或poly dU)，后者在进行杂交时易与基因组中的重复序列发生结合，而产生较强的非特异信号。我们则采用2种常用的标记方法；缺口平移与随机引物法进行两次标记，使标记效率增加。经染色体FISH检测，并未见明显的背景，而定位的准确性明显提高。
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本课题为国家“八六三”高技术发展计划、中国人民解放军总后勤部卫生部科研基金、中国医学科学院基金资助项目
参考文献
1 吴旻.抑癌基因研究发展.基础医学与临床,1991,11:1.
2 冯骆,王秀琴,吴旻,等.从人食管癌细胞系分离分化基因的新方法.中国科学.1991,10:1060.
3 郑文岭,郑杰,吴秉铨,等.高转移人肺细胞癌系克隆DNA片段的染色体初步定位.中华病理学杂志,1991,19:245.
4 Scherthan H, Kohler M, Vogt K, et al. chromosomal in situ hybridization with human chromosome specfic DNA libraries. Chromosoma, 1992, 10:265.
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5 Trask BJ. fluorescence in situ hybridization. Trent GEnet, 1991, 7: 149.
6 Korenberg JR, YangF T, Schreck R, et al. Using fluorescent in situ hybridization in genome mapping. TIBTECH, 1992, 10:27.
7 Koch JE, Kolvraa S, Petersen KB, et al. Oligonu-cleotideprimed methods for the chromosome-specific labelling of alphasetellite DNA in situ. Chromosoma 1989, 98: 156.
8 Koch J, Mogensen S, et al. Fast one-step procedure for the detection of nucleic acids in situ by primer induced sequence specific labelling with fluorescein-12-dUTP. Cytogenet Cell Genet, 1992, 60: 1.
(收稿：1995-04-24 修回：1996-01-09), http://www.100md.com