内毒素诱导器官损伤中炎症性细胞因子的表达及药物治疗探计
作者：邱海波 潘家绮 赵永强 杜斌 陈德昌
单位：100730 北京，中国协和医科大学危重病医学教研室(邱海波、杜斌、陈德昌)，内科学系(潘家绮、赵永强)
关键词：炎症；内毒素；细胞因子；地塞米松；异丁苯丙酸
中华医学杂志960406
目的 了解炎症性细胞因子在内毒素诱导的器官损伤中的表达，并控计地塞米松和异丁苯丙酸的治疗作用。方法 观察人内毒血症体外全血中地塞米松、异丁苯丙酸对肿瘤坏死因子(TNF)α的蛋白及mRNA表达的量效关系；同时用酶联免疫吸附和狭缝杂交法观察内毒素诱导的大鼠肺损伤组织中，两药对TNFα、白细胞介素1(IL-1)β、吞噬细胞炎症蛋白1(MIP-1)α蛋白与mRNA表达的抑制作用。结果 内毒素刺激体外培养的人全血TNFα浓度明显增加；地塞米松(>10-8mol/L)对其具有明显抑制效应；异丁苯丙酸浓度在10-9~10-7mol/L时为刺激效应。注射内毒素后鼠肺组织中TNFα、IL-1β、MIP-1α的mRNA含量随内毒素剂量增大而增加，峰值分别在2、6、12小时。两药能明显降低肺组织中伊文斯蓝含量(t分别为2.80和7.31，P均<0.05)，对这些炎症性细胞因子的mRNA均有明显抑制作用。结论 TNFα、IL-1β、MIP-1α是内毒素介导的炎症反应中的重要介质，地塞米松、异丁苯丙酸通过抑制这些细胞因子表达，对内毒素诱导的器官损伤起防扒作用。
, 百拇医药
The role of TNFα, IL-1β and MIP-1α in LPS-induced organ injury Qiu Haibo, Pan Jiaqi, Zhao yongqiang, et al. Department of Critical Care Medicine, Peking Union Medical College, Beijing 100730
Objectiv To investigate the role of inflammatory cytokines in endotoxemia models and to explore the possible anti-cytokine therapy of endotoxemia. Methods TNFα in plasma was measured by ELISA, and the mRNA of cytokines was assessed by slot blot analysis. Results LPS-induced TNFα release was in a dose: dependent manner in human whole bolld. Dexamethasone (≥10-8mol/L) exhibited inhibitory effect on TNFa release. Ibuprofen 10-7~10-9 mol/L had inhibitory effect on TNFa production, whereas 10-3~10-4mol/L stimulated TNFa release. The rat model of acute lung injury was made by LPS intraperitoneal injection. both dexamethasone and ibupprofen that injected at 1 hour before LPS injection could decrease the contents of EVans blue in the lung (t 2.80 and 7.31 respectively, P<0.05 vs LPS control). After LPS administered, there was a progressive up regulation in transcripts of TNFα, IL-1β and MIP-1α mRNAlevels decreased markedly when dexamethasone or ibuprofen given at 1 hour before LPS injection. Conclusion TNFα, IL-1β and MIP-1α play an essential role in the inflammatory response. LPS-induced acute lung injury may be prevented by dexamethasone and ibuprofen which have inhibitory effect on the gene expression of cytokines in the lung.
