脑缺血大鼠海马细胞外液氨基酸的动成变化
作者：李菊 杨期东 欧阳珊 夏令伟 陈本美 陈本美 李竹亭
单位：410008长沙，湖南医科大学神经病学研究所(李 菊、杨期东、欧阳珊)，分析测试中心(夏令伟、陈本美)，机能实验室(李竹亭)
关键词：脑缺血；氨基酸类；丹参
中华医学杂志960417 目的 研究脑缺血时兴奋性氨基酸(EAA)的动态变化，了解丹参注射液对EAA的影响。方法 采用Pulsineli四动脉闭塞法并进行了改良，通过立体定向置于海马部位进行动态观察，并用荧光检测法测定脑海马细胞外液EAA的变化。结果 不完全脑缺血30和60分钟细胞外液谷氨酸30分钟和60分钟谷氨酸为5.88±1.40和11.2±1.5µmol/L；天门冬氨酸为2.72±0.24和4.4±0.6µmol/L；完全性细胞缺血30分钟和60分钟谷氨酸为15.1±1.6和17.8±1.6µmol/L；天门冬氨酸为8.2±1.0和12.1±1.1µmol/L；对照组谷氨酸和天门冬氨酸分别为1.8±0.9和0.24±0.09µmol/L(P<0.01)。结论 养活缺血时脑细胞EAA的释放，养活神经细胞的损伤而发挥对脑的保护作用。
, http://www.100md.com
Dynamic changes of amino acids in extracellular fluid in rat hippocampus in cases of cerebral ischemia Li Ju,Yang Qidong,Ouyang Shan,et al.Institute of Neurology,Hunan Medical University,Changsha,Hunan 410008
Objective To study the changes of excitatory amino acid(EAA)in patients with cerebral ischemia. Methods We observed dynamic changes of EAA in extracellular fluid by intracerbral microdialysis inserted in hippocampus through stereotaic method with modified Pulsinelli's model of four vessels occlusion.Results The concentration of Glu was 5.88 1.40and 11.2 1.5mol/L in patents with incomplete cerebral ischemia after 30 minutes and 60 minutes,and the concentration of Asp was2.72 0.24and 4.40.6mol/L.The concentration of Glu was 15.11.6mol/Land 17.91.6mol/Land0.240.09mol/Lin the controls.Conclusions In this study,the concentration of Glu and Asp in patients with cerebral ischemia was significantly inereased than in the controls ,and the more serious ischemia was ,the more release of EAA.It is suggested that Dansen injection ca reduce the release of EAA by cerebral cells in case of ischemia.
, 百拇医药
Key words Cerebral ischemia Amino acids Salvia miltiorrhiz
(Natl Med J China,1996,76:294-296)
脑缺血导致海马CA1区神经元迟发性死亡(DND)，近来已引起人们极大重视[1]，有些学者认为兴奋性氨基酸的毒性作用是DND的主要原因。脑内微透析技术是近来发展起来的一种提取细胞间液的方法，可用以测定药物在活体动物脑内对单个或多个神经递质的影响，与其他方法比较更接近生理条件[2]。为此，我们应用改良的脑缺血模型及微爱析技术研究丹参注射液对EAA的影响和不同程度缺血时海马细胞外液EAA的动态变化。
材料和方法
一、动物模型制备和实验分组
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用改良四动脉闭塞法制脑缺血动物模型。以Wistar大鼠60只，用1%巴比受钠400mg/kg腹腔注射麻醉，行颈部正中切，分离双侧颈总动脉，并行气管插管；然后将动物固定平立体定位仪上，做颈枕部正中切口，分离又侧脊旁肌，见第一颈椎再分离出双侧翼小孔。
动物分组为(1)对照组10只；(2)不完全性脑缺血组10只，双侧颈总动脉分别夹闭30、60分钟；(3)完全性脑缺血组10只，先用硝酸银经翼小孔封闭双侧椎动脉，再分别夹闭双侧颈总动脉30、60分钟；(4)丹参治疗组10只，在完全性脑缺血前30分钟，经颈静脉注入丹参注射液10g/kg(上海市新冈制药厂)；(5)生理盐水组10只，在完全性脑缺血前30分钟，经颈静脉注入8ml/kg生理盐水。
