丝裂素活化蛋白激酶在高血压大鼠心肌中的表达
作者：王明屹 王泰龄 刘力生 唐朝枢 张 晶 何静雯 胡镇祥 柯元南
单位：100029 北京，中日友好医院(王明屹、王泰龄、张 晶、何静雯、胡镇祥、柯元南)；中国医学科学院心血管病研究所阜外医院(刘力生)；北京医科大学(唐朝枢)
关键词：高血压；蛋白激酶类
中华医学杂志970913 目的 研究心肌丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性及其在细胞中的表达，评价MAPK在高血压心肌重构中的作用。方法 对34和54周龄组的脑卒中型自发性高血压大鼠及正常血压大鼠进行心肌MAPK活性及其免疫组化定位研究。结果 高血压大鼠和正常大鼠的心肌重量与体重比显著增加，心肌出现肥大；心肌MAPK活性34周龄组增加了1.81倍，54周龄组增加了1.46倍。免疫组化研究显示高血压大鼠心肌内有丰富的MAPK表达，且主要分布于心肌间质细胞。结论 心肌MAPK激活可能是传递心肌肥大信息的主要通路。
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Expression of mitogen-activated protein kinase in hypertrophic myocardium in SHRsp Wang Mingyi, Wang Tailing, Liu Lisheng, et al. China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029
Objective To explore whether myocardial mitogen-activated protein kinase (MAPK) play an important role in hypertensive cardiac remodeling. Methods We compared myocardial MAPK activity by phosphocelluar method and its localization and distribution by immunohistology in hypertrophic myocardium in SHRsp at age of 34 weeks (34w group) and 54 weeks (54w group) with age matched WKY served as control. Results SHRsp was compared with WKY. The heart weight to body weight ratio was significantly increased in both groups. Myocardial MAPK activity increased 1.81 fold in the 34w group and 1.46 fold in the 54w group. MAPK expressed abundantly in hypertrophic myocardium, mainly localized in interstitial cells. Conclusion MAPK might be a major pathway of transducing hypertrophic signals.
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Key words Hypertension Protein kinases
(Natl Med J China, 1997,77:680-682)
丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)广泛存在于细胞胞浆内，是传递细胞肥大和增殖的重要信息通路[1，2]。离体研究显示在诱发心肌肌细胞肥大及心肌间质成纤维细胞增殖过程中，MAPK激活是关键[3]。Ayoagi等[4]报道高血压大鼠心肌中MAPK活性及其蛋白升高，但在心肌内该蛋 白激酶如何分布尚少见有报道。我们测定不同鼠龄高血压大鼠心肌MAPK活性及其在细胞中的表达，以说明其在心肌重构中的作用。
材料和方法
一、材料
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34周龄脑卒中型高血压大鼠(SHRsp)6只及正常血压大鼠(WKY)5只；54周龄高血压大鼠6只及正常大鼠4只(购自中国科学院心血管病研究所)。分别于34周龄及54周龄时解剖，取心脏称重后作MAPK活性测定及免疫组化染色。
二、方法
1.血压测定：用RSM型大鼠电子血压仪(上海高血压研究所)，采用尾套法测量血压。