, 百拇医药
Key words InflammationEndotoxinCytokinesDexamethasoneIbuprofen
(Natl Med J China, 1996, 76: 254-257)
目前认为，严重感染诱发的全身炎症反应及器官损害，并不主要是细菌或毒素直接作用的后果，而是由于细菌或毒素刺激机体释放过量炎症介质，形成瀑布样链锁放大反应，引起组织细胞损伤，最终导致多器官功能衰竭[1，2]。可见研究炎症介质对组织细胞的损害，并探索细胞保护性治疗措施，具有明显的临床意义。我们通过观测大鼠腹腔内注射内毒素(LPS)后，3种炎症性细胞因子，即肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素1( IL-1)β、吞噬细胞炎症蛋白质( MIP-1)α的血浆水平及其mRNA在组织中的表达，并以地塞米松、异丁苯丙酸(布洛芬)阻断其作用，探讨炎症性细胞因子在LPS诱导的器官损害中的作用及防治措施。
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材料和方法
一、材料
Wistar大鼠50只均购自本院，LPS(Ecoli0127：B8)购自Difco公司，TNFα、IL-1β、 MIP-1α的cDNA探针荷兰阿姆斯丹大学惠赠。
二、方法
1.将30只大鼠均分为6组，分别腥腔注身生理盐水、LPS0.5mg/kg、5mg/kg、12.5mg/kg、LPS12.5mg/kg加异丁苯丙酸90mg/kg、LPS12.5mg/kg加地塞米松50mg/kg，其中异丁苯丙酸和地塞米松于腹腔注射LPS前1小时静脉注射。注射LPS前1分钟，各组静脉注射1%伊文思蓝2ml/kg。注射LPS后1小时放血处死大鼠，以生理盐水灌注肺组织。取100mg肺组织，加3ml甲酰胺，置37ºC孵育24小时。测浸出液中伊文思含量，以每克干肺中伊文思蓝含量反映肺血管通透性。
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2.取健康人全血，肚素(2×104U/L)抗凝，置24孔板，1ml/孔。均在加10mg/L的LPS刺激前1小时，加入不同浓度地塞米松、异丁苯丙酸，每药浓度均重复4次，混匀后置37℃、5%CO2培养，至LPS刺激后6小时检测上清TNFα。在沉淀物中加变性液，提取细胞总RNA，以TNFα的cDNA片段为探针行狭缝杂交，经放射性自显影，激光密度扫描，对mRNA相对定量，观察TNFα释放的量效关系。另置健康人全血于24孔板，均加LPS 10mg/L，分为LPS、地塞米松、异丁苯丙酸3组，每组4例。后2组在加LPS前1小明分别加10-7mol/L地塞米松或异丁苯丙酸。于LPS刺激后0，0.5，1，2，6，12，24小时取上清测TNFα，从沉淀物提取总RNA，以狭缝杂交时mRNA相对定量，观察TNFα释放的时效关系。
3.分别给5只吕鼠腹腔注射不同剂量的LPS(0、0.5、2.0、5.0、12.5mg/kg)，2小时后处死，取肺组织提取总RNA，用TNFα, IL-1β and MIP-1α的cDNA探针，行狭缝杂交，对mRNA相对定量，观察细胞因子表达的量效关系。12只大鼠均分为3组：生理盐水组、5mg/kg LPS腹腔注射组、5mg/kg LPS静脉注射组。于LPS注射后上述时间抽血检测血浆TNFα活性。同时取腹腔注射组动物肺组织提取总RNA，行狭缝杂交，对mRNA相对定量，观察细胞因子表达的时效关系。另取3只大鼠均腹腔注射LPS 5mg/kg，其中2只在LPS注射前1小时，分别静脉注射地塞米松50mg/kg、异丁苯丙酸90mg/kg，LPS注射后2小时处死动物，取肺组织观察药物对炎症细胞因子表达的影响。
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4.TNFα检测：以酶联免疫吸附法测定健康人全血上清的TNFα浓度；以L929细胞毒杀伤率法检测大鼠血浆TNFα活性。
5.统计学分析：采用配对t检验，数据均以均值标准差(
±s)表示。
结果
一、地塞米松、异丁苯丙酸对大鼠急性肺损伤的预防作用
腹腔注射LPS导致大鼠肺组织中伊文思蓝含量明显增高，LPS 12.54mg/kg组动物每克干肺组织中伊文思蓝含量为260±63μg，与生理盐水对照组(98±16μg)相比，差异有显著意义(t=5.88，P<0.05)。地塞米松和异丁苯丙酸提前1小时预防用药，则LPS(12.5mg/kg)注射会1小时每克干肺组织中伊文斯蓝含量均显著降低，分别为178±43μg和155±58μg，与LPS对照相比差异有显著意义(t值分别为2.80和7.31，P均<0.05)。
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二、药物对LPS介导TNFα生成的影响