二、细胞外液中兴奋性氨基酸的测定
切开固定于立体位仪上的Wistar鼠的头皮，暴露颅骨，取坐标AP4.3mm、ML2mm钻2mm的孔，斜40夹角处将透析管插入5mm。缓慢注入人工脑脊液(1.5l/min)，并收集透析液置-20冰箱2天内测定。通过病理检查透析管埋植的部位是否正确。采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生法，高效液相色谱Spher C18柱分离，荧光检测法测定透析液中氨基酸的含量[4]。
, 百拇医药
海马病理组织学检查：不完全性脑缺血及完全性脑缺血60分钟后，分别再灌注12小时，动物均在全麻下先用50ml理盐水，再用10%甲醛150ml经心灌注固定脑组织，立即取脑置于同一固定液中继续固定天。作脑组织冠状切片，经常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下做海马部位病理组织学检查和海马CA区神经元密度计数[4]。
三、统计学处理
所有数据均用均值标准差表示，用SAS软件在IBM-386计算机上进行统计处理。
结果
一、海马细胞外液氨基酸的含量
不同程度脑缺血时海马细胞外液氨基酸含量的变化(表1)。本组分别测定脑细胞外液中15种游离氨基酸，如谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、赖氨酸等，此外，蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸等因含量太低，有些样本中未能测得，故未予统计在内。
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表1 海马细胞外液中氨基酸含量 (µmol/L，
±s) 组别
鼠数
谷氨酸
天门冬氨酸
丙氨酸
丝氨酸
缬氨酸
赖氨酸
对照
10
1.8±0.9
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0.2±0.1
0.3±0.01
1.1±0.2
0.7±0.1
1.3±0.03
不完全性脑缺血
10
30分钟
5.9±1.4*
2.7±0.2*
2.7±0.1*
1.2±0.2
, 百拇医药
0.7±0.1
1.6±0.1
60分钟
11.2±1.5*
4.4±0.6*
2.7±0.2*
1.2±0.2
1.2±0.5
1.8±0.1
完全性脑缺血
10
30分钟
, 百拇医药
15.1±1.6*
8.2±1.0*
2.8±0.1*
2.0±0.5
1.4±0.6
1.5±0.2
60分钟
17.9±1.6*
12.1±1.1*
3.8±0.1*
1.9±0.4
1.4±0.5
, 百拇医药
3.8±0.1
*与对照组比较P<0.01
二、丹参注射液对脑缺血时海马细胞外液EAA影响
完全性脑缺血组与生理盐水组比较差异无显著意义(P<0.05)，丹参治疗组EAA分别与生理盐水组和完全性脑缺血组相比明显减少(P<0.001)，差异有非常显著意义(表2)。
表2 丹参注射液对鼠脑缺血60分钟时海马细胞外液EAA的影响(µmol/L±s) 组别
鼠数
不完全性脑缺血
完全性脑缺血
, 百拇医药
谷氨酸
天门冬氨酸
谷氨酸
天门冬氨酸
1
10
11.2±1.5
4.4±0.6
17.9±1.6
12.1±1.1
2
10
11.2±1.7
, 百拇医药
4.3±0.6
17.5±1.6
12.1±1.0
3
10
4.3±1.4*
3.1±0.6*
4.3±0.5*
3.0±0.6*
注：组别1：对照组，2：盐水组，3：丹参组；*与1、2组比较P<0.001
三、海马区病理变化
, 百拇医药
光镜下对照组神经元形态正常，而缺血组神经元呈不同程度的缺血性改变，按神经元密度计数：缺血越严重，神经细胞减少越明显；丹参注射液能显著减少缺血再灌坏死神经元数量。
讨论
神经递质与脑缺血的关系越来越受到人们的重视。已证实谷氨酸和天门冬氨酸是中枢兴奋性递质。离体脑片、脑细胞培养和活体实验都已证明EAA具有很强的神经毒性作用。培养的皮层细胞，谷氨酸达到100µmol/L5分钟内即可引起细胞损伤。已证实在脑缺血时脑细胞外液中EAA浓度的升高主要帅于释放增加和摄取受阻而导致EAA的毒性作用。应用微透析技术，则可直接测定细胞间液中小分子物质含量的动态变化。生理条件下游离的谷氨酸绝大部分在细胞内，细胞内外的浓度差约1000倍。由于细胞上谷氨酸载体不断将细胞外的谷氨酸转运至神经元或胶质细胞内，细胞间液中谷氨酸维持在1µmol/L左右，因此不会引起毒性作用。
我们采用体内微透析技术，动态观察了脑缺血后细胞间液中EAA含量的变化。在本组测量的几种氨基酸中，与对照组比较，不同程度脑缺血组其谷氨酸和天门冬氨酸最显著和恒定，意义最大；脑缺血组比对照组的谷氨酸和天门冬氨酸均有明显升高缺血越重，时间载长，EAA增加越明显，这为今后的基础及临床研究提供了良好的理论依据。
, 百拇医药
丹参注射液的药理作用已有许多报道。脑缺血时丹参治疗组EAA明显低于生理盐水组和脑缺血组，表明了丹参注射液能减少脑缺血时脑细胞EAA的释放，减少神经细胞的损伤而起到及保护作用。