2.心肌MAPK酶活性测定：根据滤纸测定方法改进[6]。将经液氮速冻后在-80℃冰箱冻存心肌研碎后，加1.0 ml提取液[20 mmol/L，β-磷酸甘油(pH 7.5)，20 mmol/L NaF，20 mmol/L EDTA，0.2 mmol/L Na3VO4，10 mmol/L beniamidine，25 μg/ml leupeptin，50 μg/ml PMSF，0.3(V/V)β-巯基乙醇丁]和0.5 ml裂解液[500 mmol/L Hepes(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3VO4，100 mmol/L NaF，100 mmol/L NaH2PO4，2.0 mmol/L DTT，1.0 mmol/L PMSF，100 mmol/L aprotinin，20 μmol/L leupeptin，1%(V/V) Triton X-100J]匀浆后，4℃离心(13000 rpm，10 min)后，取上清约0.5 ml粗提液。粗提液加MAPK抗体(1∶10)在4℃孵育2小时后，用裂解液充分洗脱沉淀。沉淀悬浮后加提取液150 μl及孵育液10 ml[1 mg/ml MBP，20 mmol/L hepes(pH 7.2)，10 mmol/L MgCl2，20 mmol/L MnCl2，2 mmol/L DTT，0.5 mmol/L Na3VO4，0.1 mg/ml BSA，2 mmol/L蛋白酶抑制剂，50 μmol ATP，2.0 μci γ-P32-ATP(1×106CPM)]孵育10分钟后，取80 μl点于P81 Phosphocellulose whatman滤纸，彻底冲洗后干燥，置于闪烁瓶加闪烁液静置过夜后，用液闪仪计数。蛋白用考马斯亮兰法定量。
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3.免疫组织化学：采用SP法。冰冻切片10 μm，丙酮/甲醇(7∶3，V/V)固定30分钟；3% H2O2封闭内源性过氧化物30分钟；10% BSA阻断非特异结合；MAPK抗体(1∶100，Zymed)4℃过夜；生物素化羊抗兔抗体(1∶200)孵育1小时后，用链酶卵白素(1∶150，丹麦DAKO)孵育30分钟后，DAB-H2O2显色，胞内出现棕色颗粒为阳性；用BSA代替一抗作为阴性对照。
4.统计方法：数据用
±s，组间组内用t检验。
结果
一、大鼠收缩压及心脏重/体重比较
34周龄和54周龄高血压大鼠均较对照组大鼠收缩压显著增加(P<0.001)。心脏/体重比值也较对照组显著增加(P<0.001)54周龄高血压大鼠较34周龄高血压大鼠心脏/体重比值显著增加、显示随鼠龄增加，大鼠心肌肥厚加重(附表)。
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附表 大鼠收缩压及心脏重/体重比值(±s) 组 别
收缩压(kPa)
心脏重/体重比值
34周龄
高血压组
28.0±2.6*
4.70±0.76*
对照组
19.7±1.6
3.72±0.14
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54周龄
高血压组
28.8±2.6*
6.06±0.33*△
对照组
17.3±1.3
3.80±0.40
注：1kPa=0.75mmHg，与同周龄对照比较* P<0.01，与34周龄比较△ P<0.05
二、MAPK活性
不同周龄，高血压大鼠较对照组MAPK活性显著增加，34周龄的高血压大鼠MAPK活性较对照组增加了1.81倍，54周龄组增加了1.46倍(图1)。
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图1 丝裂素活化蛋白激酶活性比较
三、MAPK免疫组化
34周龄和54周龄组对照组心肌肌细胞很少表达MAPK，仅有心脏间质细胞少量表达；34周龄和54周龄高血压大鼠心肌有丰富的MAPK表达，主要分布于心肌间质细胞(图2)。
图2 高血压大鼠MAPK免疫染色 ABC×250
讨论
MAPK是细胞内广泛存在的含有丝氨酸和苏氨酸的激酶[1，2]。与G蛋白相耦联受体和酪氨酸激酶被激活后，经一系列蛋白激酶磷酸化可激活MAPK，活化MAPK进入细胞核内可使c-Jun和c-fos等转录因子活化，结果导致细胞增殖和分化[2，6]。离体研究显示机械牵拉肌细胞，胞内MAPK活性增加，细胞蛋白合成增加；血管紧张素Ⅱ刺激肌细胞，不仅MAPK激活而且标志心肌肥大的胚胎型基因ANF，骨骼肌肌动蛋白(SKm)及β-MHC启动子激活[3]。Brown等[7]报道单独应用MEK(MAPKKK)和或ERK2(MAPK一种)共转染原代培养的SD大鼠心肌细胞，ANF增加2～5倍，同时β-MHC及SKm启动子也被激活。由此可以看出MAPK在心肌细胞肥大中的重要性。Booz等[9]报道心肌间质成纤维细胞增殖时，MAPK持续双相激活是必须的。对整体心肌MAPK活性分析较复杂，因其活性不仅代表实质细胞也代表间质细胞活性。近来，Aoyagi等[4]报道4周龄高血压大鼠较正常大鼠的心肌MAPK活性增加1.4倍，而应用心腔球囊使左心室压力增加3.3 kPa 5分钟后，高血压大鼠较正常大鼠心肌MAPK活性增加了1.7倍，同时蛋白增加了1.6倍，初步结果显示MAPK活性及蛋白水平和高血压心肌改变有关。本研究应用免疫组化方法显示出心肌MAPK蛋白分布情况，两组大鼠心肌细胞及间质细胞均有MAPK表达，但主要分布于间质细胞，而且在高血压大鼠这种变化尤为显著。心肌肌细胞在数量上仅占心肌细胞总数的1/3，而2/3的细胞是间质细胞[9]。心肌肌细胞是高度分化的细胞，仅能肥大不能增殖；而间质细胞是类多能干细胞可以增殖。由于高血压大鼠心肌MAPK活性显著增加，且心肌间质细胞有丰富的MAPK蛋白表达，所以MAPK信息通路传递的信息在高血压心肌重构时间质细胞增殖及细胞外基质蛋白沉积的过程中起重要作用。