对TNFα释放量效关系的观察发现，浓度>10-8mol/L的地塞米松明显抑LPS(10mg/l)诱导的TNFα释放。异丁苯丙酸对TNFα生成具有双向效应，10-9~10-7mol/L的异丁苯丙酸明显抑制TNFα释放，而浓度>10-4mol/L则刺激TNFα释放(表1)。对TNFα释放时效关系的观察发现，全血上清中TNFα水平随LPS浓度增加而增高，刺激6小时达峰值，维持6~12小时后下降(表2)。狭缝杂交显示，全血细胞TNFα和mRNA含量亦随LPS浓度增加而增高。将地塞米松(10-7mol/L)提前1小时给药，可明显降低上清TNFα含量，与LPS对照相比，TNFα峰值抑制90%以上(t=3.53，P<0.05，表2)。将异丁苯丙酸10-7mol/L提前1小时给药，也可明显降低上清TNFα含量，与LPS对照相比，TNFα峰值抑制51%(t=2.56，P<0.05)，但抑制作用显著低于地塞米松，差异有显著意义(t=10.73，P<0.05)。狭缝杂交显示，在10mg/L LPS刺激前1小明，加入地塞米松10-7mol/L、异丁苯丙酸10-7mol/L，均明显降低TNFαmRNA含量，与LPS对照比较分别抑制50%和40%。
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表1 不同浓度地塞米松及异丁苯丙酸对内毒素(10mg/L)诱导体外人血
TNFα释放的影响(μg/L，±s) 组别
例数
药物浓度(mol/L)
0
10-9
10-8
10-7
10-6
, http://www.100md.com 10-5
10-4
10-3
地塞米
松组
4
15.4±3.3
14.9±2.7
6.2±0.6*
3.8±0.6*
1.5±0.5*
1.8±0.6*
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2.3±0.5*
11±0.4*
t值
2.28
8.54
10.89
12.46
12.72
10.73
9.93
异丁苯
丙酸组
4
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14.7±6.2
8.5±3.0*
4.8±2.1*
4.1±2.5*
10.4±2.7
15.8±3.3
24.8±6.3*
20.7±4.9*
t值
4.29
4.32
3.79
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2.16
0.95
3.28
3.23
注：与不加药的内毒素(100mg/L)对照比较，*P<0.05表2 地塞米松及异丁苯丙酸抑制人内毒素血症体外全血
TNFα释放的时效关系(μg/L，±s) 组别
例数
内毒素刺激时间(h)
0
1
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2
3
4
6
8
12
24
内毒素对照组
4
0
0
0.74±0.47
1.49±0.88
, 百拇医药 11.87±7.33
16.22±7.90
11.48±2.79
9.65±2.17
1.29±1.07
地塞米松组
4
0
0
0.51±0.34
0.83±0.73
1.16±0.48*
, 百拇医药
1.24±0.90*
3.00±2.53*
2.01±1.58
0.68±0.49
t值
1.22
0.87
2.87
3.53
3.43
6.51
0.89
, 百拇医药 异丁苯丙酸组
4
0
0
0.24±0.16
0.53±0.37
0.82±0.48*
7.90±1.78*
5.05±1.40*
3.33±1.79*
0.79±0.41
t值
, 百拇医药
3.83
2.26
3.83
2.56
4.05
5.00
1.35
注：地塞米松和异丁苯丙酸浓度均为10-7mol/L；与内毒素(10mol/L)对照组比较，*P<0.05
三、细胞因子在大鼠肺组织中的表达及药物对其影响
观察发现，肺组织中TNFα、IL-1β、 MIP-1α的mRNA表达量均随LPS剂量增加而增加、峰值分别在2、6、12小时，LPS 5mg/kg时的表达量是生理盐水对照的3.0、1.5、6.0倍。LPS静脉注射组大鼠血浆TNFα2小时达到峰值，4小时不能测出。而腹腔注射组，血浆TNFα6小时达峰值，12小时不能测出。地塞米松(50mg/kg)、异丁苯丙酸(90mg/kg)提前1小时给药，能明显降低上述细胞因子在LPS刺激2小时时在肺组织中的mRNA表达量，与LPS对照相比，抑制率分别为TNFα70%和25%，IL-1β50%和30%，MIP-1α70%和15%。
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讨论
给大鼠腹腔注射LPS复制成急性肺损伤模型，在LPS注射后1小时，肺组织伊文思蓝含量明显增加，与LPS有剂量依赖关系，说明LPS诱导肺血管通透性明显增高。而大LPS刺激前1小时给予地塞米松或异丁苯丙酸，均明显减轻肺损伤程度，可能与阻断炎症介质的作用有关[1~3]。