参考文献
1 Collins RC,Dobkin BH,Choi DW,et al.Selective vulnerability of the brain:new insights into the pathophysiology of stroke.Ann Int Med,1989,110:992.
2 Benveniste H. Brain microdialysis.J Neur,1989,52:1667.
3 Pulsinelli WA,James B. A new odel of bilateral heispheric ischemia in the unesthesiaed rat. Stroke,1979,10:267.
, 百拇医药
4 Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia.Brin Res,1982,239:57.
5 叶淮泠。谷氨酸是哺乳动物中枢的一种神经递质。生理科学进展，1987，18：27。
6 Choi DW,Rothman SM.The roles of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal adath.Annu Rev Neurosci,1990,13:171.
(收稿：1995-03-23 修回：1995-12-26), 百拇医药
单位：410008长沙，湖南医科大学神经病学研究所(李 菊、杨期东、欧阳珊)，分析测试中心(夏令伟、陈本美)，机能实验室(李竹亭)
关键词：脑缺血；氨基酸类；丹参
中华医学杂志960417 目的 研究脑缺血时兴奋性氨基酸(EAA)的动态变化，了解丹参注射液对EAA的影响。方法 采用Pulsineli四动脉闭塞法并进行了改良，通过立体定向置于海马部位进行动态观察，并用荧光检测法测定脑海马细胞外液EAA的变化。结果 不完全脑缺血30和60分钟细胞外液谷氨酸30分钟和60分钟谷氨酸为5.88±1.40和11.2±1.5µmol/L；天门冬氨酸为2.72±0.24和4.4±0.6µmol/L；完全性细胞缺血30分钟和60分钟谷氨酸为15.1±1.6和17.8±1.6µmol/L；天门冬氨酸为8.2±1.0和12.1±1.1µmol/L；对照组谷氨酸和天门冬氨酸分别为1.8±0.9和0.24±0.09µmol/L(P<0.01)。结论 养活缺血时脑细胞EAA的释放，养活神经细胞的损伤而发挥对脑的保护作用。
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Dynamic changes of amino acids in extracellular fluid in rat hippocampus in cases of cerebral ischemia Li Ju,Yang Qidong,Ouyang Shan,et al.Institute of Neurology,Hunan Medical University,Changsha,Hunan 410008
Objective To study the changes of excitatory amino acid(EAA)in patients with cerebral ischemia. Methods We observed dynamic changes of EAA in extracellular fluid by intracerbral microdialysis inserted in hippocampus through stereotaic method with modified Pulsinelli's model of four vessels occlusion.Results The concentration of Glu was 5.88 1.40and 11.2 1.5mol/L in patents with incomplete cerebral ischemia after 30 minutes and 60 minutes,and the concentration of Asp was2.72 0.24and 4.40.6mol/L.The concentration of Glu was 15.11.6mol/Land 17.91.6mol/Land0.240.09mol/Lin the controls.Conclusions In this study,the concentration of Glu and Asp in patients with cerebral ischemia was significantly inereased than in the controls ,and the more serious ischemia was ,the more release of EAA.It is suggested that Dansen injection ca reduce the release of EAA by cerebral cells in case of ischemia.