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参考文献
1 Ahn NG, Seger R, Krebs EG. The mitogen-activated protein kinase activator. Curr. Opin. Cell Biol, 1992,4：992.
2 Blenis J. Growth-regulated signal transduction by MAP kinases and RSKs. Cancer Cells, 1991,3：445.
3 Sadoshima J, Qin Z, Morgan JP, et al. Angiotensin Ⅱ and other hypertrophic stimuli mediated by g-protein-coupled receptors activates tyrosine Kinase; Mitogen-activated protein kinase, and 90-KD, S6 kinase. In cardiac myocyte. The critical role of Ca2+—dependent signalling. Cir Res, 1995,76：1.
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4 Aoyagi T, Izamo S. Pressure-overload-induced activation of myocardial MAP kinase in vivo, augmented response in young spontaneously hypertensive rats and diminished response in aged fishcher 344 rats Circ, 1995,92(suppl I)：526.
5 李田昌，庞永政，苏静怡，等.丝素裂活化蛋白激酶活性的测定.基础医学与临床，1996，78：158.
6 Neyses L, Pelzer T. The biological cascade leading to cardiac hypertrophy; Eur Heart J, 1995,16(suppl II)：8.
7 Brown JG, Fuller ST, Bogoyervitch MA, et al. The mitogen-activated protein kinase MEK, stimulates a pattern of gene expression typical of the hypertrophic phenotype in rat ventricular cardiomyocyte. J Bio Chem, 1995,270：28092.
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8 Booz GW, Dostal DE, Singer HA, et al. Involvement of protein C and Ca2+ in angiotensin Ⅱ-induced mitogenesis of cardiac fibroblasts. Am J Physiol, 1994,267：C1308.
9 Weber KT, Dun Y, Tyagi SC, et al. Collagen. network of myocardium: Function, structural remodeling and regulatory mechanisms. J Moll Cell Cardiol, 1994,26：279.
(收稿：1996-12-17 修回：1997-05-30)
(本文编辑：李 群), 百拇医药
单位：100029 北京，中日友好医院(王明屹、王泰龄、张 晶、何静雯、胡镇祥、柯元南)；中国医学科学院心血管病研究所阜外医院(刘力生)；北京医科大学(唐朝枢)
关键词：高血压；蛋白激酶类
中华医学杂志970913 目的 研究心肌丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性及其在细胞中的表达，评价MAPK在高血压心肌重构中的作用。方法 对34和54周龄组的脑卒中型自发性高血压大鼠及正常血压大鼠进行心肌MAPK活性及其免疫组化定位研究。结果 高血压大鼠和正常大鼠的心肌重量与体重比显著增加，心肌出现肥大；心肌MAPK活性34周龄组增加了1.81倍，54周龄组增加了1.46倍。免疫组化研究显示高血压大鼠心肌内有丰富的MAPK表达，且主要分布于心肌间质细胞。结论 心肌MAPK激活可能是传递心肌肥大信息的主要通路。
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Expression of mitogen-activated protein kinase in hypertrophic myocardium in SHRsp Wang Mingyi, Wang Tailing, Liu Lisheng, et al. China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029
Objective To explore whether myocardial mitogen-activated protein kinase (MAPK) play an important role in hypertensive cardiac remodeling. Methods We compared myocardial MAPK activity by phosphocelluar method and its localization and distribution by immunohistology in hypertrophic myocardium in SHRsp at age of 34 weeks (34w group) and 54 weeks (54w group) with age matched WKY served as control. Results SHRsp was compared with WKY. The heart weight to body weight ratio was significantly increased in both groups. Myocardial MAPK activity increased 1.81 fold in the 34w group and 1.46 fold in the 54w group. MAPK expressed abundantly in hypertrophic myocardium, mainly localized in interstitial cells. Conclusion MAPK might be a major pathway of transducing hypertrophic signals.