我们利用体外LPS血症模型和LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型，进一步观察炎症性细胞因子在急性肺扣伤中的作用和药物作用机制。结果显示，体外培养的人全血受LPS刺激后，上清可检出TNFα基因转录、翻译均增加。地塞米松对TNFα基因表达及释放有明显抑制作用，而异丁苯丙酸表现为双向效应。异西苯丙酸可能是通过影响前列腺素(PG)E2合成，改变细胞内环磷酸腺苷(cAMP)与环磷酸鸟苷(cGMP)比例而影响TNFα表达。研究证实低浓度PGE2可引起细胞内cGMP升高，刺激TNFα基因表达；而高浓度PGE2降低cAMP，抑制TNFα表达[4]。因此，我们推测低浓度异丁苯丙酸对PGE2合成影响较小，PGE2水平较高，抑制TNFα表达；而高浓度异丁苯丙苯丙酸强烈抑PGE2合成，导致PGE2明显降低，从而刺激TNFα表达。但尚需进一步研究证实。总之，使用异丁苯丙酸应考虑到其双向作用。
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我们的结果还显示，LPS腹腔注射诱导细胞因子表达明显迟于静脉注射。LPS静脉注射后，大鼠血浆TNFα2小时达到峰值，如腹腔注射，则6小时达到峰值，同时肺组织中TNFα、IL-1β及 MIP-1αmRNA表达峰值分别在2、6和12小时。提示：(1)TNFα在肺组织中早期表达，可能在LPS诱导的急性肺损伤中有明显参与作用；(2)IL-1β和MIP-1α的基因表达可能依赖TNFα[5]；(3)MIP-1α可能在肺损伤后期有参与作用；(4)炎症细胞因子在肺局部的表达对肺损伤的发生有重要意义。
TNFα等炎症性细胞因子在急性肺损伤中的作用提示，针对细胞因子的抗介质治疗可能很有意义[1，2，6，7]。地塞米松和异丁苯丙酸对大鼠肺组织TNFα、IL-1β及 MIP-1α的基因表达均有明显抑制作用。地塞米松主要通过抑制TNFα基因翻译而抑制表达[3]，对IL-1β基因表达的抑制，主要在转录及转录后水平[7]。异丁苯丙酸可能通过PGE2途径在转录后水平抑制IL-1β表达，另外通过抑制血栓素(TX)A2。合成，改善早期肺动脉高压。由于担心异丁苯丙酸的毒性作用，未观察其大剂量的效应。地塞米松和异丁苯丙酸对MIP-1α表达也有抑制作用，但机制尚不清楚。
, 百拇医药
结果表明，TNFα、IL-1β、MIP-1α均参与LPS介导的炎症的反应。地塞米松、异丁苯丙酸对LPS诱导的大鼠鼠性肺损伤有明显防护作用，与抑TNFα、IL-1β及 MIP-1α基因在肺组织中表达有关。抗炎症性细胞因子治疗是值得重视的感染治疗手段。
参考文献
1 Shapirl L, Gelfand JA. Cytokines and sepsis: pathophysiology and therapy. New Horizons, 1993, 1:13.
2 Stephens KE, Ishizaka A, Larrick TM, et al. Tumor necrosis factor causes increased pulmonary permeability and edema: comparison to septic aciutd lung injury. Am Rev Respir Dis, 1988, 137: 364.
, http://www.100md.com
3 Kundsen PJ, Dinarello CA, Strom TB. Glucocorticoids inhibit transcriptional and post-transcriptional expression of interleukin 1 in U937 cells. J Immunol, 1987, 137: 4129.
4 Gong JH, Renz H, Sprenger H, et al. Enhancement of tumor necrosis factor: a gene expression by low dose of prostaglandin E2 and cyclic GMP. Immunobiology, 1990, 182: 44.
5 Rose CE. Role of interleukin-1 in endotoxin-induced lung injury in the rat. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, 10: 214.
, 百拇医药
6 Burchett SK, Weaver WM, Westall JA, et al. Regulation of tumor necrosis factor/cachectin and IL-1 secretion in human mononuclear phagocytes. J Immunol, 1988, 140: 3473.
7 Fahey TJ, Tracey KJ, Cerami A, et al. Macrophage inflammatory proteinl modulates macrophage function. J Immunol, 1992, 148:2764.