, 百拇医药
Key words Cerebral ischemia Amino acids Salvia miltiorrhiz
(Natl Med J China,1996,76:294-296)
脑缺血导致海马CA1区神经元迟发性死亡(DND)，近来已引起人们极大重视[1]，有些学者认为兴奋性氨基酸的毒性作用是DND的主要原因。脑内微透析技术是近来发展起来的一种提取细胞间液的方法，可用以测定药物在活体动物脑内对单个或多个神经递质的影响，与其他方法比较更接近生理条件[2]。为此，我们应用改良的脑缺血模型及微爱析技术研究丹参注射液对EAA的影响和不同程度缺血时海马细胞外液EAA的动态变化。
材料和方法
一、动物模型制备和实验分组
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用改良四动脉闭塞法制脑缺血动物模型。以Wistar大鼠60只，用1%巴比受钠400mg/kg腹腔注射麻醉，行颈部正中切，分离双侧颈总动脉，并行气管插管；然后将动物固定平立体定位仪上，做颈枕部正中切口，分离又侧脊旁肌，见第一颈椎再分离出双侧翼小孔。
动物分组为(1)对照组10只；(2)不完全性脑缺血组10只，双侧颈总动脉分别夹闭30、60分钟；(3)完全性脑缺血组10只，先用硝酸银经翼小孔封闭双侧椎动脉，再分别夹闭双侧颈总动脉30、60分钟；(4)丹参治疗组10只，在完全性脑缺血前30分钟，经颈静脉注入丹参注射液10g/kg(上海市新冈制药厂)；(5)生理盐水组10只，在完全性脑缺血前30分钟，经颈静脉注入8ml/kg生理盐水。
二、细胞外液中兴奋性氨基酸的测定
切开固定于立体位仪上的Wistar鼠的头皮，暴露颅骨，取坐标AP4.3mm、ML2mm钻2mm的孔，斜40夹角处将透析管插入5mm。缓慢注入人工脑脊液(1.5l/min)，并收集透析液置-20冰箱2天内测定。通过病理检查透析管埋植的部位是否正确。采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生法，高效液相色谱Spher C18柱分离，荧光检测法测定透析液中氨基酸的含量[4]。
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海马病理组织学检查：不完全性脑缺血及完全性脑缺血60分钟后，分别再灌注12小时，动物均在全麻下先用50ml理盐水，再用10%甲醛150ml经心灌注固定脑组织，立即取脑置于同一固定液中继续固定天。作脑组织冠状切片，经常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下做海马部位病理组织学检查和海马CA区神经元密度计数[4]。
三、统计学处理
所有数据均用均值标准差表示，用SAS软件在IBM-386计算机上进行统计处理。
结果
一、海马细胞外液氨基酸的含量
不同程度脑缺血时海马细胞外液氨基酸含量的变化(表1)。本组分别测定脑细胞外液中15种游离氨基酸，如谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、赖氨酸等，此外，蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸等因含量太低，有些样本中未能测得，故未予统计在内。
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表1 海马细胞外液中氨基酸含量 (µmol/L，
±s) 组别鼠数
谷氨酸
天门冬氨酸
丙氨酸
丝氨酸
缬氨酸
赖氨酸
对照
10
1.8±0.9
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0.2±0.1
0.3±0.01
1.1±0.2
0.7±0.1
1.3±0.03
不完全性脑缺血
10
30分钟
5.9±1.4*
2.7±0.2*
2.7±0.1*
1.2±0.2
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0.7±0.1
1.6±0.1
60分钟
11.2±1.5*
4.4±0.6*
2.7±0.2*
1.2±0.2
1.2±0.5
1.8±0.1
完全性脑缺血
10
30分钟
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15.1±1.6*
8.2±1.0*
2.8±0.1*
2.0±0.5
1.4±0.6