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Key words Hypertension Protein kinases
(Natl Med J China, 1997,77:680-682)
丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)广泛存在于细胞胞浆内，是传递细胞肥大和增殖的重要信息通路[1，2]。离体研究显示在诱发心肌肌细胞肥大及心肌间质成纤维细胞增殖过程中，MAPK激活是关键[3]。Ayoagi等[4]报道高血压大鼠心肌中MAPK活性及其蛋白升高，但在心肌内该蛋 白激酶如何分布尚少见有报道。我们测定不同鼠龄高血压大鼠心肌MAPK活性及其在细胞中的表达，以说明其在心肌重构中的作用。
材料和方法
一、材料
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34周龄脑卒中型高血压大鼠(SHRsp)6只及正常血压大鼠(WKY)5只；54周龄高血压大鼠6只及正常大鼠4只(购自中国科学院心血管病研究所)。分别于34周龄及54周龄时解剖，取心脏称重后作MAPK活性测定及免疫组化染色。
二、方法
1.血压测定：用RSM型大鼠电子血压仪(上海高血压研究所)，采用尾套法测量血压。
2.心肌MAPK酶活性测定：根据滤纸测定方法改进[6]。将经液氮速冻后在-80℃冰箱冻存心肌研碎后，加1.0 ml提取液[20 mmol/L，β-磷酸甘油(pH 7.5)，20 mmol/L NaF，20 mmol/L EDTA，0.2 mmol/L Na3VO4，10 mmol/L beniamidine，25 μg/ml leupeptin，50 μg/ml PMSF，0.3(V/V)β-巯基乙醇丁]和0.5 ml裂解液[500 mmol/L Hepes(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3VO4，100 mmol/L NaF，100 mmol/L NaH2PO4，2.0 mmol/L DTT，1.0 mmol/L PMSF，100 mmol/L aprotinin，20 μmol/L leupeptin，1%(V/V) Triton X-100J]匀浆后，4℃离心(13000 rpm，10 min)后，取上清约0.5 ml粗提液。粗提液加MAPK抗体(1∶10)在4℃孵育2小时后，用裂解液充分洗脱沉淀。沉淀悬浮后加提取液150 μl及孵育液10 ml[1 mg/ml MBP，20 mmol/L hepes(pH 7.2)，10 mmol/L MgCl2，20 mmol/L MnCl2，2 mmol/L DTT，0.5 mmol/L Na3VO4，0.1 mg/ml BSA，2 mmol/L蛋白酶抑制剂，50 μmol ATP，2.0 μci γ-P32-ATP(1×106CPM)]孵育10分钟后，取80 μl点于P81 Phosphocellulose whatman滤纸，彻底冲洗后干燥，置于闪烁瓶加闪烁液静置过夜后，用液闪仪计数。蛋白用考马斯亮兰法定量。
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3.免疫组织化学：采用SP法。冰冻切片10 μm，丙酮/甲醇(7∶3，V/V)固定30分钟；3% H2O2封闭内源性过氧化物30分钟；10% BSA阻断非特异结合；MAPK抗体(1∶100，Zymed)4℃过夜；生物素化羊抗兔抗体(1∶200)孵育1小时后，用链酶卵白素(1∶150，丹麦DAKO)孵育30分钟后，DAB-H2O2显色，胞内出现棕色颗粒为阳性；用BSA代替一抗作为阴性对照。
4.统计方法：数据用
±s，组间组内用t检验。结果
一、大鼠收缩压及心脏重/体重比较
34周龄和54周龄高血压大鼠均较对照组大鼠收缩压显著增加(P<0.001)。心脏/体重比值也较对照组显著增加(P<0.001)54周龄高血压大鼠较34周龄高血压大鼠心脏/体重比值显著增加、显示随鼠龄增加，大鼠心肌肥厚加重(附表)。
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附表 大鼠收缩压及心脏重/体重比值(
±s) 组 别收缩压(kPa)
心脏重/体重比值
34周龄
高血压组
28.0±2.6*
4.70±0.76*
对照组
19.7±1.6
3.72±0.14
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54周龄
高血压组
28.8±2.6*
6.06±0.33*△
对照组
17.3±1.3
3.80±0.40
注：1kPa=0.75mmHg，与同周龄对照比较* P<0.01，与34周龄比较△ P<0.05
二、MAPK活性
不同周龄，高血压大鼠较对照组MAPK活性显著增加，34周龄的高血压大鼠MAPK活性较对照组增加了1.81倍，54周龄组增加了1.46倍(图1)。
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图1 丝裂素活化蛋白激酶活性比较
三、MAPK免疫组化
34周龄和54周龄组对照组心肌肌细胞很少表达MAPK，仅有心脏间质细胞少量表达；34周龄和54周龄高血压大鼠心肌有丰富的MAPK表达，主要分布于心肌间质细胞(图2)。
图2 高血压大鼠MAPK免疫染色 ABC×250