(收稿：1995-08-25 修回：1996-01-10), 百拇医药
单位：100730 北京，中国协和医科大学危重病医学教研室(邱海波、杜斌、陈德昌)，内科学系(潘家绮、赵永强)
关键词：炎症；内毒素；细胞因子；地塞米松；异丁苯丙酸
中华医学杂志960406
目的 了解炎症性细胞因子在内毒素诱导的器官损伤中的表达，并控计地塞米松和异丁苯丙酸的治疗作用。方法 观察人内毒血症体外全血中地塞米松、异丁苯丙酸对肿瘤坏死因子(TNF)α的蛋白及mRNA表达的量效关系；同时用酶联免疫吸附和狭缝杂交法观察内毒素诱导的大鼠肺损伤组织中，两药对TNFα、白细胞介素1(IL-1)β、吞噬细胞炎症蛋白1(MIP-1)α蛋白与mRNA表达的抑制作用。结果 内毒素刺激体外培养的人全血TNFα浓度明显增加；地塞米松(>10-8mol/L)对其具有明显抑制效应；异丁苯丙酸浓度在10-9~10-7mol/L时为刺激效应。注射内毒素后鼠肺组织中TNFα、IL-1β、MIP-1α的mRNA含量随内毒素剂量增大而增加，峰值分别在2、6、12小时。两药能明显降低肺组织中伊文斯蓝含量(t分别为2.80和7.31，P均<0.05)，对这些炎症性细胞因子的mRNA均有明显抑制作用。结论 TNFα、IL-1β、MIP-1α是内毒素介导的炎症反应中的重要介质，地塞米松、异丁苯丙酸通过抑制这些细胞因子表达，对内毒素诱导的器官损伤起防扒作用。
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The role of TNFα, IL-1β and MIP-1α in LPS-induced organ injury Qiu Haibo, Pan Jiaqi, Zhao yongqiang, et al. Department of Critical Care Medicine, Peking Union Medical College, Beijing 100730
Objectiv To investigate the role of inflammatory cytokines in endotoxemia models and to explore the possible anti-cytokine therapy of endotoxemia. Methods TNFα in plasma was measured by ELISA, and the mRNA of cytokines was assessed by slot blot analysis. Results LPS-induced TNFα release was in a dose: dependent manner in human whole bolld. Dexamethasone (≥10-8mol/L) exhibited inhibitory effect on TNFa release. Ibuprofen 10-7~10-9 mol/L had inhibitory effect on TNFa production, whereas 10-3~10-4mol/L stimulated TNFa release. The rat model of acute lung injury was made by LPS intraperitoneal injection. both dexamethasone and ibupprofen that injected at 1 hour before LPS injection could decrease the contents of EVans blue in the lung (t 2.80 and 7.31 respectively, P<0.05 vs LPS control). After LPS administered, there was a progressive up regulation in transcripts of TNFα, IL-1β and MIP-1α mRNAlevels decreased markedly when dexamethasone or ibuprofen given at 1 hour before LPS injection. Conclusion TNFα, IL-1β and MIP-1α play an essential role in the inflammatory response. LPS-induced acute lung injury may be prevented by dexamethasone and ibuprofen which have inhibitory effect on the gene expression of cytokines in the lung.