1.5±0.2
60分钟
17.9±1.6*
12.1±1.1*
3.8±0.1*
1.9±0.4
1.4±0.5
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3.8±0.1
*与对照组比较P<0.01
二、丹参注射液对脑缺血时海马细胞外液EAA影响
完全性脑缺血组与生理盐水组比较差异无显著意义(P<0.05)，丹参治疗组EAA分别与生理盐水组和完全性脑缺血组相比明显减少(P<0.001)，差异有非常显著意义(表2)。
表2 丹参注射液对鼠脑缺血60分钟时海马细胞外液EAA的影响(µmol/L
±s) 组别鼠数
不完全性脑缺血
完全性脑缺血
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谷氨酸
天门冬氨酸
谷氨酸
天门冬氨酸
1
10
11.2±1.5
4.4±0.6
17.9±1.6
12.1±1.1
2
10
11.2±1.7
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4.3±0.6
17.5±1.6
12.1±1.0
3
10
4.3±1.4*
3.1±0.6*
4.3±0.5*
3.0±0.6*
注：组别1：对照组，2：盐水组，3：丹参组；*与1、2组比较P<0.001
三、海马区病理变化
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光镜下对照组神经元形态正常，而缺血组神经元呈不同程度的缺血性改变，按神经元密度计数：缺血越严重，神经细胞减少越明显；丹参注射液能显著减少缺血再灌坏死神经元数量。
讨论
神经递质与脑缺血的关系越来越受到人们的重视。已证实谷氨酸和天门冬氨酸是中枢兴奋性递质。离体脑片、脑细胞培养和活体实验都已证明EAA具有很强的神经毒性作用。培养的皮层细胞，谷氨酸达到100µmol/L5分钟内即可引起细胞损伤。已证实在脑缺血时脑细胞外液中EAA浓度的升高主要帅于释放增加和摄取受阻而导致EAA的毒性作用。应用微透析技术，则可直接测定细胞间液中小分子物质含量的动态变化。生理条件下游离的谷氨酸绝大部分在细胞内，细胞内外的浓度差约1000倍。由于细胞上谷氨酸载体不断将细胞外的谷氨酸转运至神经元或胶质细胞内，细胞间液中谷氨酸维持在1µmol/L左右，因此不会引起毒性作用。
我们采用体内微透析技术，动态观察了脑缺血后细胞间液中EAA含量的变化。在本组测量的几种氨基酸中，与对照组比较，不同程度脑缺血组其谷氨酸和天门冬氨酸最显著和恒定，意义最大；脑缺血组比对照组的谷氨酸和天门冬氨酸均有明显升高缺血越重，时间载长，EAA增加越明显，这为今后的基础及临床研究提供了良好的理论依据。
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丹参注射液的药理作用已有许多报道。脑缺血时丹参治疗组EAA明显低于生理盐水组和脑缺血组，表明了丹参注射液能减少脑缺血时脑细胞EAA的释放，减少神经细胞的损伤而起到及保护作用。
参考文献
1 Collins RC,Dobkin BH,Choi DW,et al.Selective vulnerability of the brain:new insights into the pathophysiology of stroke.Ann Int Med,1989,110:992.
2 Benveniste H. Brain microdialysis.J Neur,1989,52:1667.
3 Pulsinelli WA,James B. A new odel of bilateral heispheric ischemia in the unesthesiaed rat. Stroke,1979,10:267.
, 百拇医药
4 Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia.Brin Res,1982,239:57.
5 叶淮泠。谷氨酸是哺乳动物中枢的一种神经递质。生理科学进展，1987，18：27。
6 Choi DW,Rothman SM.The roles of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal adath.Annu Rev Neurosci,1990,13:171.
(收稿：1995-03-23 修回：1995-12-26), 百拇医药