讨论
MAPK是细胞内广泛存在的含有丝氨酸和苏氨酸的激酶[1，2]。与G蛋白相耦联受体和酪氨酸激酶被激活后，经一系列蛋白激酶磷酸化可激活MAPK，活化MAPK进入细胞核内可使c-Jun和c-fos等转录因子活化，结果导致细胞增殖和分化[2，6]。离体研究显示机械牵拉肌细胞，胞内MAPK活性增加，细胞蛋白合成增加；血管紧张素Ⅱ刺激肌细胞，不仅MAPK激活而且标志心肌肥大的胚胎型基因ANF，骨骼肌肌动蛋白(SKm)及β-MHC启动子激活[3]。Brown等[7]报道单独应用MEK(MAPKKK)和或ERK2(MAPK一种)共转染原代培养的SD大鼠心肌细胞，ANF增加2～5倍，同时β-MHC及SKm启动子也被激活。由此可以看出MAPK在心肌细胞肥大中的重要性。Booz等[9]报道心肌间质成纤维细胞增殖时，MAPK持续双相激活是必须的。对整体心肌MAPK活性分析较复杂，因其活性不仅代表实质细胞也代表间质细胞活性。近来，Aoyagi等[4]报道4周龄高血压大鼠较正常大鼠的心肌MAPK活性增加1.4倍，而应用心腔球囊使左心室压力增加3.3 kPa 5分钟后，高血压大鼠较正常大鼠心肌MAPK活性增加了1.7倍，同时蛋白增加了1.6倍，初步结果显示MAPK活性及蛋白水平和高血压心肌改变有关。本研究应用免疫组化方法显示出心肌MAPK蛋白分布情况，两组大鼠心肌细胞及间质细胞均有MAPK表达，但主要分布于间质细胞，而且在高血压大鼠这种变化尤为显著。心肌肌细胞在数量上仅占心肌细胞总数的1/3，而2/3的细胞是间质细胞[9]。心肌肌细胞是高度分化的细胞，仅能肥大不能增殖；而间质细胞是类多能干细胞可以增殖。由于高血压大鼠心肌MAPK活性显著增加，且心肌间质细胞有丰富的MAPK蛋白表达，所以MAPK信息通路传递的信息在高血压心肌重构时间质细胞增殖及细胞外基质蛋白沉积的过程中起重要作用。
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参考文献
1 Ahn NG, Seger R, Krebs EG. The mitogen-activated protein kinase activator. Curr. Opin. Cell Biol, 1992,4：992.
2 Blenis J. Growth-regulated signal transduction by MAP kinases and RSKs. Cancer Cells, 1991,3：445.
3 Sadoshima J, Qin Z, Morgan JP, et al. Angiotensin Ⅱ and other hypertrophic stimuli mediated by g-protein-coupled receptors activates tyrosine Kinase; Mitogen-activated protein kinase, and 90-KD, S6 kinase. In cardiac myocyte. The critical role of Ca2+—dependent signalling. Cir Res, 1995,76：1.
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4 Aoyagi T, Izamo S. Pressure-overload-induced activation of myocardial MAP kinase in vivo, augmented response in young spontaneously hypertensive rats and diminished response in aged fishcher 344 rats Circ, 1995,92(suppl I)：526.
5 李田昌，庞永政，苏静怡，等.丝素裂活化蛋白激酶活性的测定.基础医学与临床，1996，78：158.
6 Neyses L, Pelzer T. The biological cascade leading to cardiac hypertrophy; Eur Heart J, 1995,16(suppl II)：8.
7 Brown JG, Fuller ST, Bogoyervitch MA, et al. The mitogen-activated protein kinase MEK, stimulates a pattern of gene expression typical of the hypertrophic phenotype in rat ventricular cardiomyocyte. J Bio Chem, 1995,270：28092.
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9 Weber KT, Dun Y, Tyagi SC, et al. Collagen. network of myocardium: Function, structural remodeling and regulatory mechanisms. J Moll Cell Cardiol, 1994,26：279.
(收稿：1996-12-17 修回：1997-05-30)
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