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Key words InflammationEndotoxinCytokinesDexamethasoneIbuprofen
(Natl Med J China, 1996, 76: 254-257)
目前认为，严重感染诱发的全身炎症反应及器官损害，并不主要是细菌或毒素直接作用的后果，而是由于细菌或毒素刺激机体释放过量炎症介质，形成瀑布样链锁放大反应，引起组织细胞损伤，最终导致多器官功能衰竭[1，2]。可见研究炎症介质对组织细胞的损害，并探索细胞保护性治疗措施，具有明显的临床意义。我们通过观测大鼠腹腔内注射内毒素(LPS)后，3种炎症性细胞因子，即肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素1( IL-1)β、吞噬细胞炎症蛋白质( MIP-1)α的血浆水平及其mRNA在组织中的表达，并以地塞米松、异丁苯丙酸(布洛芬)阻断其作用，探讨炎症性细胞因子在LPS诱导的器官损害中的作用及防治措施。
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材料和方法
一、材料
Wistar大鼠50只均购自本院，LPS(Ecoli0127：B8)购自Difco公司，TNFα、IL-1β、 MIP-1α的cDNA探针荷兰阿姆斯丹大学惠赠。
二、方法
1.将30只大鼠均分为6组，分别腥腔注身生理盐水、LPS0.5mg/kg、5mg/kg、12.5mg/kg、LPS12.5mg/kg加异丁苯丙酸90mg/kg、LPS12.5mg/kg加地塞米松50mg/kg，其中异丁苯丙酸和地塞米松于腹腔注射LPS前1小时静脉注射。注射LPS前1分钟，各组静脉注射1%伊文思蓝2ml/kg。注射LPS后1小时放血处死大鼠，以生理盐水灌注肺组织。取100mg肺组织，加3ml甲酰胺，置37ºC孵育24小时。测浸出液中伊文思含量，以每克干肺中伊文思蓝含量反映肺血管通透性。
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2.取健康人全血，肚素(2×104U/L)抗凝，置24孔板，1ml/孔。均在加10mg/L的LPS刺激前1小时，加入不同浓度地塞米松、异丁苯丙酸，每药浓度均重复4次，混匀后置37℃、5%CO2培养，至LPS刺激后6小时检测上清TNFα。在沉淀物中加变性液，提取细胞总RNA，以TNFα的cDNA片段为探针行狭缝杂交，经放射性自显影，激光密度扫描，对mRNA相对定量，观察TNFα释放的量效关系。另置健康人全血于24孔板，均加LPS 10mg/L，分为LPS、地塞米松、异丁苯丙酸3组，每组4例。后2组在加LPS前1小明分别加10-7mol/L地塞米松或异丁苯丙酸。于LPS刺激后0，0.5，1，2，6，12，24小时取上清测TNFα，从沉淀物提取总RNA，以狭缝杂交时mRNA相对定量，观察TNFα释放的时效关系。
3.分别给5只吕鼠腹腔注射不同剂量的LPS(0、0.5、2.0、5.0、12.5mg/kg)，2小时后处死，取肺组织提取总RNA，用TNFα, IL-1β and MIP-1α的cDNA探针，行狭缝杂交，对mRNA相对定量，观察细胞因子表达的量效关系。12只大鼠均分为3组：生理盐水组、5mg/kg LPS腹腔注射组、5mg/kg LPS静脉注射组。于LPS注射后上述时间抽血检测血浆TNFα活性。同时取腹腔注射组动物肺组织提取总RNA，行狭缝杂交，对mRNA相对定量，观察细胞因子表达的时效关系。另取3只大鼠均腹腔注射LPS 5mg/kg，其中2只在LPS注射前1小时，分别静脉注射地塞米松50mg/kg、异丁苯丙酸90mg/kg，LPS注射后2小时处死动物，取肺组织观察药物对炎症细胞因子表达的影响。
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4.TNFα检测：以酶联免疫吸附法测定健康人全血上清的TNFα浓度；以L929细胞毒杀伤率法检测大鼠血浆TNFα活性。
5.统计学分析：采用配对t检验，数据均以均值标准差(
±s)表示。结果
一、地塞米松、异丁苯丙酸对大鼠急性肺损伤的预防作用
腹腔注射LPS导致大鼠肺组织中伊文思蓝含量明显增高，LPS 12.54mg/kg组动物每克干肺组织中伊文思蓝含量为260±63μg，与生理盐水对照组(98±16μg)相比，差异有显著意义(t=5.88，P<0.05)。地塞米松和异丁苯丙酸提前1小时预防用药，则LPS(12.5mg/kg)注射会1小时每克干肺组织中伊文斯蓝含量均显著降低，分别为178±43μg和155±58μg，与LPS对照相比差异有显著意义(t值分别为2.80和7.31，P均<0.05)。
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二、药物对LPS介导TNFα生成的影响
对TNFα释放量效关系的观察发现，浓度>10-8mol/L的地塞米松明显抑LPS(10mg/l)诱导的TNFα释放。异丁苯丙酸对TNFα生成具有双向效应，10-9~10-7mol/L的异丁苯丙酸明显抑制TNFα释放，而浓度>10-4mol/L则刺激TNFα释放(表1)。对TNFα释放时效关系的观察发现，全血上清中TNFα水平随LPS浓度增加而增高，刺激6小时达峰值，维持6~12小时后下降(表2)。狭缝杂交显示，全血细胞TNFα和mRNA含量亦随LPS浓度增加而增高。将地塞米松(10-7mol/L)提前1小时给药，可明显降低上清TNFα含量，与LPS对照相比，TNFα峰值抑制90%以上(t=3.53，P<0.05，表2)。将异丁苯丙酸10-7mol/L提前1小时给药，也可明显降低上清TNFα含量，与LPS对照相比，TNFα峰值抑制51%(t=2.56，P<0.05)，但抑制作用显著低于地塞米松，差异有显著意义(t=10.73，P<0.05)。狭缝杂交显示，在10mg/L LPS刺激前1小明，加入地塞米松10-7mol/L、异丁苯丙酸10-7mol/L，均明显降低TNFαmRNA含量，与LPS对照比较分别抑制50%和40%。
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表1 不同浓度地塞米松及异丁苯丙酸对内毒素(10mg/L)诱导体外人血
TNFα释放的影响(μg/L，
±s) 组别例数
药物浓度(mol/L)
0
10-9
10-8
10-7
10-6
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10-4
10-3
地塞米
松组
4
15.4±3.3
14.9±2.7
6.2±0.6*
3.8±0.6*
1.5±0.5*
1.8±0.6*
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2.3±0.5*
11±0.4*
t值
2.28
8.54
10.89
12.46
12.72
10.73
9.93
异丁苯
丙酸组
4
, http://www.100md.com
14.7±6.2
8.5±3.0*
4.8±2.1*
4.1±2.5*
10.4±2.7
15.8±3.3
24.8±6.3*
20.7±4.9*
t值
4.29
4.32
3.79
, http://www.100md.com
2.16
0.95
3.28
3.23
注：与不加药的内毒素(100mg/L)对照比较，*P<0.05表2 地塞米松及异丁苯丙酸抑制人内毒素血症体外全血
TNFα释放的时效关系(μg/L，
±s) 组别例数
内毒素刺激时间(h)
0
1
, http://www.100md.com
2
3
4
6
8
12
24
内毒素对照组
4
0
0
0.74±0.47
1.49±0.88
, 百拇医药 11.87±7.33
16.22±7.90
11.48±2.79
9.65±2.17
1.29±1.07
地塞米松组
4
0
0
0.51±0.34
0.83±0.73
1.16±0.48*
, 百拇医药
1.24±0.90*
3.00±2.53*
2.01±1.58
0.68±0.49
t值
1.22
0.87
2.87
3.53
3.43
6.51
0.89
, 百拇医药 异丁苯丙酸组
4
0
0
0.24±0.16
0.53±0.37
0.82±0.48*
7.90±1.78*
5.05±1.40*
3.33±1.79*
0.79±0.41
t值
, 百拇医药
3.83
2.26
3.83
2.56
4.05
5.00
1.35
注：地塞米松和异丁苯丙酸浓度均为10-7mol/L；与内毒素(10mol/L)对照组比较，*P<0.05
三、细胞因子在大鼠肺组织中的表达及药物对其影响
观察发现，肺组织中TNFα、IL-1β、 MIP-1α的mRNA表达量均随LPS剂量增加而增加、峰值分别在2、6、12小时，LPS 5mg/kg时的表达量是生理盐水对照的3.0、1.5、6.0倍。LPS静脉注射组大鼠血浆TNFα2小时达到峰值，4小时不能测出。而腹腔注射组，血浆TNFα6小时达峰值，12小时不能测出。地塞米松(50mg/kg)、异丁苯丙酸(90mg/kg)提前1小时给药，能明显降低上述细胞因子在LPS刺激2小时时在肺组织中的mRNA表达量，与LPS对照相比，抑制率分别为TNFα70%和25%，IL-1β50%和30%，MIP-1α70%和15%。
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讨论
给大鼠腹腔注射LPS复制成急性肺损伤模型，在LPS注射后1小时，肺组织伊文思蓝含量明显增加，与LPS有剂量依赖关系，说明LPS诱导肺血管通透性明显增高。而大LPS刺激前1小时给予地塞米松或异丁苯丙酸，均明显减轻肺损伤程度，可能与阻断炎症介质的作用有关[1~3]。
我们利用体外LPS血症模型和LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型，进一步观察炎症性细胞因子在急性肺扣伤中的作用和药物作用机制。结果显示，体外培养的人全血受LPS刺激后，上清可检出TNFα基因转录、翻译均增加。地塞米松对TNFα基因表达及释放有明显抑制作用，而异丁苯丙酸表现为双向效应。异西苯丙酸可能是通过影响前列腺素(PG)E2合成，改变细胞内环磷酸腺苷(cAMP)与环磷酸鸟苷(cGMP)比例而影响TNFα表达。研究证实低浓度PGE2可引起细胞内cGMP升高，刺激TNFα基因表达；而高浓度PGE2降低cAMP，抑制TNFα表达[4]。因此，我们推测低浓度异丁苯丙酸对PGE2合成影响较小，PGE2水平较高，抑制TNFα表达；而高浓度异丁苯丙苯丙酸强烈抑PGE2合成，导致PGE2明显降低，从而刺激TNFα表达。但尚需进一步研究证实。总之，使用异丁苯丙酸应考虑到其双向作用。
, 百拇医药
我们的结果还显示，LPS腹腔注射诱导细胞因子表达明显迟于静脉注射。LPS静脉注射后，大鼠血浆TNFα2小时达到峰值，如腹腔注射，则6小时达到峰值，同时肺组织中TNFα、IL-1β及 MIP-1αmRNA表达峰值分别在2、6和12小时。提示：(1)TNFα在肺组织中早期表达，可能在LPS诱导的急性肺损伤中有明显参与作用；(2)IL-1β和MIP-1α的基因表达可能依赖TNFα[5]；(3)MIP-1α可能在肺损伤后期有参与作用；(4)炎症细胞因子在肺局部的表达对肺损伤的发生有重要意义。
TNFα等炎症性细胞因子在急性肺损伤中的作用提示，针对细胞因子的抗介质治疗可能很有意义[1，2，6，7]。地塞米松和异丁苯丙酸对大鼠肺组织TNFα、IL-1β及 MIP-1α的基因表达均有明显抑制作用。地塞米松主要通过抑制TNFα基因翻译而抑制表达[3]，对IL-1β基因表达的抑制，主要在转录及转录后水平[7]。异丁苯丙酸可能通过PGE2途径在转录后水平抑制IL-1β表达，另外通过抑制血栓素(TX)A2。合成，改善早期肺动脉高压。由于担心异丁苯丙酸的毒性作用，未观察其大剂量的效应。地塞米松和异丁苯丙酸对MIP-1α表达也有抑制作用，但机制尚不清楚。
, 百拇医药
结果表明，TNFα、IL-1β、MIP-1α均参与LPS介导的炎症的反应。地塞米松、异丁苯丙酸对LPS诱导的大鼠鼠性肺损伤有明显防护作用，与抑TNFα、IL-1β及 MIP-1α基因在肺组织中表达有关。抗炎症性细胞因子治疗是值得重视的感染治疗手段。
参考文献
1 Shapirl L, Gelfand JA. Cytokines and sepsis: pathophysiology and therapy. New Horizons, 1993, 1:13.
2 Stephens KE, Ishizaka A, Larrick TM, et al. Tumor necrosis factor causes increased pulmonary permeability and edema: comparison to septic aciutd lung injury. Am Rev Respir Dis, 1988, 137: 364.
, http://www.100md.com
3 Kundsen PJ, Dinarello CA, Strom TB. Glucocorticoids inhibit transcriptional and post-transcriptional expression of interleukin 1 in U937 cells. J Immunol, 1987, 137: 4129.
4 Gong JH, Renz H, Sprenger H, et al. Enhancement of tumor necrosis factor: a gene expression by low dose of prostaglandin E2 and cyclic GMP. Immunobiology, 1990, 182: 44.
5 Rose CE. Role of interleukin-1 in endotoxin-induced lung injury in the rat. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, 10: 214.
, 百拇医药
6 Burchett SK, Weaver WM, Westall JA, et al. Regulation of tumor necrosis factor/cachectin and IL-1 secretion in human mononuclear phagocytes. J Immunol, 1988, 140: 3473.
7 Fahey TJ, Tracey KJ, Cerami A, et al. Macrophage inflammatory proteinl modulates macrophage function. J Immunol, 1992, 148:2764.
(收稿：1995-08-25 修回：1996-01-10), 百拇医药